骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达

背景：有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道。目的：观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。方法：取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1d后将细胞分为两组：对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原。RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;诱导7d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义（P〈0.05）,第7天,两者表达最强。说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞。其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用。     

腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点

目的：课题组以前的实验证实，人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒可高效感染人骨髓间充质干细胞，使之大量表达人血管内皮生长因子165，促进局部新生血管生成，有利于组织修复。实验观察腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。 方法：实验于2005—03／2006—01在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和创伤骨科完成。人骨髓间充质干细胞取自健康成年男性自愿者，得到医院伦理道德委员会批准。将人骨髓间充质干细胞体外扩增纯化后随机分为4组：①人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组。②β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组。③阳性对照组：培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。④空白对照组：不给予特殊处理。各组细胞处理后12d，应用全自动生化分析仪检测各组培养上液碱性磷酸酶活性；于处理后14d，应用VonKossa染色法检测人骨髓间充质干细胞中骨胶原结节形成情况。 结果：①经多次换液传代，人骨髓间充质干细胞呈均一梭形形态。处理后人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平，突起减少；β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组形态无明显变化。②Yon Kossa染色人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成，明显多于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组。③人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组培养上清碱性磷酸酶活性显著高于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组（F=165．18，P=0．00）。结论：人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质于细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨疾病的可行性。     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体（Ad-BMP-2/GFP）转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。     

腺病毒介导入血管内皮生长因子_165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点

目的：课题组以前的实验证实，人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒可高效感染人骨髓间充质干细胞，使之大量表达人血管内皮生长因子165，促进局部新生血管生成，有利于组织修复。实验观察腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。 方法：实验于2005—03／2006—01在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和创伤骨科完成。人骨髓间充质干细胞取自健康成年男性自愿者，得到医院伦理道德委员会批准。将人骨髓间充质干细胞体外扩增纯化后随机分为4组：①人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组。②β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组。③阳性对照组：培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。④空白对照组：不给予特殊处理。各组细胞处理后12d，应用全自动生化分析仪检测各组培养上液碱性磷酸酶活性；于处理后14d，应用VonKossa染色法检测人骨髓间充质干细胞中骨胶原结节形成情况。 结果：①经多次换液传代，人骨髓间充质干细胞呈均一梭形形态。处理后人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平，突起减少；β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组形态无明显变化。②Yon Kossa染色人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成，明显多于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组。③人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组培养上清碱性磷酸酶活性显著高于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组（F=165．18，P=0．00）。结论：人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质于细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨?     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达☆

背景:有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道. 目的:观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达. 方法:取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1 d后将细胞分为两组:对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原.RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达. 结果与结论:兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异(P<0.05);诱导7 d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21 d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义(P<0.05),第7天,两者表达最强.说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞.其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用.     

促进小鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的血管内皮生长因子

背景：血管内皮生长因子是骨髓间充质干细胞所处骨髓微环境中的重要调控因子,其可促进骨髓间充质干细胞的血管内皮方向分化,但尚无其对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化调控作用的报道。
　　目的：探讨血管内皮生长因子对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的调控作用及其机制。
　　方法：分离、培养小鼠骨髓间充质干细胞,CCK8方法检测不同质量浓度血管内皮生长因子重组蛋白对骨髓间充质干细胞增殖的影响,选定适宜血管内皮生长因子重组蛋白质量浓度并检测其对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响,分子生物学方法检测血管内皮生长因子干预下骨髓间充质干细胞中Osterix,Runx2,碱性磷酸酶、骨钙素和血红素氧化酶1的表达。
　　结果与结论：①血管内皮生长因子可以促进骨髓间充质干细胞增殖,且具有浓度依赖性,100μg/L血管内皮生长因子重组蛋白的促增殖作用最显著。②成骨诱导剂存在条件下,血管内皮生长因子促进骨髓间充质干细胞成骨标志基因Osterix、Runx2、碱性磷酸酶和骨钙素的表达;血管内皮生长因子干预组骨髓间充质干细胞成骨分化的钙结节数量较对照组增加。③血管内皮生长因子可诱导骨髓间充质干细胞中血红素氧化酶1 mRNA和蛋白水平的高表达。以上结果表明血管内皮生长因子促进骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化的调控机制可能与骨髓间充质干细胞内血红素氧化酶1表达增加有关。     

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用，能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨，并最终导致新骨生成；碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质于细胞的软骨与骨的分化。目的：观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响，以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计：随机对照实验。单位：解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料：培养的兔骨髓间充质干细胞。方法：实验于2004-06／12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子（100μg／L人重组骨形态发生蛋白2，100μg／L碱性成纤维生长因子，100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子）和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法，碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节Von Kossa染色观察。主要观察指标：通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果：①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化，特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖，与对照组相比，细胞增值率提高近100％；虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响，但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论：碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子，两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成，可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达

背景：研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。目的：应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。方法：构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和（或）外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21d后行矿化（钙）结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。结果与结论：①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。     

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞*

背景：骨形态发生蛋白2及转化生长因子β是骨再生中重要的因子,提高其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。目的：构建携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体,观察其在骨髓间充质干细胞中的表达情况。方法：应用重组慢病毒技术构建同时携带转化生长因子β3、骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒表达载体,并用其转染体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞,以转染携带转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2单一基因的慢病毒或单独慢病毒的骨髓间充质干细胞作为对照。转染后1周分别提取各组细胞的总RNA 和蛋白进行检测。结果与结论：荧光显微镜下见转染转化生长因子β3和(或)骨形态发生蛋白2基因3 d 的骨髓间充质干细胞发绿色荧光,转染效率达90%以上。RT-PCR 和 Western blot 结果显示,转染转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2 mRNA 和蛋白的表达均高于单一基因转染组及空白对照组。可见应用慢病毒可成功将转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞并实现其高效表达,且两种基因具有协同促表达作用。     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达

背景:研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生.目的:应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用.方法:构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及 Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达.重组Ad-LMP-1和(或)外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21 d后行矿化(钙)结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用.结果与结论:①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达.②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化.③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应.     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞作为骨、软骨创伤缺损及退变修复的种子细胞越来越受到关注。目的：分析人骨形态发生蛋白2基因转染对白色封闭群大鼠（SD大鼠）骨髓间充质干细胞的影响。方法：分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞并体外扩增,通过腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞,分别通过荧光显微镜观察荧光表达情况及蛋白质水平来测定转染后人骨形态发生蛋白2的表达,碱性磷酸酶定量测定鉴定成骨活性及MTT法评估人骨形态发生蛋白2转染对骨髓间充质干细胞的影响。结果与结论：从SD大鼠骨髓提取物中分离培养的细胞形态为梭形,呈铺路石状、漩涡状生长,经流式细胞仪检测及多项分化能力鉴定符合骨髓间充质干细胞的特征;经转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞表达人骨形态发生蛋白2、碱性磷酸酶;MTT法检测转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞增殖能力明显增强（P〈0．05）。说明人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞后可以持续、高效表达入骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶,在体外明显促进骨髓间充质干细胞的增殖。     

骨髓间充质干细胞在骨形态发生蛋白2／注射式硫酸钙载体上的成骨

背景：将生长因子女合到支架上构建复合材料可同时具备骨诱导和骨传导作用。目的：脱察骨形态发生蛋白2／注射式硫酸钙复合载体对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导成骨的影响。方法：取生长状态良好的第2代SD大鼠骨髓间充质干细胞悬液,分3组培养：实验组将细胞悬液滴加剑骨形态发生蛋白2,注射式硫酸钙复合材料表面,对照组在细胞悬液中加入骨形态发生蛋白2,空白对照组正常培养。结果与结论：3组细胞随培养时间延长逐渐增多,实验组细胞数量最多,明显多于对照组及空白对照组（P〈0．05）。实验组培养不同时间点碱性磷酸酶活性高于对照组及空白对照组（P〈0．05）。体外实验显示骨形态发生蛋白2,注射式硫酸钙复合载体可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。     

人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化中自噬相关基因 Beclin-1 的表达简

背景：骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,但是经过长期体外培养后,骨髓间充质干细胞增殖分化能力逐渐丧失,其机制仍不明确。目的：观察人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化过程中自噬相关基因表达的变化。方法：利用表皮生长因子诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,观察其形态变化及生长情况。免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达,采用Western blot检测诱导前后人骨髓间充质干细胞自噬相关基因Beclin-1表达的变化。结果与结论：经诱导后,人骨髓间充质干细胞呈典型神经元样细胞分化,神经元特异性烯醇化酶阳性率为78.7%,胶质纤维酸性蛋白阳性率为8.1%。诱导0.5 h后处理组细胞中Beclin-1的表达水平有所增加,但1 h后开始逐渐降低。说明体外可以诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,自噬相关基因表达活性在诱导分化早期呈高表达,分化过程中逐渐降低。     

人胎盘间充质干细胞促进血管生成

背景：构建组织工程化骨组织的同时,促进种子细胞与材料复合物内血液供应的重建成为研究的关键。胎盘间充质干细胞可以作为骨组织工程研究的种子细胞,研究其分化为血管内皮细胞以及促进血管生成有着重要意义。目的：观察胎盘间充质干细胞在体外分化为血管内皮细胞以及体内促血管生成作用。方法：分离培养人胎盘间充质干细胞,鉴定其表面抗原,经血管内皮生长因子和人碱性成纤维细胞生长因子联合体外诱导胎盘来源间充质干细胞向血管内皮细胞定向分化,诱导后细胞通过内皮细胞标志物KDR、v-WF染色鉴定。8只新西兰大白兔制成桡骨中段1．5cm长的骨缺损模型,分别植入人胎盘间充质干细胞,丝素蛋白／羟基磷灰石和丝素蛋白,羟基磷灰石进行对照。植入后4,12周分别行大体观察、组织学观察和X射线观察,比较骨缺损修复以及血管生成情况。结果与结论：胎盘间充质干细胞的诱导分化形态明显改变,胞体逐步回缩,立体感增强,内皮细胞标志物KDR、v-WF染色结果阳性。胎盘来源间充质干细胞与丝素蛋白,羟基磷灰石材料复合培养植入后,4周时新骨已开始形成,12周时有部分新生骨组织形成板层骨,骨小梁形成,内可见新生血管形成,而对照组支架材料降解较慢,未见新生血管。说明胎盘来源间充质干细胞体外可以分化为血管内皮细胞,与丝素蛋白,羟基磷灰石材料联合移植能够促进移植物内血管生成,较好的修复骨缺损。     

以带血管蒂筋膜瓣与人脐带间充质干细胞和重组人骨形成蛋白2构建活性组织工程骨

背景：构建的组织工程骨块植入体内后的存活是骨组织工程面临的一个重大课题,临床上尤其缺少可行性强、可以不经体外长时间构建及预血管化而可一期应用的组织工程骨。目的：探讨以带血管蒂的筋膜瓣作为膜包裹材料、以人脐带间充质干细胞作为种子细胞,以β-磷酸三钙生物陶瓷作为支架材构建组织工程骨的可行性及加入重组人骨形成蛋白2作为细胞活性因子、Ⅰ型胶原作为细胞活性因子缓释材料后成骨能力的变化。方法：Wistar大鼠左侧L1～6背部带血管蒂的筋膜瓣包绕由β-磷酸三钙生物陶瓷、人脐带间充质干细胞、重组人骨形成蛋白2、Ⅰ型胶原构建的组织工程骨作为实验侧,右侧带血管蒂的筋膜瓣包绕接种了人脐带间充质干细胞的β-磷酸三钙生物陶瓷作为对照侧。结果与结论：大鼠实验侧4周时幼稚骨组织连接形成原始层板骨样结构,形成的原始骨组织钙化程度低。8周时,大鼠两侧骨组织均基本成熟。成骨细胞位于骨陷窝中,周围有大量骨基质呈淡紫色,局部可见Ⅰ型胶原存在,有骨髓腔结构出现,但实验侧骨组织成熟度明显高于对照侧。实验侧骨组织哈夫氏小管清晰可见,形成多个骨化中心,骨小梁、骨岛遍布其中,可见成熟板层骨、立方状排列整齐的活性成骨细胞。8周时实验侧骨小梁成熟度高、典型、清晰可见,对照侧骨小梁成熟度稍差。但2组植入物的新骨形成面积接近。提示以带血管蒂的筋膜瓣作为膜包裹材料构建组织工程骨时,重组人骨形成蛋白2及缓释剂Ⅰ型胶原可促进其骨成熟度。     

人胰岛素样生长因子1基因转染脂肪源性干细胞的效应

背景：人胰岛素样生长因子1基因对脂肪源性干细胞的增殖和分化也可能会产生有效作用。目的：验证人胰岛素样生长因子1基因转染对体外培养的脂肪源性干细胞的效应。方法：构建含人胰岛素样生长因子1基因的双顺反子真核表达载体plRES2-EGFP-hlGF-1,利用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导转染体外培养的人脂肪源性干细胞。观察基因转染后细胞增殖及形态的变化,倒置荧光显微镜观测标记基因增强绿色荧光蛋白的表达并计算转染效率,酶联免疫吸附试验检测培养上清中人胰岛素样生长因子1的浓度,免疫组织化学染色及RT-PCR检测人胰岛素样生长因子1的表达,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果与结论：测序及酶切证实真核表达载体plRES2-EGFP-hlGF-1构建正确。体外培养的脂肪源性干细胞为多种形态并存,转染后6h检测到有EGFP的表达,至60h达到高峰,转染效率为（16±3）％。细胞上清中人胰岛素样生长因子1的浓度在60h达到22．65υg／L。免疫组织化学染色及RT-PCR均检测到人胰岛素样生长因子1的表达。转染后的细胞分裂增殖加快,细胞群体倍增时间缩短,S期细胞比例增多。证实人胰岛素样生长因子1基因可有效转染脂肪源性干细胞并表达人胰岛素样生长因子1蛋白质,同时可促进细胞增殖。     

皮下移植骨髓间充质干细胞修复大鼠糖尿病足溃疡

背景：糖尿病足溃疡严重威胁患者的健康甚至生命,目前缺乏良好的治疗手段,而干细胞疗法在组织再生和创面修复方面展现出独特的优势及潜力。目的：评价骨髓间充质干细胞经创缘皮下移植对大鼠糖尿病足溃疡的治疗效果。方法：全骨髓贴壁法体外培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞至第3代,经DAPI标记。36只雄性Wistar大鼠随机分成骨髓间充质干细胞移植组、正常足溃疡对照组、糖尿病足溃疡对照组,大鼠糖尿病经腹腔注射链脲佐菌素诱导,所有大鼠在双后足背上切取一3mm×7mm矩形全层皮肤制成足溃疡模型。于骨髓间充质干细胞移植后第2,5,8,11天评估各组大鼠创面愈合情况及相关蛋白和基因水平的表达情况。结果与结论：正常足溃疡对照组的创面愈合率大于骨髓间充质干细胞移植组和糖尿病足溃疡对照组,但后2组之间无差异。冰冻切片发现骨髓间充质干细胞移植组荧光强度和区域在第5天达到高峰。苏木精-伊红染色显示第5天正常足溃疡对照组肉芽组织最厚,骨髓间充质干细胞移植组比糖尿病足溃疡对照组厚。免疫组化发现骨髓间充质干细胞移植组CD31平均小血管数目在第8天和第11天比糖尿病足溃疡对照组多（P〈0.05）;骨髓间充质干细胞移植组平均Ki-67阳性细胞数在各时间点均比糖尿病足溃疡对照组多（P〈0.01）。ELISA和RT-PCR结果均显示,正常足溃疡对照组血管内皮细胞生长因子表达水平较骨髓间充质干细胞移植组、糖尿病足溃疡对照组高。第5天和第8天骨髓间充质干细胞移植组表达水平显著高于糖尿病足溃疡对照组（P〈0.01）。说明骨髓间充质干细胞经创缘皮下移植明显促进大鼠糖尿病足溃疡的愈合,此疗效可能是通过促进创伤中血管内皮细胞生长因子的表达实现的。     

Ad-hBMP-2与Ad-hTGF-β1基因共转染骨髓间充质干细胞后的体外成骨诱导

背景：重组DNA技术的进展为骨组织工程研究的发展提供巨大动力,将其应用于组织工程骨构建可以显著提高骨修复的质量和效率。目的：拟将Ad-h BMP-2联合Ad-h TGF-β1转染骨髓间充质干细胞体外成骨诱导,观察二者在成骨过程中的相互关系。方法：以腺病毒Ad Max为基因转移载体,将携带转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2基因的高滴度腺病毒感染SD大鼠骨髓间充质干细胞,利用外源性基因编码的生长因子诱导其表达,通过RT-PCR、ELISA、MTT实验及碱性磷酸酶水平检测等方法鉴定。结果与结论：腺病毒感染骨髓间充质干细胞后RT-PCR可检测出外源基因的表达,MTT实验和碱性磷酸酶活性检测双基因共转染的骨髓间充质干细胞增殖能力最强,碱性磷酸酶活性最高。结果表明联合应用Ad-h TGF-β1和Ad-h BMP-2转染可明显促进骨髓间充质干细胞的成骨化,效果优于单用一种生长因子。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

背景：人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始,并不受伦理、法律的限制,是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。 目的：探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。 方法：采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂,体外诱导人脐带间充质干细胞;在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化,并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况,实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。 结果与结论：形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变;免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白,并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。