卵巢功能减退患者卵泡液外泌体miRNA表达谱分析研究

目的利用高通量测序技术筛选卵巢储备功能减退(DOR)与卵巢功能正常卵泡液外泌体中差异表达的miRNAs,探讨其对DOR的发病影响。方法收集DOR患者和卵巢功能正常者(对照组)的卵泡液各15例,各组每5例卵泡液混合为均一样本提取外泌体,共进行3次生物学重复。使用Illumina HiSeq4000测序平台对DOR组和对照组卵泡液外泌体中的miRNAs进行测序分析,使用miRanda和TargetScanS软件、GO以及KEGG数据库对差异显著的miRNAs进行靶基因预测、生物学功能富集以及信号通路预测。结果与对照组相比,DOR卵泡液外泌体有80个显著差异表达的miRNAs,其中31个表达上调(包括hsa-miR-4792、hsa-let-7c-3p和hsa-miR-184等),49个表达下调(包括hsa-miR-136-3p、hsa-miR-296-3p和hsa-miR-337-5p等)(P<0.05);通过miRanda和TargetScanS的算法预测所有差异表达miRNA的靶基因共17159个,经GO和KEGG分析发现,这些靶基因主要富集的生物学功能有电离型谷氨酸受体信号通路、氨基酸转运调节、脂多糖介导信号通路及发育相关的凋亡过程等,主要参与调节的信号通路有趋化因子信号通路、环磷酸腺苷信号通路、肿瘤坏死因子信号通路及丝裂原活化蛋白激酶信号通路等。结论来源于DOR和卵巢功能正常者的卵泡液外泌体的miRNAs表达谱存在显著差异,差异表达的miRNAs可能在DOR的发生中起到重要的调控作用,这些miRNAs可能经过靶基因参与调节多种生物学功能以及信号通路进而影响DOR的病理生理过程。     

高通量测序应用于PCOS患者卵泡液外泌体lncRNA表达谱分析

目的研究多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵泡液外泌体内差异lncRNA的表达,探究差异表达lncRNA的分子功能及代谢途径和信号通路。方法收集2018年1～12月于苏北人民医院生殖中心就诊的56例不孕患者卵泡液并记录相关临床资料。其中PCOS导致的不孕患者为PCOS组(n=28),输卵管不通导致的非PCOS不孕患者为对照组(n=28)。利用超高速离心法分离卵泡液外泌体,透射电子显微镜(TEM)观察其大小和形态,纳米颗粒跟踪分析(NTA)以及Western Blot鉴定分离获得的外泌体,提取外泌体总RNA。随机选取两组各3份卵泡液外泌体RNA进行lncRNA高通量测序,鉴定差异lncRNA并进行GO富集和KEGG通路等生物信息学分析,选取6个差异基因通过RT-qPCR验证测序结果。结果两组患者的年龄、总孕酮、雌激素(E_2)、FSH、获卵数、可移植胚胎数等均无显著差异(P0.05);体重指数(BMI)、LH和窦卵泡数均存在显著差异(P0.05)。外泌体RNA测序结果显示,PCOS患者外泌体共检测到1 866个差异表达lncRNA基因,其中1 253个基因表达上调,613个基因表达下调。GO富集和KEGG通路分析表明,差异lncRNA主要富集于组织细胞成分或生物发生等生物学过程,以及卵母细胞减数分裂和胰岛素抵抗等信号通路。RT-qPCR验证差异lncRNA基因的表达结果与测序一致。结论 PCOS患者外泌体中lncRNA存在差异表达,提示lncRNA在PCOS的发病中发挥一定作用。     

生物信息学方法研究高脂饮食诱导肥胖对雄性SD大鼠的影响

目的应用生物信息学方法探寻高脂饮食诱导性肥胖雄性SD大鼠生理代谢改变及对生育力的影响。方法利用NCBI中的GEO基因芯片公共数据库进行芯片数据搜索,最终选择芯片数据(GSE8700)作为分析对象,使用bioconductor包中R工具的函数及Limma程序包识别差异性表达基因,应用DAVID数据库对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路分析,选用String在线数据库构建差异表达基因的PPI网络。结果通过对GSE8700进行分析,得到1 014个表达差异基因,其中上调基因544个,下调基因470个;上调差异基因GO条目全部富集于生物过程(BP),主要为氧化还原、轴突生成、对肽类激素反应、对糖皮质激素反应过程;下调差异基因GO富集于生物过程(BP),主要为女性怀孕、对类固醇激素的反应、甘油三酯代谢等过程;富集于细胞组成(CC),主要为细胞外间质,细胞质,血液微球等组成;富集于分子功能(MF),主要为丝氨酸肽链内切酶活性、脂肪酸结合、磷脂质结合等功能;上调差异基因并未富集到任何KEGG通路,而下调差异基因富集到3条通路,分别为PPAR信号通路(过氧化物酶体增殖物激活型受体)、脂肪的消化和吸收通路、胰腺分泌通路,其中重要的节点基因为热休克蛋白90AB1(Hsp90ab1)、细胞外钙敏感受体(Casr)及趋化因子9(Ccl9)等。结论高脂饮食诱导肥胖雄性SD大鼠脂质代谢发生了紊乱,大鼠生殖功能可能受到影响,类固醇激素、肽类激素代谢异常可能是其影响途径。     

大鼠自体移植静脉差异表达microRNA及其生物信息学分析

目的：通过分析大鼠自体移植静脉microRNA（miRNA）表达谱,探讨miRNA对移植静脉内膜增生的调控机制。 方法：将SD大鼠自体颈外静脉移植到肾下腹主动脉制作静脉移植模型,分别术后3、14 d取移植静脉,以正常SD大鼠颈外静脉为对照,提取总RNA后用高通量测序技术检测miRNA表达谱,筛选差异表达miRNA并预测其靶基因,进行靶基因的GO富集分析和KEGG富集分析。 结果：与正常静脉比较,术后14 d的移植静脉差异表达miRNA总数为265,其中表达上调的miRNA有183个,表达下调的miRNA有82个;术后14 d与术后3 d的移植静脉间比较,差异表达的miRNA总数158,其中表达上调的miRNA有94个,表达下调的miRNA有64个。miRNA靶基因GO功能分析显示,富集的基因主要参与了DNA转录过程的调节、细胞间信号转导的调控和蛋白质磷酸化过程的调节;KEGG通路分析显示,富集的信号通路主要有MAPK信号通路、cAMP信号通路、Wnt信号通路、紧密连接、cGMP-PKG信号通路。 结论：miRNA通过复杂的调控网络参与移植静脉内膜增生的生物学过程。所发现的miRNA及其调控网络可能为移植静脉内膜增生的机制研究与干预提供参考。     

胃癌枢纽基因的筛选和预后分析

目的:运用生物信息学方法探讨胃癌的预测指标和治疗靶点,并分析其与预后的关系。方法:从基因表达综合(GEO)数据库下载3个微阵列数据集(GSE13911、GSE33651、GSE79973),运用GEO2R筛选出胃癌样本与正常组织样本间的差异表达基因,通过基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析对差异基因进行功能和通路注释,同时使用STRING和Cytoscape构建蛋白互作网络(PPI),筛选出枢纽基因,结合Kaplan-Meier plotter数据库对筛选出的枢纽基因进行预后分析。结果:共筛选出135个差异表达基因,其中68个上调,67个下调。GO分析结果表明差异表达基因主要参与信号转导、钙离子结合、细胞外外泌体等生物学过程。KEGG分析显示差异基因主要富集的通路包括PI3K/Akt信号通路、ECM受体相互作用、黏着斑。经PPI分析筛选得出COL1A1、COL1A2、COL4A1、FN1、THBS1、CD44、COL2A1、COL4A2、CXCL8、COL5A1为枢纽基因,生存分析显示除THBS1的上调,其余基因的差异表达均影响胃癌患者的总体生存率。结论:所筛选的枢纽基因的异常表达可能参与胃癌的发生发展过程,与胃癌患者的预后密切相关,可以作为潜在的预测指标和治疗靶点为胃癌的进一步研究提供依据。     

PHF7在人精子中相互作用蛋白分析

目的筛选人精子中与PHF7相互作用的蛋白质并分析其作用。方法构建质粒表达GST-PHF7融合蛋白,通过GST pull-down实验串联质谱检测人精子中与PHF7特异性结合的蛋白质,进行GO富集分析和KEGG通路分析。结果利用GST-PHF7诱饵蛋白从人精子细胞总蛋白中成功钓取靶蛋白。经过质谱检测,筛选出人精子中与PHF7特异结合的蛋白75个。GO分析结果表明,这些蛋白在生物学过程上主要富集在蛋白运输和细胞内定位等;在细胞成分上主要富集在细胞器,囊泡和外泌体等;在分子功能上主要富集在结合蛋白质,核酸和酶类等。KEGG分析结果表明,这些蛋白富集在细胞代谢和遗传信息的处理等通路。结论 PHF7与精子内多种蛋白质相互作用,调节蛋白合成,运输和降解及能量代谢等可能是其调节精子发生的机制。     

骨质疏松症关键基因的筛选及生物信息学分析

目的通过生物信息学的方式筛选骨质疏松症关键基因,并进一步分析其与骨质疏松症的联系及作用机制。 方法从公共基因表达数据库下载基因表达谱数据集,通过R软件筛选差异表达基因并进行功能与通路分析。使用在线工具String构建蛋白质互作网络,导入cytoscape软件筛选关键基因并构建集簇模块。 结果共筛选出1 334个差异表达基因,其中上调基因722个,下调基因612个。GO分析显示功能主要富集在细胞外基质结构成分,信号受体激活剂活性,跨膜转运蛋白结合及细胞因子结合等方面。KEGG通路富集中显示差异基因主要参与PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Rap1信号通路以及Ras信号通路等通路。根据蛋白质互作网络筛选出AKT1、EGF、VEGFA、PROM1、TP53、NES、CD21、SNAI1、FGF13、LIF共十个关键基因,以及一个集簇模块。 结论筛选并分析了关键基因与集簇模块的功能、作用及其与骨质疏松可能存在的联系,为揭示骨质疏松症潜在的的分子机制和药物靶点提供新的思路。     

间充质干细胞外泌体通过TGF-β信号通路抑制成骨分化

目的 探究间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）来源外泌体对MSC成骨分化的影响及其可能的机制。方法 超速离心获得未被地塞米松干预和用地塞米松（10 μmol/L）干预的MSC外泌体：Exo-1和Exo-2。将MSC分为3组：对照组、Exo-1组和Exo-2组,成骨诱导分化培养7 d。生化检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性。流式检测细胞凋亡率。qRT-PCR检测炎症因子及TGF-β信号通路相关基因表达。Western blot检测TGF-β信号通路相关蛋白表达。结果 用地塞米松干预的MSC来源外泌体能够降低MSC细胞中ALP活性,细胞凋亡率升高,下调NF-κB mRNA表达、Smad3和RUNX2 mRNA和蛋白表达（P＜0.05）,上调IL-1β和TNF-α mRNA表达、TGF-β mRNA和蛋白表达（P＜0.05）。结论 用地塞米松（10 μmol/L）干预的MSC来源外泌体能通过TGF-β信号通路抑制MSC成骨分化,促进细胞凋亡和炎症反应。     

基因芯片分析孤儿核受体NURR1上调表达对前列腺癌LNCaP细胞基因表达谱的影响

目的探讨孤儿核受体NURR1表达上调对前列腺癌细胞基因表达谱的影响。 方法构建NURR1过表达载体,通过慢病毒感染方式上调前列腺癌LNCaP细胞中NURR1的表达水平。通过免疫细胞化学染色检测NURR1蛋白的表达,通过基因表达谱芯片分析NURR1过表达组和对照组LNCaP细胞的mRNA、lncRNA表达水平的变化。通过KEEG和GO分析探讨NURR1过表达对相关信号通路和功能的影响。 结果NURR1基因在LNCaP细胞过表达,与对照组比较共有515个基因发生差异表达,其中上调的mRNA238个,下调的mRNA195个;上调的lncRNA54个,下调的lncRNA28个。差异表达的mRNA和lncRNA主要在于细胞分子功能的改变,其中视网膜结合功能、铁离子结合能力、神经轴突调控以及氧化还原过程、细胞外区域的细胞学组成改变最为显著。细胞因子与细胞因子受体的相互作用以及调节干细胞多能性的有关信号通路都发生显著性改变。 结论NURR1基因的上调表达对前列腺癌细胞mRNA以及lncRNA表达谱显著改变,可能与其促进前列腺癌进展的功能有关。     

甲状腺癌非编码RNA与mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控网络分析

目的:通过生物信息学方法分析甲状腺癌预后相关的非编码RNA与mRNA及信号通路。方法:从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中下载568例甲状腺癌患者的临床信息及其组织样本的非编码RNA(lncRNA、miRNA)与mRNA数据,筛选出差异表达的非编码RNA与mRNA,对差异表达的mRNA进行功能富集分析与通路分析;构建lncRNA-miRNA-mRNA的竞争性内源RNA(ceRNA)调控网络;结合临床信息进行生存分析获取与甲状腺癌预后相关的非编码RNA与mRNA。结果:共筛选出差异表达的lncRNA 497个(上调93个,下调404个),miRNA 72个(上调5个,下调67个),mRNA 1 097个(上调233个,下调864个)。功能富集分析结果显示差异表达的mRNA主要参与单组织过程、单组织细胞过程、刺激反应等生物学过程,受体结合、分子功能调节、钙离子调节等细胞功能以及细胞、细胞膜、细胞外组件等细胞构成过程。通路分析结果显示差异表达的mRNA主要参与神经反应受体-配体相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤转录失调等信号通路的调节。构建的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA互作网络中,有2个差异表达lncRNA(MIR181A2HG、OPCML-IT1),1个差异表达miRNA(miRNA-184)和2个差异表达mRNA(E2F1、SALL3)与甲状腺癌的总体生存期明显有关(均P0.05)。结论:所筛选的非编码RNA与mRNA以及相关信号通路在甲状腺癌的预后密切相关,并为甲状腺癌发生、发展机制的研究提供了新的方向。     

Different expression levels of exosomal miR-503 in peritoneal dialysis effluent from patients of different peritoneal transport characteristics and bioinformatics analysis

Objective To compare the expression level of exosomal miR-503 in peritoneal dialysis effluent (PDE) from patients of different peritoneal transport characteristics, predict the target genes of miR-503 and provide bioinformatic data for researches of peritoneal transport characteristics. Methods Twenty-four stable peritoneal dialysis (PD) patients were selected and divided into high transport group (H group, n=12) and low transport group (L group, n=12) according to the results of peritoneal equilibration tests (PET). The 500 ml PDE that was left on the patient's abdomen overnight was collected and concentrated using ultrafiltration cell. Exosomes in PDE were resuspended in phosphate buffered saline (PBS) after ultracentrifugation and the characteristics of PDE exosomes were identified by transmission electron microscope (TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA), Western blotting and fluorescent staining. MicroRNAs were extracted from PDE exosomes. The expression levels of PDE exosomal miR-503 in the two groups were detected by quantitative real-time PCR. Then the relations between the relative quantity of PDE exosomal miR-503 and PET values or 24 h ultrafiltration volume (UF) were analyzed. Targetscan and miRDB databases were used to predict the target genes of miR-503. Gene ontology (GO) functional enrichment and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) signaling pathway analysis were relied on DAVID (https://david.ncifcrf.gov/). Results The exosomes in PDE showed a round and cup-shaped morphology under TEM, and the diameters were approximately 100 nm measured by NTA. The specific biomarkers of exosomes, CD63, CD81 and heat shock protein -70 (HSP-70) were all detected by Western blotting. The internalization and uptake of the exosomes was observed after fluorescent staining. The relative expression level of PDE exosomal miR-503 in H group was found to be significantly higher than that in L group (P=0.002), and the relative quantity of PDE exosomal miR-503 was significantly positively correlated with PET values (r=0.547, P=0.006), but not 24 h UF (r=-0.297, P=0.159). There were 156 target genes of miR-503 in total that could be predicted by two different databases at the same time. GO analysis of these 156 target genes was mainly focused on kinase binding, regulation of protein modification and catabolic process as well as regulation of epithelial cell proliferation. KEGG enriched many tumor associated or classical signaling pathways, including transforming growth factor-β (TGF-β) signaling pathway and vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway. The prediction showed that vascular endothelial growth factor A (VEGFA) was a direct target gene of miR-503 and it was also related to many proteins involved in fibrosis mechanism. Conclusions The expression level of PDE exosomal miR-503 is significantly higher in H group, and positively correlates with PET values, which may regulate the angiogenesis of peritoneal vessels by targeting VEGFA.     

基于GEO数据库的IgA肾病基因的筛选和生物信息学分析

目的通过生物信息学分析鉴定IgA肾病的生物标志物,旨在阐明IgA肾病疾病进展的可能分子机制。方法从GEO数据库下载包含IgA肾病患者和健康对照的微阵列数据集GSE104948、GSE93798和GSE37460数据集,并使用limma R包进行分析,以获得差异表达基因。然后进行GO分析和KEGG通路富集分析,运用STRING和Cytoscape软件构建蛋白互作网络以阐明IgA肾病的分子机制。结果应用limma R包分析鉴定出30个DEG,包括16个上调基因,14个下调基因。FN1和COL1A2等上调基因主要参与细胞外基质受体互作及PI3K-Akt信号通路。IgA肾病中ALB基因显著下调。FN1,COL1A2,ALB和FABP1基因被筛选为枢纽基因。结论FN1、COL1A2、ALB和FABP基因可能在IgA肾病的发展中起重要作用,并可能作为诊断和治疗IgA肾病的潜在分子靶标。     

乙肝相关性肝细胞癌患者血清外泌体miR-1290 水平的变化及其诊断价值

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌(HCC)患者血清外泌体miR-1290水平的变化及其诊断价值。方法:收集31例HBV相关HCC患者,20例HBV携带患者,20例乙型肝炎肝硬化患者以及19例健康体检者的血液样本,分离纯化血清外泌体并鉴定,用RT-PCR检测外泌体miR-1290水平。利用ROC曲线评价外泌体miR-1290对HBV相关HCC的诊断效能。结果:纯化提取的样品中含有大量外泌体颗粒,并且具备外泌体的典型特性。与健康个体比较,外泌体miR-1290水平在HBV携带患者中未见明显差异(P0.05)在HBV相关HCC患者中明显升高(P0.001),且晚期HCC患者高于早期HCC患者(P=0.036),而在乙型肝炎肝硬化患者中明显降低(P=0.006)。外泌体miR-1290的ROC曲线的曲线下面积(AUC)为0.82(95%CI=0.73～0.91),具有较好的特异性(88.1%),且其诊断效能优于AFP(AUC=0.792)。结论:血清外泌体miR-1290在HBV相关HCC患者中升高,对HBV相关HCC具有较好的诊断效能,并有望成为诊断HBV相关HCC的血清学标志物。     

Circulating exosomal miR‐92b: Its role for cancer immunoediting and clinical value for prediction of posttransplant hepatocellular carcinoma recurrence

A recurrence of hepatocellular carcinoma (HCC) after living donor liver transplantation (LDLT) is one of the major concerns reflecting the higher mortality of HCC. This study aimed to explore the impact of circulating exosomes on HCC development and recurrence. One‐shot transfusion of hepatoma serum to naïve rats induced liver cancer development with gradual elevation of alpha‐fetoprotein (AFP), but exosome‐free hepatoma serum failed to induce AFP elevation. The microarray analysis revealed miR‐92b as one of the highly expressing microribonucleic acids in hepatoma serum exosomes. Overexpression of miR‐92b enhanced the migration ability of liver cancer cell lines with active release of exosomal miR‐92b. The hepatoma‐derived exosomal miR‐92b transferred to natural killer (NK) cells, resulting in the downregulation of CD69 and NK cell‐mediated cytotoxicity. Furthermore, higher expression of miR‐92b in serum exosomes was confirmed in HCC patients before LDLT, and its value at 1 month after LDLT was maintained at a higher level in the patients with posttransplant HCC recurrence. In summary, we demonstrated the impact of circulating exosomes on liver cancer development, partly through the suppression of CD69 on NK cells by hepatoma‐derived exosomal miR‐92b. The value of circulating exosomal miR‐92b may predict the risk of posttransplant HCC recurrence.     

基于数据挖掘的肝细胞癌肿瘤突变负荷相关性分析

目的研究肿瘤突变负荷(TMB)与肝细胞癌患者预后的相关性,以及TMB对肝细胞癌基因差异表达和肿瘤组织内浸润性免疫细胞占比的影响。方法从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中获取肝细胞癌患者的体细胞变异数据、基因转录表达数据和临床信息。采用R程序语言(3.6.1版本)maftools函数包分析样本的基因突变数据特征。利用VarScan2平台的肝细胞癌患者全外显子测序数据计算每个样本的TMB值,按TMB值大小排序,取中位值将全部样本分为高TMB组和低TMB组。采用Kaplan-Meier法绘制两组患者生存曲线并进行log-rank检验判断肿瘤突变负荷与预后的相关性。采用R语言Limma函数包筛选两组之间的差异表达基因(FDR=0.05并logFC=1),并采用R语言clusterProfiler函数包对差异基因进行基因本体论(GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析(筛选标准均为P<0.05)。然后采用CIBERSORT I具对比分析两组之间浸润性免疫细胞的占比差异。结果从TCGA数据库中共获取了364例肝细胞癌患者的体细胞变异数据、基因转录表达数据和临床信息。其中327例(84%)样本存在突变.OBSCN与FLG的突变有协同相关性(P<0.05),而CTNNB1与AXIN1的突变相斥(P<0.05)o共363例患者纳入到TMB单因素生存分析中,按TMB值大小排序,按中位值2.9474将全部样本分为高TMB组(182例)和低TMB组(181例),TMB对肝细胞癌患者的预后没有明显影响(P>0.05)。高TMB组和低TMB组之间共筛选出差异表达基因198个(上调基因28个,下调基因170个)。GO富集分析中发现差异基因主要富集在细胞外基质组织、细胞外结构组织、细胞外基质、含胶原细胞外基质、细胞外基质结构成分等功能。KEGG富集分析中,差异基因在细胞外基质受体相互作用通路和黏着斑通路上高度富集。两组之间浸润性免疫细胞的占比差异分析,CD4^+记忆性T细胞在低TMB组中浸润程度更高(P<0.05);单核细胞则是高TMB组中浸润程度更高(P<0.05)o结论TMB和肝细胞癌患者预后没有相关性,TMB对肝细胞癌基因差异表达和肿瘤组织内浸润性免疫细胞占比有明显的影响。