菌斑生物膜原位干预模型的建立

目的 通过对原位菌斑生物膜发育过程及早期成熟菌斑生物膜的观察,探讨所建立的菌斑生物膜模型用于菌斑化学干预研究的可能性.方法 建立原位菌斑生物膜模型,运用激光共聚焦扫描显微镜结合荧光染色技术观察原位菌斑生物膜0～48 h的发育过程及48 h菌斑生物膜的活性和厚度.结果 可观察到0～48 h菌斑生物膜从无到形成到成熟,细菌排列趋于密集,菌斑厚度逐渐增加的过程.48 h的菌斑生物膜活性和厚度可检测.结论 建立的菌斑生物膜模型可观察原位菌斑的形成过程、形态及活性,适用于菌斑化学干预的研究.     

白色念珠菌生物膜形成的定量分析和形态学观察

目的：XTT法定量分析并在激光共聚焦显微镜和荧光显微镜下观察白色念珠菌生物膜的动态形成过程。方法：经过血清处理的灭菌玻片在六孔板中形成生物膜，经过荧光染色后在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下，动态观察生物膜的形成过程，并利用XTT减低法定量分析生物膜的形成过程。结果：形态学和定量分析都表明，白色念珠菌可以在玻片上形成典型的、成熟的生物膜结构，形成过程经过了几个明显的阶段。结论：白色念珠菌形成的生物膜具备典型的微生物生物膜结构。     

激光共聚焦显微镜研究clpP基因缺失对变形链球菌生物膜耐酸陛的影响

目的：应用激光共聚焦显微镜观察clpP基因对变形链球菌生物膜耐酸性的影响。方法：将变形链球菌标准株UAl59和它的clpP基因缺陷株分别做成预酸化和致死酸化处理的菌液,接种于刻有宽500txm深500μm沟的羟基磷灰石圆片上厌氧培养12h。培养后取出圆片,所有圆片均在处理后立刻进行荧光死、活菌斑染色并行共聚焦观察。测算活菌厚度、面积及荧光强度占总菌斑的百分比,应用SPSS15．0统计软件,采用方差分析及均数两两比较分析clpP基因缺失对细菌生长及耐酸能力的变化。结果：共聚焦显微镜下,clpP基因缺失菌株所形成的生物膜菌斑厚度略薄于标准菌株（P〈0．05）,经过预酸化处理和致死酸处理后clpP基因缺失菌株所形成的生物膜菌斑厚度显著薄于标准菌株（P〈O．01）,而且活菌百分比显著低于标准株（P〈0．01）。结论：共聚焦显微镜下clpP基因可以显著地降低变形链球菌的耐酸能力,并一定程度地降低变形链球菌的生长能力。     

原位菌斑生物膜的一种完整获得方法和结构研究

目的:通过对一种方法获得原位牙菌斑生物膜的结构分析,证明这种方法的可行性。方法:选择安装有局部可摘义齿的志愿者在基托表面粘贴塑料片的方法,在塑料片上可获得1、4、24h牙菌斑生物膜,并用激光共聚焦扫描显微镜进行结构的观察和分析。结果:牙菌斑生物膜的细菌、基质清楚可见,1、4、24h菌斑生物膜的平均厚度分别是(21.41±0.03)μm,(34.03±0.02)μm,(58.53±0.03)μm。结论:这种方法获取的菌斑生物膜结构完整、简便可行,是一种很好的获取原位牙菌斑生物膜的方法,可为进一步的实验提供平台。     

荧光技术在牙菌斑生物膜研究中的应用进展

牙菌斑生物膜是龋病和牙周病的始动因子,其形成过程呈时空动态变化,是菌丛赖以生存及细胞间信号交流的场所.对于菌斑生物膜的空间结构、信号交流及生物活性变化的研究渐成热点.激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)应用于细胞生物学及分子生物学的研究,成为牙菌斑生物膜研究的重要工具,荧光技术的不断发展,大大提高了CLSM在口腔菌斑生物膜研究领域的应用.而近年来荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)被引入细菌生物膜的研究中,使结合CLSM的荧光技术又有了新的发展.本文对几种常见的荧光技术做一综述.     

激光共聚焦扫描显微镜在龋病学研究中的应用进展

目的：激光共聚焦扫描显微镜是一种激光扫描、计算机自动化分析与显微镜技术相结合的医学图像分析仪器，近年来越来越多地应用于龋病学研究，其可以在不破坏牙体及菌斑的完整性及其成分之间关系的状态下，对活细胞进行动态观察、三维重建、空间定位等，已成为该研究领域的重要研究手段之一。本文简要介绍了激光共聚焦扫描显微镜的结构、基本原理及其在龋病学研究中的应用进展。     

五倍子对口内菌斑生物膜活性影响的体外研究

目的应用口内菌斑生物膜模型观察五倍子水提取物对菌斑生物膜活性的影响。方法将牙釉质磨片粘结于两侧下颌第一恒磨牙颊侧获得24h口内菌斑生物膜模型,实验组和对照组分别用6mg/ml五倍子水提取物和生理盐水处理3min,应用溴化乙锭/荧光素双乙酸盐(ethidium bromide/fluorescein diacetate,EB/FDA)染色技术和激光共聚焦显微镜(confocal laser scan microscope,CLSM)观察五倍子水提取物对生物膜活性的影响。结果CLSM观察可见所有样本釉质表面均有细菌的定植,有早期的生物膜形成。对照组菌斑生物膜中细菌的活性明显高于实验组,两者相比具有显著差异(P<0.05)。结论五倍子水提取物在较短的时间内就能对生物膜中的细菌产生一定的杀伤效应,使其活性下降。     

荧光原位杂交观察口腔原位菌斑中链球菌和具核梭杆菌的动态变化的研究

[摘要] 目的 观察口腔原位菌斑形成过程中链球菌和具核梭杆菌的动态变化。方法 专业洁治后,7个志愿者佩戴可形成口内菌斑生物膜以供原位菌斑研究的上颌装置,分别佩戴12 h、1 d、2 d、3 d、5 d后,取下样本,与链球菌和具核梭杆菌的特异性寡核苷酸探针进行荧光原位杂交,于激光共聚焦显微镜下观察菌斑生物膜的形成过程及2种细菌在菌斑形成发育中的分布及比例。结果菌斑生物膜厚度由5.26μm逐渐发育增加为46.93μm。12 h细菌仅形成平铺片状,链球菌占绝大多数,未见具核梭杆菌;此后细菌排列趋于密集,菌斑厚度逐渐增加,最后形成团块状菌斑。链球菌在2、3 d菌斑中比例下降;具核梭杆菌在5 d菌斑中比例比3 d上升107%。结论 链球菌在早期菌斑中为优势菌,具核梭杆菌在菌斑发育中期数量逐渐增加。2种细菌在菌斑形成中起到重要作用。     

三种漱口液对早期原位菌斑生物膜形成的影响

目的:应用口内牙菌斑生物膜模型评估替硝唑漱口液、西吡氯铵漱口液与氯己定漱口液对早期原位牙菌斑生物膜形成的影响.方法:在专业洁治后,志愿者佩戴一种上颌装置,6 个玻璃片置于装置内以形成口内菌斑生物膜.志愿者用指定漱口液每天漱口2 次,每次15 ml含漱1 min.48 h后样本从装置中移出,立即用2 种荧光染料染色,分别将死菌染成红色,活菌染成绿色,在激光共聚焦显微镜下观察,进行三维扫描,评估菌斑生物膜的厚度和活菌比率.在14 d洗脱期后,再应用另一种漱口液.结果:与清水相比, 3 种漱口液作用下的48 h菌斑生物膜平均厚度及平均活菌比率均有显著降低(P<0.001),且3 组之间有显著差异(P<0.05).结论:对于早期原位菌斑生物膜, 3 种漱口液均显示有抑制菌斑形成及抗菌的作用.     

不同培养条件对口腔细菌生物膜生长的影响

目的：研究5种口腔细菌在体外形成生物膜的能力、形成过程及不同培养条件对生物膜形成的影响，并通过激光共聚焦扫描显微镜（CISM）观察细菌生物膜的形成及结构特征。方法：选择与龋病发生关系密切的5种口腔细菌，分别接种在含牛心脑浸液培养基（BHI）、人工唾液（BM5）以及人唾液培养基的标准96孔板中，在培养6h、8h、12h、24h、36h、48h和60h后取出相应的微孔板，11％Crystal Violet染色生物膜，95％乙醇复吸Crystal Violet，HTS7000PLUS多孔板高效分析仪测定各时段细菌生物膜的生长情况，并绘制生长曲线。CLSM观察细菌生物膜形成的结构变化。结果：在BHI及BM5中5种口腔细菌均能形成生物膜，在人唾液中没有形成生物膜。细菌生物膜形成表现为缓慢的非线性生长，出现了一个相对的生长停滞期，这个时期出现在36～48h之间，不同细菌略有差别。激光共聚焦扫描显微镜（asM）观察发现在培养6h后仅有少量细菌粘附形成散在微菌落，24h后出现生物膜的基本结构，48h形成成熟的生物膜。结论：研究发现在体外细菌形成生物膜的能力与培养基条件密切相关，细菌生物膜形成缓慢，其间有一个相对生长停滞期。细菌定植，粘附，共集聚是生物膜形成的重要步骤。     

种植体愈合帽表面细菌生物膜结构初探

目的：研究口腔内纯钛种植体短期内表面细菌生物膜的结构，并探讨细菌生物膜结构与口腔卫生环境的相关性。方法：从12例种植患者获得术后6周复诊时取下的12枚完整的ITI种植体愈合帽，运用激光共聚焦显微镜对愈合帽表面生物膜的结构、分布等性质进行定性观察和定量分析，并分析了与牙菌斑指数的关系。结果：种植术后6周的12枚种植体愈合帽表面均广泛存在细菌生物膜，但分布不均，与愈合帽表面的位置有关。生物膜的厚度及范围与牙菌斑指数呈正相关。结论：术后短期内种植体愈合帽表面细菌生物膜的结构与口腔临床指标间存在一定的相关性。     

龋病病因相关因素的激光扫描共聚焦显微镜研究

牙菌斑生物膜作为细菌生长的微环境,在龋病形成和发展中起重要作用;口腔环境中相关因素如口腔黏膜中钙离子含量等与龋病也有一定关系。利用新兴的激光扫描共聚焦显微镜对菌斑生物膜及其他相关因素进行研究,取得了一系列新的进展,本文就此领域的相关问题作一综述。     

Plaque biofilms: the effect of chemical environment on natural human plaque biofilm architecture

The architecture of microbial biofilms especially the outer regions have an important influence on the interaction between biofilm and local environment particularly on the flux of materials into and out of biofilm compartments and as a consequence, biofilm metabolic behaviour. In the case of dental plaque biofilms, architecture will determine access of nutrients including acidogenic substrates and therapeutic materials to the microbial biomass and to the underlying tooth surface. Manipulation of this architecture may offer a means of altering mass transfer into the whole biofilm and biomass and raises the possibility of improving access of therapeutics. Plaque biofilms formed in vivo on human enamel were subjected to a number of different chemical conditions while under observation by confocal laser scanning microscopy in reflection mode. In this way the outer 50-100 microm or so of the biofilms was examined. Density and distribution of biomass were recorded as degree of reflectance. The amount and density of biofilm biomass increased from the plaque saliva interface towards the interior. Plaque biofilms were robust and little affected by mechanical manipulation, high ionic strength or low pH (2.5). Detergent (SLS), however, often appeared to either remove biomass and/or dramatically reduce its density.     

洗必泰葡萄糖酸盐对感染根管细菌生物膜的实验研究

目的：探讨洗必泰葡萄糖酸盐作为根管冲洗药物,对粪肠球菌生物膜的灭菌作用。方法：在无菌盖玻片上制备粪肠球菌生物膜,应用0．2％和5％洗必泰葡萄糖酸盐冲洗,分别作用1min和5min,激光扫描共聚焦显微镜观察灭菌效果。结果：0．2％或5％洗必泰葡萄糖酸盐的灭菌效果随作用时间的延长而增加（P＜0．05）;5％洗必泰葡萄糖酸盐作用1min的灭菌效果明显优于0．2％洗必泰葡萄糖酸盐（P＜0．05）,而其作用5min的灭菌效果与0．2％洗必泰葡萄糖酸盐者无差异（p＞0．05）。结论：洗必泰葡萄糖酸盐具有明显的杀灭粪肠球菌生物膜的作用,其不同浓度和不同作用时间的灭菌效果不同,然而尚不能达到完美的根管冲洗消毒目的。     

Spatial distribution of vital and dead microorganisms in dental biofilms

To examine the spatial structure of dental biofilms a vital fluorescence technique was combined with optical analysis of sections in a confocal laser scanning microscope (CLSM). Enamel slaps were worn in intraoral splints by three volunteers for five days to accumulate smooth-surface plaque. After vital staining with fluorescein diacetate and ethidium bromide the specimens were processed for CLSM examination. Optical sections 1 microm apart were analysed in the z-axis of these dental biofilms. One of the films was 15 microm high, sparse and showed low vitality, i.e. <16%, while the others were taller (25 and 31 microm) and more vital, i.e. up to 30 and 69%, respectively. In all instances the bacterial vitality increased from the enamel surface to the central part of the plaque and decreased again in the outer parts of the biofilm. The spatial arrangement of the microorganisms in the biofilm showed voids outlined by layers of vital bacteria, which themselves were packed in layers of dead material.     

激光扫描共聚焦显微镜观察碱性环境对粪肠球菌生物膜的影响

目的:比较不同碱性条件对生物膜状态粪肠球菌的影响。方法:制备粪肠球菌生物膜,分别用pH值为7、9和11的TSB培养液作用2 h后,用激光扫描共聚焦显微镜观察粪肠球菌生物膜的变化。结果:pH值由7升到9时,生物膜内、中、外各层活菌比例虽有所减少,但差异无统计学意义(P>0.05);当pH值11时,各层活菌比例虽然均较pH值为7和9时明显减少(P<0.05),但仍有大量活菌存在。结论:粪肠球菌对碱性环境具有强的耐受性,pH值为7～9时,对生物膜状态粪肠球菌无明显影响。     

Confocal laser scanning microscopic analysis of early plaque formed on resin composite and human enamel

The purpose of this study was to analyse quantitatively the early bacterial plaque formed on resin composite and human enamel in vivo, using a confocal laser scanning microscope. Test pieces of resin composite and human enamel were retained at the buccal surfaces of the upper first molars of three volunteers for 4, 8 and 24 h to allow plaque formation. Then, the specimens were immersed in propidium iodide in phosphate-buffered saline to stain adherent bacteria and observed with a confocal laser scanning microscope. The ratios of the area occupied by microorganisms to the whole area of the optical field were calculated using a photo-image analysis system. The thickness of the plaque was also measured. Quantitative analysis revealed that the resin composite showed significantly higher bacterial adherence than human enamel throughout the test period. A difference was noticed in the morphology of the bacteria between the two groups. Our findings suggest that resin composite shows higher bacteria adherence during early plaque formation compared with human enamel. In addition, the present findings may suggest a presence of the difference in bacterial composition of plaque in both specimens.