改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究

[目的]改进去细胞异体神经化学萃取制备方法，制备出细胞及髓鞘去除完全、神经机构保存完好的去细胞异体神经移植物。[方法]SD大鼠14只，取双侧坐骨神经（共28根），分3组进行化学萃取去细胞处理：Son．dell法组（10根）、改良法组（10根）和对照组（8根）。Sondell法组所用萃取剂为TritonX-100和脱氧胆酸钠；改良法组所用萃取剂为TritonX-200、SB-10和SB-16；对照组未进行化学处理。处理后神经行HE染色、快蓝染色、基底膜素免疫组化染色及环境扫描电镜观察，并从去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性三方面综合评价。[结果]在去细胞异体神经物理性状方面，改良法制备的去细胞异体神经韧性弹性略好于Sondell法；HE染色表明，2种方法的去细胞效果均较好，但改良法对神经结构的破坏较小；快蓝染色、基底膜素免疫组化染色、环境扫描电镜结果均表明，改良法在对髓鞘的去除、基底膜素的保留及神经结构的保存方面均优于Sondell法；综合质量评分结果表明，2种方法在去细胞效果方面相似（P1〉0．05），髓鞘去除及神经结构的保存方面改良法优于Sondell法（P2、P3〈0．05），综合去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性3方面，改良法制备的去细胞异体神经质量优于Sondell法（p4〈0．05）。[结论]综合运用萃取剂TritonX-200、SB-10和sB-16的化学萃取方法，是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法，能够制备出免疫物质清除完全、神经结构较好保存的去细胞异体神经移植物，为自体神经移植找到了较好的替代解决方法。     

软骨素酶ABC处理化学去细胞异体神经后的形态学观察

[目的]观察软骨素酶ABC处理化学去细胞异体神经后,硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)去除效果以及对活性成分层粘蛋白(Laminin)的影响.[方法]取12根新鲜猪坐骨神经,每段长60 mm,应用7%脱氧胆酸钠与7%Triton X-100制备化学去细胞异体神经后,随机分为两组.实验组(n=6):软骨素酶ABC处理组,将6根去细胞异体神经浸泡在包软骨素酶ABC(2 U/ml)的PBS(pH 7.4);对照组(n=6)为PBS液浸泡.两组处理时间均为16 h 37℃水浴.分别对两组神经行HE染色以及CSPG、Laminin免疫荧光染色观察.[结果]实验组与对照组HE纵切片均未能观察到细胞,红染的神经基底膜呈波浪状纵形排列,轴突消失而形成管柱状空隙;对照中CSPG免疫荧光染色阳性,经软骨素酶ABC处理后CSPG免疫荧光染色阴性;而实验组和对照组基底膜管成分层粘蛋白免疫荧光染色显示为阳性.[结论]经软骨素酶ABC处理的去细胞异体神经特异性降解了不利于神经生长的成分CSPG,而对去细胞神经中促神经生长成分Laminin无影响,可能是修复周围神经缺损的良好的移植物.     

化学去细胞异体神经移植促神经趋化性再生实验研究

目的化学去细胞异体神经具有与正常神经相似的物理和生化特性,是周围神经缺损修复的较好神经移植替代物。进一步探讨化学去细胞异体神经的促神经趋化性再生作用。方法健康成年SD大鼠5只,雌雄不限,体重270～300g,用于制备化学去细胞异体神经;健康成年Wistar大鼠18只,雌雄不限,体重300～320g,用于神经移植动物实验。将Wistar大鼠随机分为实验组和对照组(n=9),制备大鼠左侧坐骨神经缺损(10mm)模型,实验组以化学去细胞异体神经与神经断端吻合,对照组将自体神经近、远端翻转后吻合。神经移植后3个月,各组3只实验动物取腓肠神经行乙酰胆碱酯酶和碳酸酐酶染色观察;各组其余6只实验动物行脊髓背根神经节切除术,术后3周取腓肠神经行病理染色,病理切片行神经纤维计数,并计算错接率。结果乙酰胆碱酯酶及碳酸酐酶染色观察显示,实验组腓肠神经乙酰胆碱酯酶染色棕色颗粒较对照组少,碳酸酐酶染色黑色颗粒较对照组多。脊髓背根神经节切除定量评价:实验组神经纤维计数为4257±285,对照组为4494±310;实验组及对照组腓肠神经运动纤维错接率分别为2.27%±0.28%和7.65%±0.68%,差异有统计学意义(P0.05)。结论化学去细胞异体神经移植物不仅在桥接修复神经缺损中起到支架、支撑作用,还具有明显的促神经趋化性再生作用。     

人源性同种异体去细胞外周神经材料标准制备方法的研究

目的 对目前文献报道使用的5种不同方法制备的人源性同种异体去细胞外周神经材料进行综合分析比较其优劣,以确定可供临床使用的标准的制备流程.方法 将人源性神经按5种不同方法进行化学萃取,制备的外周神经支架材料分别行苏木精-伊红(HE)染色、免疫组化(S-100、Col I)和透射电镜、氮含量测定等检测,观察5种方法去除许旺细胞、髓鞘和轴突等抗原成分以及基底膜保存完好的情况.结果 分别萃取2次持续24 h组神经的HE染色显示去除细胞和轴突彻底,纵切片上未见任何细胞,红染的神经内膜呈波浪状纵形排列,轴突、髓鞘结构消失而形成管柱状空隙;S-100染色呈阴性;Col I染色结果可以看出其结构呈松散不规则的棕黄色结构,而其它处理组则结构相对整齐的纵向带状结构.透射电镜显示该组与各处理之间髓鞘去除差异无统计学意义.氮含量测定显示该组蛋白含量比值最低.结论 使用Triton X-100处理24 h再分别脱氧胆酸钠24 h持续萃取2次,可作为供临床使用的制备人源性去细胞同种异体神经支架材料的标准流程.     

人源性同种异体去细胞外周神经材料标准制备方法的研究

目的 对目前文献报道使用的5种不同方法制备的人源性同种异体去细胞外周神经材料进行综合分析比较其优劣,以确定可供临床使用的标准的制备流程.方法 将人源性神经按5种不同方法进行化学萃取,制备的外周神经支架材料分别行苏木精-伊红(HE)染色、免疫组化(S-100、Col I)和透射电镜、氮含量测定等检测,观察5种方法去除许旺细胞、髓鞘和轴突等抗原成分以及基底膜保存完好的情况.结果 分别萃取2次持续24 h组神经的HE染色显示去除细胞和轴突彻底,纵切片上未见任何细胞,红染的神经内膜呈波浪状纵形排列,轴突、髓鞘结构消失而形成管柱状空隙;S-100染色呈阴性;Col I染色结果可以看出其结构呈松散不规则的棕黄色结构,而其它处理组则结构相对整齐的纵向带状结构.透射电镜显示该组与各处理之间髓鞘去除差异无统计学意义.氮含量测定显示该组蛋白含量比值最低.结论 使用Triton X-100处理24 h再分别脱氧胆酸钠24 h持续萃取2次,可作为供临床使用的制备人源性去细胞同种异体神经支架材料的标准流程.     

人源性同种异体去细胞外周神经材料标准制备方法的研究

目的 对目前文献报道使用的5种不同方法制备的人源性同种异体去细胞外周神经材料进行综合分析比较其优劣,以确定可供临床使用的标准的制备流程.方法 将人源性神经按5种不同方法进行化学萃取,制备的外周神经支架材料分别行苏木精-伊红(HE)染色、免疫组化(S-100、Col I)和透射电镜、氮含量测定等检测,观察5种方法去除许旺细胞、髓鞘和轴突等抗原成分以及基底膜保存完好的情况.结果 分别萃取2次持续24 h组神经的HE染色显示去除细胞和轴突彻底,纵切片上未见任何细胞,红染的神经内膜呈波浪状纵形排列,轴突、髓鞘结构消失而形成管柱状空隙;S-100染色呈阴性;Col I染色结果可以看出其结构呈松散不规则的棕黄色结构,而其它处理组则结构相对整齐的纵向带状结构.透射电镜显示该组与各处理之间髓鞘去除差异无统计学意义.氮含量测定显示该组蛋白含量比值最低.结论 使用Triton X-100处理24 h再分别脱氧胆酸钠24 h持续萃取2次,可作为供临床使用的制备人源性去细胞同种异体神经支架材料的标准流程.     

人源性同种异体去细胞外周神经材料标准制备方法的研究

目的 对目前文献报道使用的5种不同方法制备的人源性同种异体去细胞外周神经材料进行综合分析比较其优劣,以确定可供临床使用的标准的制备流程.方法 将人源性神经按5种不同方法进行化学萃取,制备的外周神经支架材料分别行苏木精-伊红(HE)染色、免疫组化(S-100、Col I)和透射电镜、氮含量测定等检测,观察5种方法去除许旺细胞、髓鞘和轴突等抗原成分以及基底膜保存完好的情况.结果 分别萃取2次持续24 h组神经的HE染色显示去除细胞和轴突彻底,纵切片上未见任何细胞,红染的神经内膜呈波浪状纵形排列,轴突、髓鞘结构消失而形成管柱状空隙;S-100染色呈阴性;Col I染色结果可以看出其结构呈松散不规则的棕黄色结构,而其它处理组则结构相对整齐的纵向带状结构.透射电镜显示该组与各处理之间髓鞘去除差异无统计学意义.氮含量测定显示该组蛋白含量比值最低.结论 使用Triton X-100处理24 h再分别脱氧胆酸钠24 h持续萃取2次,可作为供临床使用的制备人源性去细胞同种异体神经支架材料的标准流程.     

化学萃取法制备人类同种异体神经支架的实验研究

目的发展化学萃取方法去除人类周围神经中的细胞和髓鞘，获得粗大和长段的去细胞神经支架。方法取三段长10cm，直径8mm的坐骨神经，以Triton-100和脱氧胆酸钠溶液按一定浓度和程序进行萃取，萃取神经及新鲜神经于中段取材，行HE染色、纤维素染色、砂罗铬花青染色、S-100免疫组化染色，在扫描电镜及放射电镜下观察超微结构。结果萃取两次后，去细胞神经具有良好的粘性和弹性，细胞和髓鞘被彻底清除，神经纤维支架被保留，成为一种没有细胞髓鞘及其碎片的空的基底膜管架结构。结论应用Triton-100及脱氧胆酸钠萃取两次，可去除人类长段、粗大周围神经中的细胞和髓鞘而保留神经的基底膜管和纤维支架结构。     

粗大异体神经两种化学萃取方法的比较

[目的]采用两种不同的化学法萃取粗大的异体神经,对比观察这两种方法在萃取效果方面的差别。[方法]取新鲜猪坐骨神经,每段长60mm,分别在Triton-100、脱氧胆酸钠及SB-10、SB-16、Triton-200中去细胞处理。实验分两组:Ⅰ组,Triton-100、脱氧胆酸钠去细胞2遍;Ⅱ组SB-10、SB-16、Triton-200去细胞处理2遍。另设对照组:新鲜未处理的猪坐骨神经。从去细胞程度、基底膜板层素活性、脱髓鞘程度及神经纤维管道完整性4个方面进行评价。[结果]所有实验组神经段神经纤维管道尚可,Ⅰ组较Ⅱ组去细胞完全,laminin成分保存;Ⅰ组脱髓鞘完全,Ⅱ组髓鞘成分有残留;Ⅰ组和Ⅱ组神经管道完整性比正常神经管道结构完整性差,在去细胞神经的制备过程中,应考虑基底膜的活性、去细胞、脱髓鞘及结构完整性的程度。[结论]对于粗大神经的处理,Triton-100、脱氧胆酸钠法作去细胞神经处理可能是一种较好的方法。     

人类去细胞同种异体神经移植物化学萃取方法的研究

目的：新鲜同种异体神经免疫排斥反应的标靶是细胞、髓鞘。发展新的化学处理方法,清除人类周围神经中的细胞和髓鞘 ,萃取粗大和长段的去细胞神经移植物。方法：切取年轻男性遗体捐献者的长段尺神经,以triton X-100和脱氧胆酸钠溶液按一定浓度和程序进行化学处理。萃取神经及新鲜神经行HE染色、髓鞘染色及纤维素染色,以观察细胞、髓鞘及神经基底膜;免疫组织化学染色以显示许旺细胞基底板层;行半薄切片及超薄切片透射电镜检查,观察超微结构。结果：去细胞神经的延展性及神经外膜的韧弹性良好。细胞和髓鞘被彻底清除,神经基底膜被保留;许旺细胞基底板层保留完好;去细胞神经为一种没有细胞髓鞘及其碎片的空的神经基质管。结论：Triton X-100及脱氧胆酸钠化学处理方法,可有效清除人类周围神经中的细胞及髓鞘,萃取粗大和长段的去细胞神经;该神经移植物保持了网管柱状组织结构,保留了许旺细胞基底板层及板层素。     

肩胛背神经合并胸长神经卡压的解剖学和临床研究

目的：研究肩胛背神经合并胸长神经卡压的机理及其诊断和治疗。方法：解剖20侧陈旧性成人尸体的C5神经，观察肩胛背神经和胸长神经的起点及其走行过程中与周围结构的关系。分析16例肩胛背神经合并胸长神经卡压征的诊断，治疗及效果。结果：肩胛背神经与胸长神经起始段合干者70％，两神经合干后穿入中斜角肌在C5起点处的腱性组织，6例患者痛点局封后2例效果不佳改手术治疗，12例手术治疗后随访4个月－8年，8例症状全部消失，3例疗效不佳，1例较术前加重，结论：两神经合干穿入中斜角肌在C5起点的腱性组织，是两神经同时受卡压的解剖学基础，手术治疗的疗效明显优于保守治疗。     

胚胎肢芽提取物对体外培养的背根神经节感觉神经元的作用

从大鼠胚胎肢芽中提取生物活性物质,研究其对体外培养的胚鼠背根神经节感觉神经元的作用。方法:剖腹取孕10～15天的SD大鼠胚胎,将胚胎肢芽的提取物加至胚鼠背根神经节感觉神经元的体外培养基中,同单纯培养基培养作对照。接种后,采用相差倒置显微镜、电镜、台盼蓝染色计数和乙酰胆碱脂酶(AchE)定量测定等技术观察培养细胞的生长、功能、超微结构和成活率的变化。结果:实验组细胞的成活率和轴突的长度明显优于对照组(P<0.01);AchE的含量明显多于对照组(P<0.01)。电镜下实验组线粒体、核糖体和高尔基复合体等细胞器的超微结构和功能状态也明显优于对照组。结论:胚胎肢芽提取物(ELBE)具有较强的维持神经元存活,促进轴突生长的神经营养因子(NTFs)活性。     

内脏神经-体神经端侧吻合后神经再生方式的研究

目的 通过内脏神经-体神经端侧吻合建立人工体神经-内脏神经反射弧大鼠模型25只,荧光双标追踪技术研究神经再生方式.方法 在成活的21只模型鼠左侧盆神经节(MPG)内注射0.5μl荧光金(FG),腰4前根(L_4VR)的外周神经-坐骨神经注射1μl快蓝(FB)进行逆行神经追踪.应用组织化学方法 对吻合口远端的神经根(L6VR)进行甲苯胺蓝染色.结果 逆行追踪结果显示FG单标和FG-FB双标神经元主要分布于脊髓L_4左侧前角,FB单标神经元主要分布于脊髓L_3-L_6左侧前角.脊髓腰4节段每张切片上FG单标神经元、FB单标神经元、FG-FB双标神经元数目分别为(20.8±3.3)、(5.7±1.3)、(10.3±0.7).吻合口远端(L_6VR)再生的神经经甲苯胺蓝染色后可见轴突呈深蓝色.结论 逆行追踪结果证明内脏神经.体神经端侧吻合建立人工体神经.内脏神经反射弧后,体神经可以通过侧枝发芽的方式长入并替代内脏神经.     

脊神经节血-神经屏障的超微结构特点及损伤的影响

目的　探讨脊神经节（ Ｄ Ｒ Ｇ） 血神经屏障的超微结构特点, 损伤的影响及临床意义。　方法　健康家兔４２ 只, 实验 分为手 术对照、机械 性压迫 组和炎 性损伤 组, 并 采用伊 文氏蓝 白蛋白（ Ｅ Ｂ Ａ） 和辣根过氧化酶（ Ｈ Ｒ Ｐ） 示踪剂观测。　结果　正常 Ｄ Ｒ Ｇ 不但缺乏有效的血神经屏障, 而且也缺乏有效的神经束膜弥散屏障。　结论　 Ｄ Ｒ Ｇ 不但易受血液循环环境改变的影响, 而且也易受局部环境变化的影响,这是 Ｄ Ｒ Ｇ 易受损伤的形态结构特征之一,同时也为局部用药提供可能     

Comparative study of different surgical procedures using sensory nerves or neurons for delaying atrophy of denervated skeletal muscle

To observe the effect of sensory components on muscle atrophy, 4 surgical procedures applying sensory nerves or neurons to the denervated muscle were conducted in a rat model: sensory nerve implantation (group B), sensory motor nerve crossover (group C), dorsal root ganglia implantation (group D), and implantation of preganglionically avulsed sensory nerve (group E). Rats with complete denervation served as controls (group A). The degree of muscle atrophy was evaluated after surgery by fibrillation potential amplitude, muscle wet weight, muscle fiber cross-sectional area, collagen content, and protein content. Compared with group A, the results in groups B, D, and E were superior 1 month after surgery and the results in groups B, C, and E were superior 3 months after surgery. Implantation of normal or preganglionically avulsed sensory nerve delayed atrophy. Dorsal root ganglia implantation only had a short-term trophic influence. In the animal model setting, sensory motor nerve crossover is effective only after it is maintained for at least 3 months.     

银杏酮酯对大鼠坐骨神经损伤后神经生长因子基因表达的影响

目的 观察银杏酮酯（EGb50）对大鼠坐骨神经损伤后神经生长因子（NGF）mRNA表达的影响。方法 取SD大鼠78只，其中72只切断右侧坐骨神经并缝合，随机分成损伤对照组与实验组，另6只为正常对照组。实验组给予EGb50200mg／kg／d溶于1．0ml生理盐水中灌胃，损伤对照组每天给予生理盐水1．0ml灌胃，正常对照组不作任何处理。分别于术后1、3、7、14、21及28d取吻合口远段的神经、相应节段的脊神经节及脊髓，采用逆转录-多聚酶链反应技术检测所取组织中NGFmRNA的表达水平。结果 实验组坐骨神经中NGFmRNA的表达在术后7、14和21d明显高于对照组（P〈0．05）。术后7d和14d，实验组脊神经节及脊髓中NGFmRNA的表达高于对照组（P〈0．05）。结论 大鼠坐骨神经损伤后用银杏酮酯治疗，在早期可促使坐骨神经及相应节段脊神经节和脊髓组织中的NGFmRNA的表达增加。     

1990 AcroMed Award in basic science. Cauda equina anatomy. II: Extrathecal nerve roots and dorsal root ganglia

Inconsistent data exist regarding the anatomy of the spinal nerve roots lateral to the thecal sac. A newly developed in situ technique was used to precisely define anatomic parameters on 20 fresh human cadavers. The take-off angle of the nerve roots from the thecal sac decreases from a mean of approximately 40 degrees from L1-L5 to 22 degrees at S1. The motor bundles are directly ventral to the sensory fibers within individual roots extrathecally. Dorsal root ganglia size varies with vertebral level. The majority of ganglia lie directly beneath the vertebral pedicles and one third overlie a portion of the lateral intervertebral disc. These previously undescribed relationships may aid in the understanding of lumbosacral neurocompressive disorders and are important to note during pedicle screw insertion, posterolateral decompression for spinal trauma, and paravertebral approaches for lateral disc herniations.     

Comparative observations on effects of carbon dioxide laser-induced peripheral nerve lesions in the rat

This study was conducted to determine any changes that might occur in the associated cell bodies and proximal nerve stumps of sciatic nerves cut with carbon dioxide laser radiation. These changes were then compared with the changes that occur when performed with cutting cautery and scalpel. Both the proximal stump and the related dorsal root ganglia were examined with light and electron microscopy. The sciatic nerve was severed in 10 rats with the carbon dioxide laser, a cutting cautery, or a scalpel. Subsequent histopathologic examinations revealed: (a) both myelin and axonal degeneration in scalpel cuts; (b) less degeneration of proximal stump myelin in laser cuts compared with cautery cuts; and (c) no abnormalities in the associated dorsal root ganglia of nerves cut with the carbon dioxide laser. It was concluded that both the carbon dioxide laser and cutting cautery result in less damage and degeneration than a scalpel when used to sever peripheral nerves. The difference between the laser and cautery lesions was more quantitative than qualitative in that both impart thermal energy to the nerve. The carbon dioxide laser resulted in the least amount of injury.     

Undescended testis is accompanied by calcitonin gene related peptide accumulation within the sensory nucleus of the genitofemoral nerve in trans-scrotal rats

PURPOSE: Recent data suggest that calcitonin gene related peptide (CGRP) released from the sensory branch of the genitofemoral nerve may regulate testicular descent. We studied the number of CGRP immunoreactive cells in the sensory nucleus of the genitofemoral nerve (L1 to L2 dorsal root ganglia) in cryptorchid trans-scrotal rats. Four-week-old trans-scrotal rats with unilateral undescended testis underwent bilateral genitofemoral nerve dissection and retrograde nerve labeling with the fluorescent dye 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Animals were sacrificed 48 hours later and the L1 to L2 dorsal root ganglia were removed. Serial sections were obtained and double fluorescent labeled with antibody to CGRP. Retrograde labeled and CGRP immunoreactive cells were counted using an epi-fluorescent microscope.In the 6 male trans-scrotal rats evaluated we noted a mean plus or minus standard deviation of 1,272 +/- 98 retrograde labeled dorsal root ganglion cells ipsilateral to a fully descended testicle, including 98 +/- 34 that were also CGRP immunoreactive. On the side of the undescended testis there was a mean of 1,600 +/- 304 DAPI positive cells and 160 +/- 51 CGRP immunoreactive, DAPI labeled cells. The difference was significant (p <0.02).This study shows that in trans-scrotal rats the sensory nucleus of the genitofemoral nerve contains more CGRP immunoreactive cells ipsilateral to an undescended testis than on the contralateral side, highlighting the significance of CGRP supply through the sensory branch of the genitofemoral nerve for testicular descent.     

不同数量BMSCs对大鼠背根神经节生长影响的实验研究

目的 BMSCs作为雪旺细胞的替代细胞可提高周围神经损伤修复效果,但目前对于神经支架内添加适宜的种子细胞数量未达成共识。研究不同数量BMSCs对大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)生长的影响。方法取4周龄雄性SD大鼠3只,体重80～100 g,体外培养扩增BMSCs。取新生1～2日龄SD大鼠3只,雌雄不限,体重4～6 g,制备DRG。取第3代BMSCs制备BMSCs-生物蛋白胶复合物,按照加入细胞数量的不同,将实验分为A组(1×103个)、B组(1×104个)、C组(1×105个)和D组(0个),并与SD大鼠DRG共培养。48 h后通过形态学观察,神经丝蛋白200和雪旺细胞S-100免疫荧光染色,对SD大鼠DRG轴突生长长度、雪旺细胞迁移距离和轴突面积指数进行定量评价。结果 48 h后可见各组BMSCs生长出多个长突起;雪旺细胞移行和轴突从DRG长出,呈多方向性生长;BMSCs生物蛋白胶具有生物活性且影响DRG生长。A、B、C组DRG轴突生长长度及雪旺细胞迁移距离均明显大于D组(P<0.05),C组小于B组(P<0.05),A、C组间及A、B组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B组轴突面积指数明显大于D组(P<0.05),C组大于D组但差异无统计学意义(P>0.05),A、B、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论乳鼠DRG体外培养实验,可作为研究周围神经损伤修复的体外模型。不同数量BMSCs生物蛋白胶复合物对DRG生长的影响具有量效关系,为组织工程神经选用合适数量BMSCs提供了理论依据。