miR-143在膀胱癌组织中的表达及意义

【目的】探讨miR-143在膀胱癌组织中的作用及机制,为膀胱癌的临床诊治提供参考。【方法】选用体外培养的T24细胞株作为研究对象,按照处理方式分为si-COX-2转染组、miRNA-143转染组、阴性对照组、空白对照组。Transwell趋化实验和3 H-thymidine 法检测 T24细胞增殖和迁移能力,免疫印迹法检测COX-2蛋白表达变化。【结果】miR-143和si-COX-2转染T24细胞48～72 h后,细胞增殖能力较正常T24细胞相比下降36％～49％（ P ＜0．01）,迁移能力下降81％。免疫印迹结果表明,si-COX-2或miR-143转染的T24细胞内源性COX-2表达水平显著减少至正常T24细胞表达水平的0．39和0．31倍（ P＜0．01）。【结论】miR-143可能通过COX-2通路发挥对膀胱癌 T24细胞的增殖和侵袭的抑制作用并抑制COX-2的表达。提示miR-143可作为膀胱癌的治疗候选药物。     

RNA干扰沉默STAT3基因表达对膀胱癌细胞生长影响的实验研究

目的探讨应用RNA干扰技术沉默信号转导和转录激活因子3（STAT3）基因对膀胱癌T24及5637细胞的影响。方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板，构建pGenesil-1-shRNASTAT3重组质粒，转染人膀胱癌T24及5637细胞。通过半定量RT-PCR、Western印迹检测STAT3基因不同水平的表达情况，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）实验、流式细胞仪检测转染后细胞增殖及细胞周期的变化。结果成功构建pGenesil-1-shRNA—STAT3重组质粒，并成功转染T24及5637膀胱癌细胞；半定量RT-PCR、Western印迹检测结果显示，重组质粒实验组细胞的STAT3基因表达在RNA及蛋白水平上显著低于对照组（P〈0．05）；MTT实验、流式细胞仪检测结果显示，重组质粒实验组细胞的增殖明显受到抑制并出现凋亡现象。结论pGenesil-1-shRNA—STAT3转染T24及5637膀胱癌细胞后，可有效抑制STAT3的表达，并抑制膀胱癌细胞的生长及增殖。     

吡柔比星诱导膀胱癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨吡柔比星诱导膀胱癌细胞凋亡的机制。方法采用MTT法、流式细胞术、透射电子显微镜和RT-PCR技术,研究不同浓度的吡柔比星对人膀胱癌细胞株T24的抑制作用,并检测Survivin mRNA表达的变化。结果吡柔比星浓度为10．0和100．0mg／L时,对T24细胞生长的抑制率分别为89．48％和90．89％,G1期前出现明显的凋亡峰。吡柔比星能明显下调Survivin蛋白的表达水平,具有浓度依赖性。结论吡柔比星诱导膀胱癌细胞凋亡是通过抑制Survivin蛋白的表达,且在一定剂量范围内具有浓度依赖性。     

RNA激活技术介导的E—cadherin基因上调表达抑制5637膀胱癌细胞侵袭与迁移

目的探讨通过RNA激活（RNA activation,RNAa）技术上调E-cadherin基因的表达而影响人膀胱癌5637细胞的侵袭、迁移能力。方法将与E-cadherin基因启动子DNA序列互补的双链RNA分子（dsEcad）转染入5637细胞中,采用RT-PCR法及Westernblot检测E-cadherin的表达;用Transwell小室法及划痕法检测RNAa后细胞侵袭、迁移能力的改变;用细胞免疫荧光法及Western blot检测β-catenin蛋白在细胞内的重新分布结果。结果dsEcad转染5637细胞72h后E-cadherin表达显著上调,RNAa有效;5637细胞对细胞外基质的侵袭能力及迁移能力也明显下降。β-catenin在胞核及细胞质的水平明显下降并重新再分布至细胞膜上。结论RNAa技术激活E-cadherin基因表达并抑制细胞侵袭、转移等恶性行为,可作为膀胱癌或其他恶性肿瘤基因治疗的一种有效手段。     

LRIG2基因在膀胱癌中的表达及其对膀胱癌细胞株生物学行为的影响

目的了解LRIG2基因在膀胱肿瘤和正常膀胱组织中的表达及其与膀胱肿瘤分级、分期之间的关系。并将携带有LRIG2基因的重组质粒载体pCMV-LRIG2转染膀胱癌细胞株BIU-87,观察对其生物学行为的影响。方法利用半定量RT-PCR技术检测38例膀胱肿瘤组织和16例正常膀胱黏膜组织内LRIG2基因mRNA表达情况。用脂质体介导的基因转染技术,将携带有LRIG2基因的重组质粒载体pCMV-LRIG2转染至膀胱癌细胞株BIU-87,检测转染前后细胞生长力、侵袭力及黏附能力的改变。结果肿瘤组织内LRIG2mRNA的表达水平显著低于正常膀胱组织,且与肿瘤的分级、分期呈负相关。转染pCMV-LRIG2组细胞生长速度较未转染组和空载体转染组明显减慢,侵袭力显著低于未转染组和空载体转染组,而黏附能力显著高于未转染组和空载体转染组。结论 LRIG2有类似于抑癌基因的作用,通过对EFG-EGFR信号转导途径发挥负反馈抑制作用,从而抑制BIU-87细胞的生长、侵袭和转移。     

新的肿瘤转移抑制基因LASS2在不同侵袭潜能的膀胱癌细胞中表达的体外研究

目的探讨新发现的肿瘤转移抑制基因人源性长寿保障基因Ⅱ型（homo sapiens longevity assurance homologue2,LASS2）与人膀胱癌细胞侵袭潜能的关系。方法通过细胞生长曲线和体外侵袭实验,确定膀胱癌BIU-87、EJ、T24和EJ-M3细胞的增殖和侵袭能力;运用实时定量PCR法和Western blot法检测4株细胞中LASS2基因的表达。结果 4株膀胱癌细胞中,EJ-M3的增殖和侵袭能力最强;增殖和侵袭能力高的细胞系EJ-M3和BIU-87的LASS2mRNA表达降低（P〈0.001）,而在低转移能力的人膀胱癌细胞株T24和EJ细胞中则相对较高表达。结论 LASS2基因表达的降低,可能与膀胱癌细胞的增殖和侵袭有关。     

膀胱上皮特异性重组腺病毒的构建及其对膀胱癌细胞的抑制作用

目的构建特异作用于尿路上皮细胞的重组腺病毒并研究其对膀胱癌细胞株的抑制作用。方法 RT-PCR测定人类uroplakinⅡ（hUPⅡ）基因的表达模式以及柯萨奇病毒腺病毒联合受体（CAR）对多重细胞系的影响。瞬时转染和荧光素酶检测分析技术测定hUPⅡ启动子的组织特异性。构建重组腺病毒Ad-UPⅡ-E1A和Ad-UPⅡ-Null,限制性内切酶酶切分析和PCR技术检测其构建的正确性。Western blot分析细胞感染重组腺病毒后腺病毒E1A蛋白在膀胱癌细胞株BIU-87中的表达。测定重组腺病毒Ad-UPⅡ-E1A对于膀胱癌细胞系BIU-87细胞的抑制作用。结果膀胱癌细胞系BIU-87细胞表达hUPⅡ和CAR,其中hUPⅡ启动子具有高活性。在细菌技术上使用同源重组,将hUPⅡ启动子和E1A基因插入到5型的重组腺病毒的基因组中。在BIU-87细胞感染重组腺病毒Ad-UPⅡ-E1A后,E1A蛋白的表达呈强阳性。MTT分析证实重组腺病毒Ad-UPⅡ-E1A抑制了膀胱癌BIU-87细胞的生长。结论 hUPⅡ启动子有高组织特异性。重组腺病毒Ad-UPⅡ-E1A对膀胱癌细胞系BIU-87细胞有抑制作用。     

敲低卷曲螺旋结构域蛋白34表达对膀胱癌T24细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的研究应用慢病毒介导的RNA干扰(RNA interference)技术敲低卷曲螺旋结构域蛋白34(CCDC34)的表达,分析其对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响。方法选取膀胱癌T24细胞分别同时感染阴性对照si RNA(阴性对照组)和CCDC34-si RNA(CCDC34干扰组)慢病毒载体,荧光显微镜下观察慢病毒感染效率;实时定量PCR和Western blot验证CCDC34的干扰效率;Brd U掺入实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测干扰CCDC34表达对T24细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。结果与阴性对照组相比,感染CCDC34-si RNA的T24细胞中CCDC34 m RNA及蛋白表达水平均显著下降。Brd U实验显示CCDC34干扰组的细胞增殖能力较阴性对照组受到显著抑制(P<0.05),且细胞凋亡显著增加[(8.77±0.38)%vs.(3.91±0.08)%,P<0.01]。划痕实验显示,慢病毒感染24 h后CCDC34干扰组的细胞迁移率显著低于阴性对照组(0.40±0.04 vs.0.79±0.01,P<0.01)。Transwell侵袭实验同时显示CCDC34干扰组膀胱癌T24细胞的侵袭率也显著低于阴性对照组(1.44±0.03 vs.1.63±0.05,P<0.05)。结论慢病毒介导的RNA干扰技术可下调CCDC34蛋白在T24细胞中的表达,显著抑制了膀胱癌T24细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进了肿瘤细胞的凋亡。CCDC34有望成为膀胱癌生物标记物和治疗的潜在新靶点。     

FBXO22对乳腺癌细胞侵袭迁移能力的影响

目的探究FBXO22基因沉默后对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭迁移能力的影响,并初步研究其相关分子机制。方法利用小干扰RNA(siRNA)技术制备FBXO22小片段干扰RNA转染乳腺癌MDAMB-231细胞,下调FBXO22基因表达,通过蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞转染效率,细胞划痕实验检测干扰FBXO22基因表达水平对乳腺癌细胞侵袭能力的影响,Transwell小室迁移实验检测下调FBXO22基因表达水平对乳腺癌细胞迁移能力的影响,Western blot法检测下调FBXO22基因表达水平对乳腺癌细胞侵袭迁移相关蛋白表达的影响。结果 FBXO22-siRNA转染后乳腺癌MDA-MB-231细胞中FBXO22蛋白表达明显下降,迁移侵袭能力降低,E-cadherin蛋白水平升高,而波形蛋白的蛋白水平降低,基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9水平下降。结论下调FBXO22基因水平能抑制乳腺癌细胞的迁移侵袭能力。其潜在的机制可能为FBXO22基因表达下调抑制了MDA-MB-231上皮细胞-间充质转化进程,并使细胞转移相关重要蛋白--MMP-2和MMP-9表达减少。     

有效抑制T24细胞survivin表达的小RNA筛选及其载体构建

目的:筛选有效抑制T24细胞survivin表达的si RNA序列,并构建其质粒载体,为后续研究提供基础。方法:设计并合成针对survivin的si RNA,转染T24细胞。用RT-PCR方法测定干扰后细胞survivin mRNA表达,Western-blot方法测定干扰后survivin蛋白表达,比较其抑制率,筛选出有效抑制靶基因表达的si RNA,并构建相应的质粒载体(shRNA)。结果:si RNA转染T24细胞有较高的转染效率;②半定量RT-PCR:1号si RNA干扰T24细胞48h后survivin基因mRNA表达最低,有显著差异(P<0.05),抑制率70%左右。③Western-blot:1号si RNA干扰T24细胞72h后survivin蛋白表达最低,有显著差异(P<0.05),抑制率60%左右。④Western-blot方法测定T24细胞转染1号si RNA后连续7d survivin蛋白表达量变化:干扰后48~96h survivin蛋白表达量最低,有显著差异(P<0.05)。⑤以1号si RNA序列构建质粒载体并转染T24细胞成功,转染效率较高,质粒本身对细胞无毒无害。结论:所设计、合成的si RNA中,1号survivin-si RNA对T24细胞sur-vivin表达有明显抑制作用;②根据实验结果构建的质粒载体及其对照质粒可用于T24细胞转染,供进一步实验研究。     

富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1基因特异性RNA干扰表达载体的构建、鉴定和稳定株筛选

背景：有研究表明富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains1,LRIG1）基因在神经胶质瘤细胞中呈低表达,LRIG1基因过表达后对神经胶质瘤细胞的LRIG1mRNA和蛋白表达均明显增强和抑制其生物学行为,但却很少有研究从阻断LRIG1基因的表达的角度进行论证。目的：构建针对LRIG1基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人脑胶质瘤GL15细胞系,观察其对目的基因LRIG1表达的影响。方法：根据GenBank提供的LRIG1基因序列设计2条RNA干扰序列,命名为LRIG1-shRNA1和LRIG1-shRNA2,并设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为pGenesil2-negativeshRNA。合成各自的寡核苷酸链,退火后与pGenesil2质粒载体连接,转化扩增后测定序列。用不同浓度的G418作用于GL15细胞确定G418对GL15细胞的筛选浓度。将3种重组表达载体转染GL15细胞,G418筛选后挑单克隆并扩增获得稳定株。Western blot检测LRIG1蛋白的表达。结果与结论：构建的重组pGenesil2-LRIG1-shRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明其序列插入正确。转染pGenesil2-LRIG1-shRNA1（LRIG11）细胞和pGenesil2-LRIG1-shRNA2（LRIG12）细胞LRIG1蛋白表达水平较阴性对照组pGenesil2-negativeshRNA分别下降47.9%（P〈0.01）和32.8%（P〉0.05）。结果证实,实验成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体pGenesil2-LRIG1-shRNA1,其转染GL15细胞后可抑制LRIG1的表达。     

Hiwi基因在膀胱移行细胞癌组织切片中的表达

目的检测Hiwi基因在膀胱移行细胞癌组织切片中的表达情况。方法应用免疫组织化学方法，对Hiwi基因在膀胱癌组织切片中的表达情况进行检测。结果Hiwi蛋白表达的阳性细胞百分率在不同临床分期的膀胱移行细胞癌即浅表性膀胱癌（Tis、Ta、T1）和浸润性膀胱癌（T2、T3、T4）之间存在显著性差异，（P〈0．01）。Hiwi蛋白的阳性表达率随病理级别增高而递增，不同病理分级（G1、G2和G3）之间存在显著性差异，（P〈0．01）。结论Hiwi基因可能成为膀胱癌一个潜在的基因治疗靶点，并作为基因治疗靶点的体外实验研究提供了实验基础。     

坎地沙坦对膀胱癌细胞株BIU-87侵袭力和黏附力的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）拮抗剂坎地沙坦对膀胱癌BIU-87细胞株的侵袭力和黏附力的影响。方法采用免疫组化SABC法检测膀胱癌BIU-87细胞株AT1R的表达,用Transwell法检测细胞侵袭力,用细胞同质黏附实验检测细胞黏附力。结果 AT1R拮抗剂坎地沙坦能降低BIU-87细胞株的侵袭能力和黏附能力。结论 AT1R拮抗剂有可能通过降低肿瘤细胞的侵袭、黏附能力和抑制血管生成而达到抗癌作用,AT1R拮抗剂将来可能会成为一种抗癌治疗的新方法。     

吉非替尼和NS398对前列腺癌PC-3M细胞增殖和侵袭力影响的研究

目的应用表皮生长因子受体(EGFR)特异性阻断剂吉非替尼(Gefitinib)和环氧化酶2(COX-2)特异性阻断剂NS398单独或联合作用于前列腺癌PC-3M细胞,观察对细胞增殖和侵袭能力的影响及可能机制研究。方法采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)和Transwell检测Gefitinib和NS398应用对细胞增殖和侵袭能力的影响,应用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot法检测药物应用前后基质金属蛋白酶9(MMP-9)、表皮生长因子(VEGF)基因和蛋白表达水平的变化。结果 MTT结果显示Gefitinib或NS398都可抑制PC-3M细胞增殖(P<0.05),两者联合应用作用更明显(P<0.01),Transwell结果表明两种阻断剂都能在一定程度上抑制细胞侵袭能力(P<0.05),联合应用后抑制作用更显著(P<0.01),qRT-PCR和Western blot结果提示,联合应用Gefitinib和NS398对MMP-9、VEGF的抑制作用明显高于单独应用(P<0.01)。结论 Gefitinib和NS398联合应用可显著抑制PC-3M增殖和侵袭转移,可能与抑制VEGF和MMP-9表达有关。     

印记基因SLC22A18的表达与乳腺癌侵袭能力的关系

目的:研究印记基因SLC22A18(solute carrier family 22,member 18)在乳腺癌中的表达情况及其与乳腺癌侵袭能力的关系。方法:采用Transwell方法评估2种不同恶性程度的乳腺癌细胞株MDA-MB-231(恶性程度高)和MCF-7(恶性程度低)的侵袭转移能力。分别采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测SLC22A18的mRNA和蛋白在这2种乳腺癌细胞株中的表达情况。结果:MDA-MB-231细胞株恶性程度高,穿过膜的细胞多,侵袭能力强;MCF-7细胞株恶性程度低,穿过膜的细胞少,侵袭能力弱;SLC22A18在MCF-7中的mRNA和蛋白表达水平高于MDA-MB-231;差异有统计学意义(P0.01)。结论:印记基因SLC22A18的表达与乳腺癌细胞的侵袭能力相关,该基因有望作为一个抑癌基因抑制乳腺癌的转移。     

氟伐他汀诱导人膀胱癌细胞凋亡抑制细胞增殖与迁移的研究

目的研究羟甲戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂——氟伐他汀在体外对人膀胱癌T24细胞凋亡、增殖和迁移及侵袭能力的影响,并探讨相关分子机制。方法 MTT法检测氟伐他汀对T24细胞增殖的影响;流式细胞术（PI和Annexin V双染法）检测细胞凋亡率的变化;划痕愈合和Transwell试验检测氟伐他汀对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响;Western blot检测Bax、Cleaved-caspase-3等蛋白的表达情况。结果氟伐他汀在体外能显著抑制T24细胞的增殖,成明显浓度和时间依赖性;可以显著诱导肿瘤细胞凋亡;能显著抑制T24细胞的迁移和侵袭能力。结论氟伐他汀能显著诱导T24细胞发生凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。