nm23-H1基因转染前后人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中蛋白激酶C转位的变化

目的 研究nm23-H1基因转染诱导人舌鳞状细胞癌(以下简称舌鳞癌)Tca8113 细胞凋亡过程中蛋白激酶C-θ(PKC-θ)的作用.方法 采用脂质体转染法将真核表达载体pAdEasy-nm23-H1 转染人舌鳞癌Tea8113细胞株.应用PKC-θ活化抑制剂 Calphostin C 和 DMSO 预处理细胞30 min 后,常规培养24 h,倒置显微镜观察细胞形态的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot分析Tca8113细胞中PKc-θ裂解活化状况;酶标仪(ELISA)检测Caspase-3的相对活性.结果 人舌鳞癌Tea8113 细胞胞浆中及核周存在PKC-θ的表达,nm23-H1基因转染后PKC-θ从胞浆、核周转位到细胞核内表达.nm23-H1基因转染可导致PKC-θ的裂解活化,形成功能性的催化片段,而Calphostin C 抑制转染诱导的PKC-θ裂解活化.nm23-H1基因转染后,Calphostin C 预处理组和DMSO预处理组Tca8113 的凋亡率、Caspase-3的活性增加,两组间有明显差异(P<0.05).结论 nm23-H1诱导细胞凋亡过程中有PKC-θ的裂解活化,PKC-θ是 nm23-H1 诱导舌鳞癌 Tea8113 细胞株凋亡过程中的参与者,PKC-θ激活Caspase-3诱导细胞凋亡是nm23-H1基因诱导肿瘤细胞凋亡机制之一.     

Fas基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞生物学特性的影响

目的:研究脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,Fas)基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞生物学特性的影响,探讨分子机制.方法:脂质体法将含Fas基因的真核表达重组质粒pBK-Fas导入Tca8113细胞,流式细胞术(FCM)检测Fas蛋白表达,MTT法检测细胞化疗敏感性,TUNEL法检测细胞凋亡敏感性,H33342释放法检测外周血单核细胞(PBMC)的癌细胞杀伤活性.结果:Fas转染细胞蛋白表达强度由35.01±5.26提高到55.40±7.31,二者差异有显著性(P＜0.01).相同浓度条件下,5-Fu对Fas转染细胞杀伤率提高.Fas转染细胞对抗Fas单克隆抗体诱导的细胞凋亡敏感性增强,凋亡指数由16.88%±1.46%提高到27.12%±2.35%.与未转染细胞相比,两项指标差异均有显著性(P＜0.01).PBMC对转染细胞的杀伤活性为51.22%±4.61%,对未转染细胞为23.92%±2.38%,差异也有显著性(P＜0.01).结论:Fas基因转染提高化疗药物和机体免疫细胞对舌鳞癌细胞的杀伤活性.     

Survivin基因在顺铂诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡中的作用

目的体外观察顺铂（DDP）诱导Tca8113舌鳞癌细胞株凋亡的作用, 同时检测在此过程中凋亡蛋白抑制因子Survivin mRNA表达和蛋白表达的变化。方法将人Tca8113舌鳞癌细胞株进行传代培养,MTT法检测顺铂不同浓度和不同时间对Tca8113舌鳞癌细胞生长的抑制作用,通过RT- PCR检测凋亡过程中Survivin基因mRNA的表达,免疫细胞化学观察Survivin基因的蛋白表达,以及流式细胞术观察顺铂诱导各组Tca8113细胞的凋亡率。结果顺铂可明显抑制Tca8113舌鳞癌细胞的增殖, 其增殖抑制率呈浓度和时间依赖性,细胞凋亡率也呈同样的趋势,最高可达34.1%。1.0 μg/mL DDP处理Tca8113舌鳞癌细胞,Survivin mRNA和蛋白表达水平随时间的增加而降低,在24h达到最低,随后又升高。结论抗凋亡蛋白Survivin在Tca8113舌鳞癌细胞高表达,顺铂可有效诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡, Survivin mRNA表达在化疗早期随作用时间的延长而降低,Survivin基因的抑制在顺铂诱导的Tca8113舌鳞癌细胞的细胞凋亡中起着重要的作用。     

nm23-H1基因对Tca8113的转移能力及化疗敏感性影响的实验研究

目的　通过nm2 3-H1的转化及导入Tca81 1 3细胞株 ,建立稳定、高效、低毒的转染方法 ,观察nm2 3-H1对Tca81 1 3细胞株侵袭转移能力的影响。方法　利用基因转化技术 ,制备高纯度的nm2 3-H1真核表达质粒。利用阳离子脂质体介导的转染技术 ,完成转染方法的建立。利用免疫组化技术 ,检测转染前后的nm2 3-H1的蛋白产物核苷二磷酸激酶A (NDPKA)的表达。利用transwell小室和冲刷实验 ,观察转染前后细胞的侵袭、粘附、趋化运动能力的变化。MTT法观察nm2 3-H1对Tca81 1 3化疗敏感性影响。结果　使用重组的pCMV-Neo-Bam真核表达载体 ,将nm2 3-H1转染口腔癌细胞 ,并获得稳定表达。Tca81 1 3细胞株nm2 3-H1基因转染前后表达水平有明显差异 ,转染后Tca81 1 3细胞侵袭、粘附、趋化运动能力均显著降低 ,转染前后Tca81 1 3细胞株对阿霉素 (ADM)、5-氟尿嘧啶 (5-FU)、甲氨喋呤 (MTX)的化疗敏感性无显著差异 ,转染后Tca81 1 3细胞株对顺铂 (CDDP)明显增敏。结论　nm2 3-H1对Tca81 1 3细胞的侵袭转移能力具有显著抑制作用 ,nm2 3-H1可能通过特异性地影响细胞内的能量交换过程来达到对CDDP化疗增敏的效果。     

顺铂诱导人涎腺腺样囊性癌细胞多药耐药性的评价

目的:用恒定顺铂浓度、周期性作用的方法,诱导产生耐顺铂的腺样囊性癌细胞株SACC,并检测其多药耐药性。方法:用浓度为1μg/ml的顺铂作用于腺样囊性癌细胞株,每次作用时间48h,经6个月后形成在该药物浓度下生长良好的耐顺铂细胞株。用MTT法、流式细胞仪检测4种化疗药物甲氨喋呤、平阳霉素、长春新碱、丝裂霉素对2种细胞的杀伤效应和细胞周期的变化。结果:经过6个月诱导形成的耐顺铂细胞株SACC/DDP,较之SACC,对4种化疗药物均产生了不同程度的抗性,流式细胞仪检测发现其细胞周期发生变化,主要是G0/G1比例下降,且与药物浓度密切相关。结论:经顺铂周期性诱导,可以产生人涎腺腺样囊性癌多药耐药细胞株。     

腺病毒介导nm23-H1基因在Tca8113细胞中表达的实验研究

目的:利用人nm23-H1基因重组腺病毒转染Tca8113细胞,检测nm23-H1基因在Tca8113细胞中的表达。方法:制备人nm23-H1基因重组腺病毒并转染人舌癌Tca8113细胞系,采用Western blotting、免疫荧光法、免疫组化法和流式细胞术检测nm23-H1基因的表达。结果:Western blotting、免疫荧光法、免疫组化法和流式细胞术均检测到nm23-H1在Tca8113细胞中的表达,表达产物主要存在于细胞质中。结论:重组腺病毒载体Ad-nm23-H1成功介导了Tca8113细胞内nm23-H1基因的表达,为肿瘤的基因治疗提供了依据。     

nm23-H1质粒和顺铂白蛋白联合治疗裸鼠移植瘤

目的 研究nm23-H1质粒和顺铂白蛋白联合应用对裸鼠移植瘤的影响。方法 将15只BALB/C雌性裸鼠随机等量分为3组,即对照组、顺铂白蛋白组和顺铂白蛋白＋nm23-H1质粒组。每只裸鼠均皮下注射浓度为每毫升 3.1×106个的舌鳞癌Tca8113细胞,2周后顺铂白蛋白＋nm23-H1质粒组移植瘤瘤体内注射质粒-脂质体复合物,3 d后顺铂白蛋白＋nm23-H1质粒组和顺铂白蛋白组瘤体内注射顺铂白蛋白。观察裸鼠的重量、移植瘤体积和瘤体重量的变化。结果 对照组裸鼠重量最轻。nm23-H1质粒和顺铂白蛋白联合治疗组肿瘤体积最小,瘤体重量最轻。结论 nm23-H1基因治疗和顺铂白蛋白联合可以明显抑制裸鼠移植瘤的生长。     

nm23-H1转染Tca8113细胞后稳定表达细胞株的建立

目的:建立稳定高表达nm23-H1的细胞株。方法:将nm23-H1真核表达质粒转化大肠杆菌,制备感受态细菌。提取质粒,酶切琼脂糖电泳对质粒进行鉴定。脂质体介导将质粒转染人舌鳞癌细胞株Tca8113,G418持续筛选5周,对获得的细胞株进行免疫组化、Western-blott和流式细胞仪鉴定。结果:酶切琼脂糖电泳证实插入nm23-H1片段长度为986bp,质粒片段长度为6550bp,nm23-H1的cDNA被插入在pCMV-Bam-Neo中的BamH1区域。免疫组化、Western-blott和流式细胞仪鉴定表明nm23-H1高表达。结论:成功建立稳定高表达nm23-H1的细胞株。     

顺铂诱导颊癌细胞凋亡及凋亡分子(Apo-1)表达的实验研究

目的:研究细胞毒类化疗药——顺铂诱导人颊癌细胞凋亡发生的规律以及凋亡分子Apo-1的表达。探讨口腔癌化疗的细胞凋亡机制。方法:以建株人颊癌细胞系BcaCD885为对象,采用光镜、电镜以及流式细胞术等手段观察顺铂诱导颊癌细胞凋亡的形态特征及规律,同时检测顺铂对颊癌细胞Apo-1表达的影响。结果:顺铂作用后的颊癌细胞出现典型的凋亡细胞形态学特征;顺铂诱导颊癌细胞凋亡呈现时间及剂量依赖性效应关系;顺铂能上调颊癌细胞Apo-1的表达。结论:细胞凋亡可能是顺铂杀灭颊癌细胞的重要机制,Apo-1在顺铂诱导颊癌细胞凋亡中可能起着关键性调节作用     

人舌鳞癌细胞SOCS1基因沉默对细胞增殖和化疗药物敏感性的影响

目的:在人舌鳞癌细胞中观察细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)沉默对细胞增殖及化疗药物敏感性的影响,探讨SOCS1作为舌鳞癌治疗靶点的研究。方法:western blot、PCR及定量PCR验证SOCS1干扰序列沉默人舌鳞癌细胞系CAL27中SOCS1的表达; MTT法检测舌鳞癌细胞对化疗药物敏感性的变化;细胞计数的方法观察细胞的增殖速度;采用流式细胞术的方法检测细胞周期的变化。结果:将SOCS1干扰序列转染CAL27细胞后,SOCS1 mRNA及蛋白表达水平均明显下降。沉默SOCS1表达后,化疗药物卡铂和紫杉醇对CAL27细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)均显著降低(P<0.01);转染72 h后CAL27细胞数量较对照组显著减少(P<0.05);SOCS1表达抑制后CAL27细胞G0/G1期细胞比例明显升高,而S期和G2/M期细胞比例明显减小,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:SOCS1表达抑制后,人舌鳞癌细胞株CAL27的增殖能力下降,并且对化疗药物的敏感性增强。     

生存素基因沉默增强人舌鳞状细胞癌Tca8113对顺铂敏感性的实验

目的探讨靶向生存素短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株生存素基因表达、凋亡及其对顺铂、5-氟尿嘧啶（5-Fu）敏感性的影响。方法脂质体介导的生存素shRNA表达载体转染Tea8113细胞，未转染、转染脂质体及错配shRNA载体的细胞作为对照。采用RT-PCR和Western blot分别检测生存素mRNA和蛋白的表达，流式细胞仪分析细胞的凋亡率，MTT法测定抗癌药物的敏感性。结果生存素shRNA表达质粒转染后，与3个对照组相比较，生存素mRNA和蛋白表达水平明显下降，细胞凋亡率的上升呈时间依赖性，48h可达37．9％。生存素shRNA能显著增加顺铂的敏感性，与未转染组比较其IC50值下降约4／5（P〈0．01），但对5-Fu的作用不明显。结论靶向生存素的shRNA可有效抑制Tea8113细胞生存素mRNA和蛋白的表达，同时增加了顺铂的化疗敏感性。     

X-性染色体连锁凋亡抑制蛋白与口腔鳞癌细胞Tca8113化疗耐药的关系

目的研究X-性染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）在口腔鳞癌细胞Tca8113中的表达水平,并探讨XIAP表达与Tca8113细胞对化疗药物耐药性之间的关系。方法用平阳霉素（PYM）间歇性加药,逐步递增剂量,采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测药物处理前后细胞对PYM的敏感性,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测XIAP在药物处理前后的各Tca8113细胞组中的表达变化,并探讨XIAP与细胞耐药性的关系。结果Tca8113细胞在PYM间断作用下产生耐受,Tca8113-1-10组、Tca8113-10-10组耐药细胞对PYM的半数有效浓度（IC50）分别为（12.758±0.030）、（18.986±0.150）μg·mL-1。Tca8113-1-20、Tca8113-10-20组耐药细胞对PYM的IC50分别为（26.302±0.072）、（35.294±0.115）μg·mL-1。XAIP的表达水平与细胞对PYM的耐药有相关性（P<0.01）。结论XIAP在口腔鳞癌中的表达水平升高,可能与鳞癌的化疗耐药性有关,这可作为口腔鳞癌基因治疗的一个新靶点。     

加热联合黄体酮对人舌癌耐药细胞株Tca8113/BLM耐药性的影响

目的:研究加热(hyperthermia, HT)联合黄体酮(progresterone, Prog)对人舌癌细胞Tca8113和耐药细胞Tca8113/BLM耐药性的影响.方法:采用MTT法检测加热41 ℃ 1 h后联合Prog对人舌癌亲本细胞Tca8113和耐药细胞Tca8113/BLM化疗药物的敏感性;流式细胞仪(FCM)检测细胞内阿霉素(ADM)浓度聚积以及细胞膜上P-gp和MRP的表达.结果:与黄体酮作用细胞相比,加热41 ℃ 1 h联合2 μmol/L Prog作用细胞后,Tca8113和Tca8113/BLM细胞的IC_50显著下降(P<0.01),且各组之间均有显著差异(P<0.01),ADM浓度聚积在2 种细胞中明显增加(P<0.01),细胞膜上的P-gp 和MPR荧光强度显著下降(P<0.01).结论:加热联合Prog能协同增加细胞内药物浓度的聚积,显著提高细胞对化疗药物BLM的敏感性,其二者协同作用与降低细胞膜上的P-gp和MRP的表达有关.     

顺铂诱导Tca8113细胞凋亡及周期特异性

目的探化疗药物顺铂（ＣＤＤＰ）对口腔鳞癌细胞凋亡及细胞周期特异性的诱导作用。方法选用人舌鳞状细胞癌细胞系Ｔｃａ８１１３为研究对象,应用倒置显微镜、荧光显微镜、透射电镜、流式细胞仪等方法进行观察。结果ＣＤＤＰ作用Ｔｃａ８１１３细胞后,细胞增殖变慢,增殖指数下降,细胞变小,变圆,失去贴壁性,从附着处脱落。ＤＮＡ染色后荧光显微镜下观察,细胞核呈现橙红色,半月形,不规则块状等凋亡形态变化。透射电镜观察,细     

PI3K/Akt信号通路抑制剂在舌鳞癌细胞系增殖和凋亡中的作用

目的:探讨PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对舌鳞癌细胞系Tca8113增殖和凋亡的影响及其相关机制。方法:LY294002处理Tca8113细胞,MTT法观察对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot及ELISA分析LY294002作用前后p-Akt及Akt蛋白的表达。结果:随LY294002浓度(0、10、25、50、75μmol/L)的增加及作用时间(24、48 h)的延长,实验组Tca8113细胞的增殖抑制率逐渐增大,LY294002抑制作用与浓度及作用时间呈正相关LY294002干预细胞24 h后,细胞凋亡率显著高于未干预组,p-Akt蛋白表达明显降低,而总Akt表达无显著改变。结论:LY294002可诱导Tca8113细胞凋亡,其作用机制与抑制PI3K/Akt信号通路的效应分子p-Akt的活化有关。