炎症微环境下芦丁对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究芦丁（rutin）对炎症微环境下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 采用有限稀释法分离纯化获得牙周膜干细胞,采用流式细胞术鉴定牙周膜干细胞。以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激牙周膜干细胞,建立体外炎症模型。实验分为4组,第1组使用α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第2组使用含有脂多糖的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第3组在含有脂多糖的α-MEM培养基加入芦丁培养牙周膜干细胞,第4组使用含有芦丁的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞。通过碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测试、茜素红染色、RT-PCR以及蛋白免疫印迹等方法检测成骨分化能力的改变。采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析。结果 CCK-8和碱性磷酸酶活性测试结果显示,10 μmol/L芦丁对炎症状态下牙周干细胞增殖和成骨分化作用最明显。碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果显示,10 μmol/L芦丁可以改善炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。RT-PCR、蛋白免疫印迹结果显示,芦丁可以增强炎症状态下COL1、ALP、RUNX2等成骨基因和成骨蛋白的表达。结论 芦丁可以增强炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

低氧对牙周膜成纤维细胞增殖和成骨分化的影响

目的:观察低氧对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)增殖与成骨分化的影响。方法:体外培养鉴定人牙周膜成纤维细胞,分别用浓度为0、100、200、400 μmol/L的CoCl2作用于细胞,采用MTT法观察CoCl2对PDLCs增殖的影响,运用实时定量PCR和Western免疫印迹技术检测CoCl2模拟低氧对PDLCs成骨分化的影响。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:免疫组化染色结果证实,培养细胞为牙周膜成纤维细胞。200 μmol/L及400 μmol/L的CoCl2均能抑制PDLCs的增殖及碱性磷酸酶、RUNX2、Ⅰ型胶原的表达,并呈剂量依赖性。结论:氯化钴模拟的低氧环境对PDLCs增殖及成骨分化具有抑制作用。     

低强度牵张应力对异丙肾上腺素诱导下牙周膜成纤维细胞炎症反应的影响

目的: 探讨低强度牵张力对异丙肾上腺素（isoproterenol,ISO）诱导下人牙周膜成纤维细胞炎症反应的影响及其分子机制。方法: 体外培养人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligaments cells,PDLCs）,给予一定浓度(0.01、0.1、1 μmol/L)ISO刺激24 h,设置空白对照组,同时施加不同强度（5%、10%、15%形变量）的牵张力,利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测细胞内IL-1β、IL-6 mRNA的表达。设置空白対照组、ISO刺激组（0.1μmol/L）、低强度牵张力组（5%形变量）和ISO+低强度牵张力组,利用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测内质网应激相关p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4蛋白表达量的变化。应用细胞转染技术敲低PDLCs中PERK基因的表达,RT-qPCR检测低表达PERK的牙周膜成纤维细胞在ISO及5%形变量牵张力作用下IL-1β及IL-6 mRNA的表达。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果: ISO诱导可显著上调牙周膜成纤维细胞中IL-1β及IL-6 mRNA的表达（P<0.05）;与对照组相比,5%形变量牵张力抑制ISO诱导下PDLCs中IL-1β和IL-6 mRNA的表达,差异有统计学意义（P<0.05）;Western印迹结果显示,5%形变量牵张力可抑制ISO诱导引起的PERK、eIF2α磷酸化及ATF4的表达（P<0.05）。与阴性对照组相比,ISO诱导下PERK沉默的PDLCs中IL-1β及IL-6 mRNA表达显著降低（P<0.05）。结论: 5%形变量牵张力可能通过内质网应激PERK通路抑制ISO诱导下牙周膜成纤维细胞的炎症反应。     

SDF-1α/CXCR4信号轴介导柚皮素对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的: 探讨柚皮素对骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的影响,SDF-1α/CXCR4信号轴是否参与介导柚皮素促进BMSCs成骨分化。方法: 分离、培养及鉴定大鼠BMSCs,CCK8法检测不同浓度柚皮素对BMSCs增殖的影响,检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性;RT-qPCR法检测各组ALP、骨钙素（osteocalcin,OCN）、趋化因子受体4（CXCL receptor 4,CXCR4）和基质细胞衍生因子1α（stromal cell derived factor-1,SDF-1α）的表达,ELISA法检测各组CXCR4和SDF-1α蛋白的表达。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 细胞鉴定结果表明,培养细胞为高纯度的BMSCs。第1、3天,柚皮素对BMSCs增殖无显著影响（P>0.05）;第5天时,50 μg/mL柚皮素可促进BMSCs增殖;第7天时,不同浓度柚皮素均促进BMSCs增殖（P<0.05）;同时,ALP活性随时间推移逐渐增强。RT-qPCR结果表明,柚皮素组和成骨诱导液组中相关基因表达均较培养基组明显增加,而AMD3100组中各基因表达均受到显著抑制（P<0.05）。ELISA检测结果显示,各组CXCR4和SDF-1α蛋白表达随诱导时间增加均逐渐上调,且两者均在100 μg/mL柚皮素组表达最高。结论: 柚皮素可促进BMSCs增殖和成骨向分化,SDF-1α/CXCR4信号轴参与柚皮素对BMSCs的成骨分化,主要在BMSCs成骨分化早期阶段。     

小分子鹰嘴豆芽素A对人牙髓干细胞成骨分化的影响

目的 探讨不同浓度鹰嘴豆芽素A（biochanin A,BCA）对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）成骨分化的影响及相关分子机制。方法 通过组织块法分离培养原代人牙髓干细胞,流式细胞术鉴定其细胞表型。通过CCK-8法检测不同浓度BCA对hDPSCs增殖活性的影响,通过q-PCR、碱性磷酸酶染色、茜素红染色等分析0、1、5、10、20、30 μmol/L BCA对hDPSCs成骨分化的作用,通过蛋白免疫印迹研究BCA对hDPSCs成骨分化过程中MAPK信号通路的影响。采用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学分析。结果 实验获取的hDPSCs经流式细胞术鉴定,符合间充质干细胞特征。CCK-8结果显示,25 μmol/L以下浓度的BCA对hDPSCs增殖无影响,30 μmol/L以上抑制hDPSCs增殖。q-PCR结果显示,10 μmol/L BCA显著提升hDPSCs成骨分化过程中标志基因ALP、COL-1、OPN、OCN的表达水平;碱性磷酸酶及茜素红染色显示,10 μmol/L BCA组比对照组及其他浓度组染色明显增强;蛋白免疫印迹实验显示,BCA激活P38/MAPK信号通路,但对ERK及JNK无明显激活作用。结论 组织块法可获取纯度较高的hDPSCs,BCA可能通过激活P38/MAPK信号通路,从而促进hDPSCs成骨向分化。     

高浓度唑来膦酸对人成骨细胞成骨分化及凋亡影响的实验研究

目的研究高浓度唑来膦酸对体外分离的健康人下颌骨成骨细胞的影响。方法体外分离培养来源于健康人下颌骨的成骨细胞,取P3代成骨细胞,用1 μmol/L、5 μmol/L唑来膦酸分别处理,不加药组为空白对照。以CCK8检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,ALP染色及定量分析检测细胞成骨分化,荧光定量PCR检测成骨相关基因ALP、OPN和Runx2的表达,Western免疫印迹检测OPN蛋白的表达。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果唑来膦酸处理后的成骨细胞增殖减慢,5 μmol/L处理组较1 μmol/L组增殖更慢。药物处理后的细胞凋亡较对照组增加,且随着药物浓度的增加,凋亡百分比显著上升。1 μmol/L及5 μmol/L唑来膦酸处理后的成骨细胞的成骨分化能力较对照组显著下降。荧光定量PCR结果提示,药物处理后的成骨相关基因ALP、OPN和Runx2的表达显著降低。Western免疫印迹检测结果显示药物处理组OPN蛋白表达量显著下降。结论高浓度唑来膦酸抑制来源于人下颌骨成骨细胞的增殖及成骨分化,促进其凋亡发生。     

姜黄素对环孢素A诱导激活的大鼠牙龈成纤维细胞TGF-β1/Smad3通路的抑制作用

目的：体外实验研究姜黄素（curcumin,Cur）对环孢素A（cyclosporine A,CsA）作用大鼠牙龈成纤维细胞TGF-β1/Smad3通路的影响,为进一步探讨Cur抑制CsA所致药物性牙龈增生的发生机制提供理论依据。方法：使用CCK-8法观察0、5、10、20、30 μmol/L Cur对大鼠牙龈成纤维细胞增殖的影响, 20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA共同作用对大鼠牙龈成纤维细胞增殖的影响。实时荧光定量PCR检测20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA共同作用下,牙龈成纤维细胞中转化生长因子TGF-β1、Smad3、平滑肌肌动蛋白α-SMA和I型胶原蛋白COL-I的mRNA表达变化;蛋白免疫印迹实验检测TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA和COL-I的蛋白表达变化。细胞划痕实验观察20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA 对牙龈成纤维细胞迁移能力的影响。采用SPSS 23.0 软件包对数据进行统计学分析。结果：大鼠牙龈成纤维细胞在20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA共同作用下,细胞增殖和迁移能力明显降低;20 μmol/L Cur显著下调了牙龈成纤维细胞中TGF-β1、α-SMA 和COL-I的mRNA 表达,蛋白免疫印迹实验提示,TGF-β1、p-Smad3、α-SMA 和COL-I的表达同样显著下调。结论：Cur可能通过抑制CsA激活的牙龈成纤维细胞TGF-β1/Smad3 信号通路,从而降低牙龈成纤维细胞增殖、迁移、平滑肌肌动蛋白和胶原分泌,改善牙龈增生。     

不同浓度黄芩苷对人根尖乳头干细胞成骨分化的影响

目的 探讨不同浓度黄芩苷对人根尖乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAPs）成骨分化的影响。方法 选取具备稳定传代能力的第3代SCAPs,采用Live/Dead细胞荧光染色,检测细胞在0、10、20、50、100 μmol/L不同黄芩苷浓度干预培养24 h后的存活情况及细胞活力;然后将SCAPs分为普通培养基组（DMEM）和成骨诱导培养基组（ODM）,根据黄芩苷的不同浓度,将实验组分为5个实验亚组,依次为0、10、20、50、100 μmol/L,利用碱性磷酸酶（ALP）染色法和ALP定量检测法,研究不同浓度黄芩苷对SCAPs培养7、14 d早期成骨分化的影响。应用茜素红染色法,定量检测不同浓度黄芩苷对SCAPs培养21 d后成骨矿化的影响。利用MTT法,检测不同浓度黄芩苷对SCAPs生长的影响。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果 活/死细胞荧光染色结果表明,经不同浓度药物干预处理后,细胞活力旺盛,无明显异常;但黄芩苷药物浓度高于50 μmol/L时,细胞死亡数目有上升趋势。ALP定量检测结果显示,ODM组诱导分化第14天时,20 μmol/L浓度组的ALP活性显著高于对照组（P<0.05）,100 μmol/L浓度组的ALP活性显著低于对照组（P<0.05）。DMEM组培养14 d后,20 μmol/L浓度组的ALP活性显著高于对照组（P<0.05）。茜素红定量显示,ODM组中100 μmol/L实验组的A值显著低于对照组（P<0.05）;20 μmol/L的黄芩苷浓度组是促进SCAP生长的最适浓度。结论 高于50 μmol/L浓度的黄芩苷对SCAPs的成骨分化表现出明显抑制作用,而低浓度黄芩苷,尤其是20 μmol/L的黄芩苷对SCAPs成骨分化及细胞生长有促进作用。     

Emdogain对共培养成骨样细胞及内皮细胞成骨及成血管基因表达的影响

目的 评价emdogain对直接与间接共培养条件下成骨样细胞和内皮细胞成骨及成血管基因表达的影响以及其间的相关性。方法 将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和成骨样细胞（MG63）按2∶1比例于12孔板内进行直接及间接共培养,并使用不同浓度（0、0.1、1、10、50 μg/mL）的emdogain共培养细胞72 h。采用细胞计数仪结合流式细胞仪评价细胞增殖情况,并通过荧光激活流式细胞分选技术分选共培养细胞。对分选后的成骨样细胞及内皮细胞采用实时荧光定量PCR分别检测成骨相关基因碱性磷酸酶（ALP）、I型胶原蛋白（Col-1）及成血管相关基因血管内皮细胞生长因子（VEGF）、VEGF酪氨酸激酶受体1（Flt-1）、VEGF酪氨酸激酶受体2（KDR）、von Willebrand因子（vWF）、内皮细胞C蛋白受体（EPCR）、E选择素（E-Selectin）、促血管生成素2（Ang-2）的表达水平。采用SPSS24.0软件包对数据进行统计学处理。结果 在直接与间接共培养条件下,Emdogain对MG63及HUVEC细胞增殖的作用具有浓度依赖性。随着emdogain浓度增加,细胞增殖率逐渐下降。50 μg/mL浓度的emdogain对MG63及HUVEC细胞增殖抑制作用最为明显。随着emdogain浓度增加,MG63表面ALP和Col-1表达水平逐渐增加;50 μg/mL浓度条件下,表达水平最高且与其他组基因表达水平差异显著（P<0.01）。同一emdogain浓度条件下,直接共培养MG63表面ALP及Col-1表达水平均显著高于间接共培养（P<0.01）。除10 μg/mL组外,直接共培养条件下,VEGF表达水平均显著高于间接共培养（P<0.01）。50 μg/mL组直接共培养的HUVEC表面Flt-1、KDR、vWF、E-selectin基因表达水平显著高于间接共培养及直接共培养的其他各组（P<0.01）。间接共培养条件下,HUVEC表面EPCR及Ang-2基因表达水平显著高于直接共培养（P<0.05）。结论 Emdogain对共培养MG63和HUVEC增殖的作用具有浓度依赖性,50 μg/mL可能是emdogain作用的关键浓度。在直接共培养条件下,50 μg/mL emdogain抑制MG63及HUVEC细胞增殖,但能同时促进MG63及HUVEC细胞相关基因表达;且该条件下emdogain的作用显著强于其他实验条件,细胞间直接交联可能在其中发挥重要作用。     

柚皮素通过基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4信号轴对脂多糖作用下人牙周膜干细胞抗炎、成血管和成骨分化能力的影响

目的 探究柚皮素（Nar）对脂多糖（LPS）刺激下的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）抗炎、成血管和成骨能力的影响及其机制。方法 采用细胞计数试剂盒（CCK-8）、划痕试验和Transwell实验研究hPDLSCs的增殖和迁移能力。采用碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色、管腔形成实验、酶联免疫吸附实验（ELISA）、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白印迹实验（Western blot）检测hPDLSCs抗炎、成血管和成骨分化能力。结果 10μmol/L Nar可减轻10μg/mL LPS刺激的hPDLSCs炎症反应，促进其增殖、迁移和成血管分化，0.1μmol/L Nar可有效恢复10μg/mL LPS刺激的hPDLSCs成骨能力。加入CXCR4抑制剂AMD3100后，Nar促进抗炎和成骨分化的作用降低，炎性hPDLSCs成血管分化升高。结论 Nar促进了hPDLSCs抗炎、成血管和成骨分化，该作用与基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4信号轴有关。     

牡荆素对脂多糖诱导牙髓干细胞表达炎症因子的影响

目的：探讨牡荆素（vitexin,VTX）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的人牙髓干细胞（human dental stem pulp cells,hDPSCs）表达炎症因子的影响,并初步探讨其相关作用机制。方法：分离、培养hDPSCs,以CCK-8法检测VTX对hDPSCs增殖的影响,检测VTX毒性浓度范围。铺种hDPSCs,分为4组,空白组以不含LPS和VTX的无血清DMEM,LPS组仅加入含LPS终浓度为2 μg/mL的无血清DMEM培养,VTX处理组1(V1组)加入2 μg/mL LPS+25 μmol/L VTX,VTX处理组2(V2组)加入2 μg/mL LPS + 50 μmol/L VTX。培养48 h,实时荧光定量PCR检测各组细胞中IL-1β、IL-6及IL-8基因转录,蛋白质免疫印迹检测hDPSCs内MPAK信号通路及COX-2等蛋白的变化。采用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学分析。结果：VTX在200 μmol/L范围内时细胞活力不受影响(P>0.05);VTX抑制LPS刺激hDPSCs转录IL-1β、IL-6及IL-8,抑制效果与VTX的浓度呈正相关;VTX可显著抑制LPS激活p38及ERK信号通路。结论：VTX可能通过抑制p38及ERK信号通路的激活,降低LPS诱导的hDPSCs转录IL-1β、IL-6及IL-8。     

重组人釉原蛋白及猪釉基质蛋白对人骨髓基质细胞成骨作用的比较

目的比较全长重组人釉原蛋白（recombinant human amelogenin, rhAm）和猪釉基质蛋白（enamel matrix proteins,EMPs）体外诱导人骨髓基质细胞（human bone marrow stromal cells,hBMSCs）成骨分化的作用,探讨rhAm促进hBMSCs成骨的调控机制,为rhAm临床应用提供理论依据。方法经诱导表达并纯化得到25 kDa全长rhAm;利用乙酸法提纯猪EMPs,体外原代培养hBMSCs。采用实时定量PCR及Western印迹法检测不同时间点rhAm和EMPs作用hBMSCs后成骨因子（Runx2、ALP、COL-I）的变化,观察时效关系。采用碱性磷酸酶和茜素红染色检测2种蛋白对hBMSCs成骨矿化作用的影响。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果体外培养获得原代hBMSCs。实时定量PCR、Western印迹及细胞染色结果表明,10 μg/mL rhAm和200 μg/mL EMPs均可明显促进hBMSCs中成骨相关因子的基因及蛋白表达,且这种效果和蛋白作用时间有一定相关性。结论rhAm与EMPs均能明显促进hBMSCs成骨,作用效果具有一定的时间依赖性。     

黄芩苷调控的IKKα对HOKs炎症反应的保护作用

目的: 观察黄芩苷对HOKs炎症反应中IKKα介导的MASPIN的调控作用,探讨黄芩苷对口腔黏膜炎症的分子调控机制。方法: 以脂多糖（LPS）刺激人口腔角质细胞（human oral keratinocytes, HOKs）,体外局部模拟口腔黏膜上皮细胞炎性环境。CCK-8法检测黄芩苷对HOKs的毒性作用;在LPS刺激的HOKs中预先加入不同浓度黄芩苷,应用ELISA法检测黄芩苷对LPS刺激的HOKs中IL-6和TNF-α分泌的调控作用;利用RT-PCR及Western免疫印迹检测黄芩苷对LPS刺激的HOKs中IKKα介导的MASPIN基因及蛋白表达水平的调控作用。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 以10 μg/mLLPS刺激HOKs,可作为口腔黏膜上皮细胞炎症模型。黄芩苷（1~20 μg/mL）对HOKs无毒性作用;随着黄芩苷浓度的升高,MASPIN在LPS刺激的HOKs中的表达逐渐升高,而IKKα及炎性细胞因子TNF-α、IL-6的表达逐渐降低（P<0.05）。结论: 在LPS刺激的HOKs中,黄芩苷可降低炎性因子表达,下调IKKα,上调MASPIN。     

Comparative Effects of Concentrated Growth Factors on the Biological Characteristics of Periodontal Ligament Cells and Stem Cells from Apical Papilla

IntroductionDuring cell-free regenerative endodontic therapy, both stem cells from apical papilla (SCAPs) and periodontal ligament cells (PDLCs) are possible cell sources because of their proximity. Nonetheless, the regenerative ability of PDLCs and SCAPs under the induction of concentrated growth factors (CGFs) remains unclear.MethodsPDLCs and SCAPs were treated with various concentrations of CGF-conditioned medium (CCM). The effects of CCM with or without Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (LPS) on cell migration, odonto/osteogenic differentiation, and the expression of inflammatory cytokines were assessed. Dentin matrix transplants composed of PDLCs or SCAPs cell sheets coupled with CGF were put subcutaneously in immunocompromised mice for 8 weeks to explore their regenerative characteristics in vivo.ResultsCCM dose dependently enhanced the migration, proliferation, and odonto/osteogenic differentiation of PDLCs and SCAPs. CCM alleviated LPS-inhibited odonto/osteogenic differentiation of PDLCs and SCAPs as well as the LPS-induced up-regulation of inflammatory cytokines. In vivo, the newly regenerated tissue and microvessels formed by PDLCs and SCAPs were significantly increased under the induction of CGF. SCAPs mainly regenerated pulp/dentinlike tissues and a large number of microvessels, whereas PDLCs mainly formed bone/cementumlike structures.ConclusionsOverall, PDLCs excelled in cell proliferation, migration, and osteogenic differentiation, whereas SCAPs outperformed PDLCs in terms of angiogenic and odontogenic differentiation. The biological differences between PDLCs and SCAPs provided a possible theoretical basis for the formation of bone/cementum/periodontal ligament–like tissues after cell-free regenerative endodontic therapy.