牙龈卟啉单胞菌第Ⅸ分泌系统组成的研究进展

第Ⅸ分泌系统(type Ⅸ secretion system,T9SS)至少由16种结构蛋白和4种转录调节因子组成,牙龈卟啉单胞菌通过T9SS将牙龈蛋白酶等毒力因子分泌到外膜并附着于细胞表面。本文介绍了牙龈卟啉单胞菌T9SS结构蛋白及其转录调节因子的最新研究进展,进一步理解T9SS跨外膜转运蛋白装置的组成及功能。     

牙龈卟啉单胞菌相关牙周炎疫苗有效免疫原及其途径和佐剂

牙龈卟啉单胞菌细胞表面的多种抗原可诱导机体产生保护性免疫应答,阻止牙龈卟啉单胞菌定植和感染,因此选择合适的牙龈卟啉单胞菌有效免疫原作为疫苗候选抗原来防治牙周炎具有重要的研究价值。牙龈卟啉单胞菌细胞膜上的菌毛蛋白、牙龈蛋白、血凝蛋白、外膜蛋白、被膜蛋白和热休克蛋白等多种表面抗原,皆有可能成为牙龈卟啉单胞菌相关牙周炎疫苗有效免疫原。牙周炎疫苗研究常用的免疫途径有腺体免疫、黏膜免疫、皮下接种和肌肉注射等,学者们普遍认为,黏膜免疫应该成为牙周炎疫苗免疫的主要方式。另外,牙周炎疫苗中使用佐剂可刺激机体产生免疫应答,增强抗原免疫原性。在未来的牙周炎疫苗研究中,应该结合牙龈卟啉单胞菌的多种特异性抗原找到各血清型牙龈卟啉单胞菌共同的抗原决定簇,结合其他牙周致病菌的有效免疫原及选择最有效的免疫途径和使用抗原呈递和佐剂系统。     

牙龈蛋白的生物学特性及临床意义

牙龈蛋白是一类结构和功能十分相似的蛋白质,具有多种生物学活性和免疫原性。牙龈蛋白分为牙龈蛋白酶R（Rgp）和牙龈蛋白酶K（Kgp）,具有结合、吸收、聚集血红蛋白的能力,可以降解和灭活免疫球蛋白,有效抑制中性粒细胞产生氧,抑制其杀菌作用,使牙龈卟啉单胞菌细胞避免被噬菌细胞攻击。Kgp能分解纤维蛋白原和纤维蛋白,从而干扰血凝块的形成使凝血酶时间延长,引起病变组织出血。Rgp能促进牙龈成纤维细胞产生干细胞生长因子,参与牙周病的炎症和修复过程。牙龈蛋白能破坏血管内皮细胞中细胞因子的反应系统,降低其黏附性和细胞活性,在引起牙周病的同时参与心血管疾病发生。牙龈蛋白能直接作用于结合上皮,降解细胞之间的连接,破坏结合上皮结构和功能的完整性,为牙龈卟啉单胞菌侵入牙周组织进一步发挥致病作用创造条件。在免疫功能上,抗牙龈蛋白抗体可避免上牙槽骨的吸收。四环素族药物等抑制剂可抑制牙龈蛋白活性,提高宿主对牙龈卟啉单胞菌的抵抗力。     

牙龈卟啉单胞菌第Ⅸ型分泌系统的研究进展

牙龈卟啉单胞菌第Ⅸ型分泌系统(T9SS)是新近发现的一种新型蛋白分泌系统,又被称为Por分泌系统(PorSS).与以往发现的8个蛋白分泌系统不同,T9SS系统是一个仅存在于拟杆菌中的多蛋白复合体,其分泌的蛋白质N端均具有Sec依赖的Ⅰ型信号肽,C端均含有保守结构域(CTD).牙龈卟啉单胞菌T9SS包括了内膜、外膜、细胞质以及细胞周质等重要组成部分的蛋白质,至少包括34种包含CTD的蛋白,这些蛋白参与调控的相关毒力因子包括牙龈素、菌毛、脂多糖、HBP35、CPG70蛋白和蛋白质-肽基精氨酸脱亚氨酶等.这些包含CTD的毒力蛋白通过T9SS转定位在细胞外膜上,然后释放至胞外,从而对牙周组织起破坏作用.本文对牙龈卟啉单胞菌T9SS的研究进展作一综述,以便于深入理解该菌的毒力机制.     

牙龈卟啉单胞菌对铁和亚铁血红素的摄取机制

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)是慢性牙周病重要病原菌之一.作为绝对需铁菌,牙龈卟啉单胞菌不能产生铁载体.所以在人体中,牙龈卟啉单胞菌主要利用外源的铁/亚铁血红素,通过特异性外膜受体结合含铁蛋白中的铁/亚铁血红素,并将其转运至细胞内.铁/亚铁血红素对于牙龈卟啉单胞菌的生长和毒性都起着重要作用.本文主要介绍牙龈卟啉单胞菌对铁和亚铁血红素的摄取机制.     

青少年正畸治疗早期牙龈卟啉单胞菌及其毒力因子牙龈蛋白K的变化研究

目的分析牙龈卟啉单胞菌及其毒力因子牙龈蛋白K在青少年正畸治疗早期的变化。方法随机收集青少年正畸牙龈正常者45例,分别取矫治器戴入前,戴入后1、2、3、6个月龈沟液标本,应用16S r DNA PCR技术检测各样本中的牙龈卟啉单胞菌及其毒力因子牙龈蛋白K;采用SPSS17.0软件包对数据进行统计分析,牙龈卟啉单胞菌及牙龈蛋白K各组间检出率比较用χ2检验;牙龈卟啉单胞菌、牙龈蛋白K的检出率与牙龈炎症之间的关系用Spearman等级相关分析。结果牙龈卟啉单胞菌在矫治前与戴入后1个月有显著性差异(P<0.05),与2个月、3个月之间有极显著性差异(P<0.01);戴入后1个月与2个月之间有显著性差异(P<0.05);牙龈蛋白K在矫治器戴入前与戴入后1个月、6个月之间无显著性差异,与戴入后2个月、3个月之间有显著性差异(P<0.05);从第2个月开始牙龈卟啉单胞菌与牙龈蛋白K的检出率下降,到6个月时检出率已基本接近矫治器戴入前。结论青少年正畸治疗过程中在矫治器戴入早期可引发牙龈卟啉单胞菌及牙龈蛋白K的增加,出现牙龈炎症反应,当增加到一定时间即2个月后开始逐渐下降,到6个月时已基本接近矫治器戴入前。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛FimA与福赛斯类杆菌表面蛋白间相互结合机制

目的 :探讨牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA与福赛斯类杆菌相互结合的机制。方法 :将福赛斯类杆菌ATCC 4 30 37全菌蛋白经室温、DTT和加热处理 ,SDS -PAGE梯度胶电泳 ,采用Western -blot技术检测其与牙龈卟啉单胞菌全菌蛋白及其菌毛FimA之间相互作用的表面蛋白分子。结果 :福赛斯类杆菌与牙龈卟啉单胞菌菌体蛋白相互结合的蛋白Mr分别为 36× 10 3 、2 1.9× 10 3 、7.4× 10 3 ;牙龈卟啉单胞菌菌毛FimA与Mr为 36×10 3 的福赛斯类杆菌菌体蛋白发生结合 ,且福赛斯类杆菌菌体蛋白变性不影响两者间结合。结论 :牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA能与福赛斯类杆菌菌体蛋白相互结合 ,两者结合为碳水化合物 -蛋白质凝集素样机制。     

牙龈卟啉单胞菌第Ⅸ型分泌系统的研究进展

牙龈卟啉单胞菌第Ⅸ型分泌系统（T9SS）是新近发现的一种新型蛋白分泌系统,又被称为Por分泌系统（PorSS）。与以往发现的8个蛋白分泌系统不同,T9SS系统是一个仅存在于拟杆菌中的多蛋白复合体,其分泌的蛋白质N端均具有Sec依赖的Ⅰ型信号肽,C端均含有保守结构域（CTD）。牙龈卟啉单胞菌T9SS包括了内膜、外膜、细胞质以及细胞周质等重要组成部分的蛋白质,至少包括34种包含CTD的蛋白,这些蛋白参与调控的相关毒力因子包括牙龈素、菌毛、脂多糖、HBP35、CPG70蛋白和蛋白质-肽基精氨酸脱亚氨酶等。这些包含CTD的毒力蛋白通过T9SS转定位在细胞外膜上,然后释放至胞外,从而对牙周组织起破坏作用。本文对牙龈卟啉单胞菌T9SS的研究进展作一综述,以便于深入理解该菌的毒力机制。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖引起牙周炎症的机制和特点

革兰阴性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌和牙周炎密切相关,脂多糖是革兰阴性菌外膜中的主要结构成分,具有广泛的生物学活性,被认为是革兰阴性菌的主要毒力因子之一。本文就牙龈卟啉单胞菌脂多糖的化学组成和结构,所启动炎症信号通路及其起始受体,引起牙周炎症的机制和特点作一综述。     

牙龈卟啉单胞菌在牙周病防治中的应用

牙周病是口腔两大类主要疾病之一,具有较高的发病率,因此,探索预防牙周病的有效途径十分重要。本文介绍了国外学者以牙龈卟啉单胞菌不同形式的抗原进行免疫学防治牙周炎的试验,其中包括对牙龈卟啉单胞菌菌毛、血凝素、牙龈素和外膜蛋白的研究。     

特定序列寡核苷酸MT01对牙龈卟啉单胞菌感染的成骨细胞的增殖、细胞周期及凋亡的影响

目的 通过观察MT01对感染状态下成骨细胞细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,探讨MT01对牙周致病菌感染的成骨细胞生物学性能的影响。方法 以人成骨细胞MG63为目的细胞,分别与PBS、MT01、CpG ODN、甲硝唑和庆大霉素共培养3 h后,按感染复数100∶1的比例加入牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌共培养,检测培养24 h和48 h后MG63细胞的增殖、细胞周期及凋亡,以PBS作为空白对照,以牙龈卟啉单胞菌和PBS共培养作为阴性对照。结果MT01+牙龈卟啉单胞菌组细胞增殖高于空白对照组（P<0.05）,G₁期细胞百分比低于阴性对照组,而S期细胞百分比高于阴性对照组（P<0.05）,细胞早期凋亡率低于阴性对照组（P<0.05）。结论 MT01可促进感染状态下成骨细胞的细胞增殖,降低G₁期细胞百分比,促使细胞进入S期并抑制细胞早期凋亡。     

Development and characterization of Porphyromonas gingivalis-specific rat T-cell clones.

Porphyromonas gingivalis has been implicated as a major pathogen in periodontitis. To determine the role of T cells in the regulation of this disease, a method was developed for the generation and characterization of rat T-cell clones with antigen specificity to P. gingivalis whole cells. The clones studied so far demonstrated a T-helper (Th) phenotype W3/13+, W3/25+, OX8− and OX22−. These T-cell clones proliferated in vitro in response to P. gingivalis, but not to other bacteria (Prevotella intermedia, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Wolinella recta, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus sanguis). Limiting dilution analysis showed W3/25+, OX8− T cells preferentially respond to P. gingivalis, rather than W3/25−, OX8+ T cells. P. gingivalis-reactive W3/25+ T cells belonged to the OX22− population, suggesting that the OX22− T cells may represent memory cells. All clones tested produced interferon γ, but not interleukin 2. The cloned T-cell F1 significantly enhanced P. gingivalis-specific antibody production (p < 0.03). The availability of these cloned T cells should bring new insight into the mechanism by which T cells regulate oral health and periodontal disease.     

Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice

The suitability of a mouse model for host response in the induction of alveolar bone loss by Porphyromonas gingivalis was explored. The mouths of immunocompetent and severe combined immunodeficient (SCID) mice were infected with P. gingivalis ATCC 53977. P. gingivalis was not isolated from the mouths of these mice before infection, but was present at least 42 days after infection. P. gingivalis-specific IgG was present in sera from the infected, immunocompetent mice at the end of these experiments (42 days). Specific IgG was not present in sham-infected or uninfected immunocompetent mice, nor in any immunodeficient mice. Specific IgM was not present in any sera at 42 days. Infected, immunocompetent mice of two strains showed significant bone loss in comparison to sham-infected or uninfected immunocompetent mice (p < 0.05). Infected SCID mice, which are genetically lacking both B and T lymphocytes, also showed significant bone loss compared with sham-infected or uninfected SCID mice (p < 0.05). However, the degree of bone loss was greater in immunocompetent than immunodeficient mice: the relative amount of bone in infected mice was 77% of that in sham-infected immunocompetent mice, and 86% of sham values in SCID mice (p = 0.025). Thus oral infection of mice is a feasible model for studying the effects of host response on P. gingivalis-induced alveolar bone loss. Because bone loss was induced both in immunocompetent and SCID mice but was greater in immunocompetent mice, it appears that neither B nor T cells are absolutely necessary for bone resorption in response to P. gingivalis infection but they may significantly modulate the degree of resorption.     

牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关基因的克隆及表达纯化

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）中负责c-di-AMP代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化。方法 通过聚合酶链反应（PCR）克隆牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将目的基因片段与大肠杆菌表达质粒pET28a连接,分别构建出重组表达质粒pETpgn0523 pETpgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和鉴定。用镍离子金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化,BCA法检测目的蛋白的浓度。结果 目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003扩增产物条带与预期大小一致。重组表达质粒pET-pgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003及其PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证与预期大小相符,测序结果与GenBank中牙龈卟啉单胞菌ATCC33277国际标准菌株的基因序列100%一致。IPTG诱导后的菌体经SDS-PAGE检测得到3个大小分别为19.5×10³、39.9×10³、66.0×10³的蛋白质增强条带,与预期大小相符。镍离子金属亲和层析柱纯化得到的蛋白与预期目的蛋白分子量一致,BCA法测定目的蛋白的浓度分别为0.708、0.523和0.861 mg·mL^-1。结论 本研究成功克隆并表达纯化了牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关蛋白,得到了较高浓度和纯度的目的蛋白,为进一步探究牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP的生理功能及体内代谢途径奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌来源的脂多糖通过X盒结合蛋白1调控脂肪细胞胰岛素信号通路的机制研究

探讨内质网应激（ERS）关键信号分子X盒结合蛋白1（XBP1）在牙周炎致病菌牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）来源的脂多糖（LPS）刺激下对脂肪细胞胰岛素信号通路的影响。     

Determination of active site of lysine-specific cysteine proteinase (Lys-gingipain) by use of a Porphyromonas gingivalis plasmid system

Porphyromonas gingivalis, a major etiological bacterium of periodontal diseases, produces a unique lysine-specific cysteine proteinase (Lys-gingipain, Kgp) implicated in the virulence of this organism. Our observations show the expression of a catalytically active recombinant Kgp in a P. gingivalis Kgp-null mutant and the restoration of its functions by the use of a shuttle plasmid vector stable in P. gingivalis. The Kgp-expressing mutant exhibited a similar catalytic activity to that of the wild-type strain. This mutant also restored the ability to form black-pigmented colonies on blood agar plates and to generate a 19-kDa haemoglobin receptor protein responsible for haemoglobin binding. In order to establish the importance of the active-site Cys residue and elucidate its role in bacterial black pigmentation we constructed three Kgp mutants with changed potential active-site Cys residues. The cells expressing a single mutation (C476A) showed the high Kgp activity and the black pigmentation. In contrast, the cells expressing the single mutant (C477A) and the double mutant (C476A/C477A) exhibited neither Kgp activity nor black pigmentation. These results indicate that the 477th Cys residue is essential for both the Kgp activity and the black pigmentation of P. gingivalis.     

谷氧还蛋白在牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导脐静脉内皮细胞氧化应激中的作用

目的 从基因和蛋白水平研究谷氧还蛋白（Grx）在牙龈卟啉单胞菌脂多糖（LPS）诱导脐静脉内皮细胞（EA-hy926细胞）时的表达变化及其对Akt通路的调控作用。方法 采用牙龈卟啉单胞菌的LPS（1 000 ng·mL^-1）对EA-hy926细胞进行不同时间段（4、12、18、24 h）的刺激诱导,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测细胞grx1基因的表达变化;然后加入Grx特异性抑制剂氯化亚硝脲（BCNU）,使用Western blot法检测对照组、LPS组（1 000 ng·mL^-1LPS刺激12 h）和BCNU组（25 μmol·mL^-1BCNU预处理30 min+1 000 ng·mL^-1LPS刺激12 h）的Grx、Akt、磷酸化Akt蛋白的表达情况。结果 LPS诱导下,EA-hy926细胞的grx1基因表达量在各个时间段均上调,12 h时grx1表达量最高。LPS诱导12 h时,LPS组的Grx蛋白表达量较对照组明显升高（P<0.05）,而BCNU可有效抑制Grx蛋白的表达（P<0.05）;Akt蛋白表达量在各组间无明显差异（P>0.05）,而LPS组的磷酸化Akt活性升高,显著高于对照组和BCNU组（P<0.05）,与Grx蛋白的表达趋势一致。结论 LPS可以从基因和蛋白水平诱导Grx的表达;Grx是Akt的潜在调节因子,可能对LPS刺激下Akt的调控具有重要意义。     

Endopeptidase activities of selected Porphyromonas spp., Prevotella spp. and Fusobacterium spp. of oral and non-oral origin

The ability of three Porphyromonas spp., seven Prevotella spp., seven Fusobacterium spp. and two related Bacteroides spp. (B. levii and B. macacae) to degrade an extensive range of synthetic endo-, amino- and diamino peptidase substrates linked to the fluorescent leaving group 7-amido-4-methylcoumarin (NHMec) was investigated. Many more species than was previously recognized exhibited peptidase activities, albeit at lower levels than those already described for Porphyromonas gingivalis. Detection of chymotrypsin-like activity was dependent on which of three NHMec-linked substrates was used, but all species exhibited degradative activity with at least one of these substrates. Elastase-like activity was detected in all species though not all species reacted with each of the elastase substrates. Glycylprolyl peptidase activity was detected in all of the species tested with the exception of F. mortiferum, F. gonidiaformans, F. naviforme and F. necrophorum. While the detection of peptidase activities does not appear to be useful for the differentiation of species within the genera Bacteroides and Prevotella, its ability to differentiate species of the genus Porphyromonas or Fosobacterium further investigation.