携RGDS的脂膜氟烷超声造影剂增强血栓显影的实验研究

目的探讨携RGDS的脂膜超声造影剂对体外血栓的显影效果。方法健康人体新鲜血块10块，大小2cm×1cm×1cm，以蠕动泵为循环动力，以4％琥珀酰明胶注射液为循环液，输液器为材料建立一密闭式体外循环系统，模拟人体体循环，血块置于容器内，观察携RGDS的脂膜超声造影剂和非靶向脂膜超声造影剂对血栓的显像效果。结果模拟体循环时间30s，二维超声显示，非靶向超声造影剂组血栓表面线状回声增强，内部无增强；靶向超声造影剂组血栓表面回声增强，内部回声显著增强；超声检测后行冰冻切片显微镜观察，非靶向造影剂组100倍下观察，血栓切片边缘有少量微泡黏附，400倍下，可见血栓纵隔缝隙内少量微泡存在；靶向组100倍下即可见到密集的微泡分布，400倍下血栓纵隔缝隙内密集线状分布的微泡。结论携RGDS的脂膜超声造影剂可显著增强新鲜血栓超声显像。     

低频超声介导微泡造影剂对体外血栓的助溶作用

目的探讨运用微泡造影剂联合低频治疗超声对组织纤溶酶原激活物(tissue-plasminogenactivator,t-PA)体外溶栓的促进作用,并比较白蛋白和脂膜两种不同微囊微泡的超声助溶作用。方法取人全血0.8 ml制成质量约200~300 mg血栓共100份,采用频率20 kHz超声治疗仪、白蛋白和脂类包囊的两种微泡进行分组治疗。计算治疗前后的血栓质量,得到溶栓率,进行统计学分析。结果组间比较溶栓率,超声+t-PA+脂膜微泡组[(49.82±5.74)%]显著高于单纯超声辐照组[(24.72±4.83)%]、单纯t-PA组[(35.66±3.34)%]及超声+t-PA组[(42.06±4.20)%,P<0.01];超声+t-PA+白蛋白微泡组溶栓率(48.47±8.58)%显著高于单纯超声组、单纯t-PA组(P<0.01),高于超声+t-PA组(P<0.05);超声+t-PA+白蛋白类微泡组与超声+t-PA+脂膜微泡组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论脂膜和白蛋白包裹的微泡在低频超声介导下对t-PA助溶体外血栓均有显著效果,但两种不同微囊微泡的助溶效果间差异无统计学意义。     

治疗超声介导微泡造影剂对体外血栓的助溶研究

目的运用本科自制脂膜氟烷超声造影剂“脂氟显”结合治疗超声对组织纤溶酶原激活物(tissue-plasminogen activator,t-PA)助溶体外血栓的有效性进行研究。方法取健康人全血制成质量约200~300mg血栓,频率1MHz治疗超声结合“脂氟显”和t-PA进行溶栓治疗。计算治疗前后的血栓质量,得到溶栓率,进行统计学分析。结果组间比较溶栓率超声+t-PA+“脂氟显”组(50.05±6.59)%与单纯超声辐照(24.14±3.93)%、单纯t-PA组(35.66±3.34)%、超声+t-PA组(41.85±4.78)%及超声+“脂氟显”组(29.51%±5.17)%间差异均有十分显著性意义(P<0.01);超声+“脂氟显”组与单纯超声辐照组间比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论微泡超声造影剂在治疗超声介导下对t-PA助溶体外血栓有显著效果。     

亲血栓性靶向超声造影剂的制备及体外实验初步研究

目的 制备亲血栓性靶向超声造影剂，探讨其体外寻靶的特点和规律。方法 在自制的白蛋白超声造影剂的基础上，采用交连法制备血栓靶向微泡造影剂。体外实验分3组：A组，将靶向造影剂滴加于健康人新鲜血凝块上，光镜下观察微泡与血凝块的粘附情况；B组对照，普通白蛋白造影剂；C组对照，6—肽阻断实验。结果 A组微泡在血凝块外围形成一条凝聚带，并顺着网格状的纤维素带延伸到血块内部，而两对照组均未见微泡与血凝块的结合。结论 采用交连法可制备亲血栓性靶向白蛋白超声造影剂；该造影剂微泡在体外能与人新鲜血凝块高效特异结合。     

亲血栓性靶向超声造影剂的鉴定及体外寻靶实验研究

目的 制备亲血栓性靶向超声造影剂，探讨其体外寻靶的特点和规律。方法 在自制的白蛋白氟碳超声造影剂的基础上，采用交连法将带有荧光标记的6-肽(FITC-KV-6)与自制的白蛋白氟碳微泡结合，制备血栓靶向微泡造影剂。体外实验分3组，A组：将带有FITC-KV-6的造影剂滴加于健康人新鲜血凝块上，普通光镜和荧光显微镜下观察微泡与血块的黏附情况；B组对照：普通白蛋白氟碳造影剂；C组对照：6-肽阻断实验。结果 靶向微泡荧光免疫染色实验为阳性，对照组为阴性。体外实验显示，A组：微泡在血凝块外围形成一条凝聚带，并顺着网格状的纤维素带延伸到血块内部，而2个对照组均未见微泡与血凝块的结合。结论 采用交连法可制备亲血栓性靶向白蛋白超声造影剂；该造影剂微泡在体外能与人新鲜血凝块高效特异结合。     

微泡超声爆破助溶血栓机制的离体研究

目的用荧光分子探针标记脂膜超声微泡,荧光显微镜下观察并追踪荧光微泡在超声作用下于血栓表面及内部分布情况,为超声联合微泡对体外血栓的助溶机制提供病理学依据。方法将染料标记于脂膜微泡,结合发射频率1MHz、输出声功率1.0W/cm2治疗超声用于离体溶栓实验。实验分为单纯微泡组和超声联合微泡两组,称量血栓失重量比较两组溶栓率,荧光显微镜观察两组血栓表面及内部的荧光分布强度及密度,最后血栓标本进行HE染色后光镜观察。结果单纯微泡组和超声联合微泡组的溶栓率分别为(21.73±2.78)%、(29.51±5.17)%,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。荧光显微镜下单纯微泡组血栓表面呈明亮荧光带,内部仅见几个细小荧光颗粒;超声联合微泡组血栓周边形成更为明亮宽大的荧光带,内部有较为密集的荧光颗粒分布。光镜下超声联合微泡组血栓表面见微孔和撕裂,内部可见不规则的裂隙,而单纯微泡组血栓无此改变。结论脂膜微泡在治疗超声连续爆破作用下有渗入血栓内部的倾向,这可能更有助于超声发挥助溶效应。     

携尿激酶靶向微泡造影剂的体外溶栓实验研究

目的 制备携尿激酶及精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDS)的靶向溶栓造影剂,并研究其对体外血栓的溶解作用.方法 通过直接连接法将尿激酶、RGDS连接到造影剂声诺维上.制备血块,分为4组,分别注入生理盐水、声诺维、尿激酶及所制备的造影剂,计算处理前后的血块质量差,算出溶栓率,进行统计学分析.结果 荧光显微镜及流式细胞仪检测结果均显示,声诺维成功携带了尿激酶及RGDS,携带率分别为(72.3±9.4)%、(64.6±10.2)%.加入所制备的携药造影剂组溶栓前后血块质量改变显著,差异具有统计学意义,血栓溶解率(18.4±3.2)%.结论 携尿激酶及RGDS的靶向溶栓造影剂成功制备.所制备的造影剂在体外具有血栓溶解作用.     

动脉血栓靶向超声显像的体内实验研究

目的探讨白蛋白血栓靶向超声造影剂体内增强动脉血栓超声显像的效果.方法采用FeCl3溶液诱发30只健康新西兰大白兔腹主动脉非梗阻性新鲜血栓形成;经耳缘静脉团注0.04 ml/kg的白蛋白超声造影剂进行超声造影,分为靶向组(20只)和非靶向组(10只);采用视觉观察评价血栓显像增强效果.结果 29只(29/30)兔模型建立成功;造影后视觉观察,靶向组18例达到2级增强效果,1例为1级增强效果,1例死亡;非靶向组仅2例达到1级增强效果,两组比较差异显著(P<0.01).结论白蛋白血栓靶向超声造影剂可显著增强兔腹主动脉内新鲜血栓超声显像效果.     

亲血栓性靶向超声造影剂增强兔腹主动脉新鲜血栓显像的实验研究

目的探讨亲血栓性白蛋白靶向超声造影剂体内增强兔腹主动脉新鲜血栓显像的效果.方法采用三氯化铁(FeCl3)溶液诱发20只健康新西兰大白兔腹主动脉非梗阻性新鲜血栓形成;经耳缘静脉团注0.04 ml/kg的白蛋白靶向超声造影剂进行声学造影;采用目测观察和视频灰阶分析技术,评价血栓显像的增强效果.结果造影后目测观察,亲血栓性白蛋白靶向超声造影剂对腹主动脉新鲜血栓增强显影达10 min以上,灰阶值为(98.463±6.3)dB,与造影前0 s[灰阶值(18.741±2.86) dB]比较相差非常显著(P＜0.001);普通白蛋白造影剂造影后血栓超声显像效果改善不明显,但灰阶值升高,为(28.862±2.15)dB,与造影前0 s比较相差显著(P＜0.05),与靶向造影剂造影后灰阶值比较相差非常显著(P＜0.001).结论亲血栓性白蛋白靶向超声造影剂可显著增强兔腹主动脉内新鲜血栓超声显像效果.     

超声与微泡在血栓性疾病诊断与治疗中的作用

临床上早期准确地检出血栓并加以治疗,对于降低血栓并发症的发生率非常重要。采用特异性配体(包括抗体、受体蛋白等)与白蛋白或脂质体连接形成靶向超声造影剂可能是一种很有前途的导向诊断和治疗方法。制备一种能与血栓靶向黏附的超声微泡以及寻找一种适当强度的超声能量来有效诱导增强超声空化作用是达到靶向诊断与助溶治疗的条件。     

超声介导下携尿激酶靶向微泡在兔动脉内溶栓后的电镜观察

目的 探讨携尿激酶靶向微泡溶解兔动脉内血栓后下的形态学改变。方法 在24只新西兰大白兔单侧股动脉制作富含血小板的混合性血栓,分成4组,每组6只:①单纯超声照射组(US);②单纯尿激酶静脉注射组(UK);③超声照射+微泡造影剂+尿激酶静脉注射组(US+ M+ UK);④超声照射+RGDS微泡造影剂+尿激酶组(US+ R+ UK)。将RGDS、微泡造影剂(SonoVue)和尿激酶通过直接联合法配制成携尿激酶的靶向微泡,超声照射30 min,多普勒血流仪监测血流量变化评价溶栓效果,然后对其行HE染色、电镜检查。结果 US+ R+ UK组血流量完全恢复,实现完全再通（P＜0.001）,HE染色显示血栓完全溶解,扫描电镜检查示血栓的纤维网状结构破坏,透射电镜显示血栓的大量降解碎片。结论血栓纤维蛋白网状结构的破坏、纤维蛋白的溶解是携尿激酶靶向微泡在兔动脉内溶解血栓的主要电镜表现。     

持续灌注微泡并低强度超声介导体外血栓溶栓的实验研究

目的研究持续灌注微泡并低强度超声介导体外血栓的溶栓效果。方法构建体外循环系统,新鲜牛血栓随机分为5组。组1为低强度超声联合导管内持续灌注微泡和尿激酶进行溶栓;组2为低强度超声联合血栓内一次性注射微泡和尿激酶进行溶栓;组3为低强度超声联合导管内持续灌注尿激酶进行溶栓;组4为低强度超声联合导管内持续灌注微泡进行溶栓;对照组为导管内持续灌注尿激酶进行溶栓。统计分析各组的溶栓率和溶解面积,观察血栓内部红细胞分布情况及纤维蛋白网结构的完整性。结果组1溶栓率及溶栓面积均高于其他各组,差异均有统计学意义(P均<0.05);其他各组之间均无显著差异。该组HE染色镜下显示红细胞分布更松散,免疫荧光染色镜下可见较多纤维蛋白网结构断裂。结论在体外实验中,低强度超声联合持续灌注微泡能够增强尿激酶的溶栓效果。     

Low-frequency ultrasound induces nonenzymatic thrombolysis in vitro.

OBJECTIVE: To evaluate whether ultrasound, applied over a distance of several centimeters and in the absence of thrombolytic agents, may have a thrombolytic effect on blood clots. METHODS: Low-frequency (20 kHz) continuous wave ultrasound at different intensity levels (0.15-1.2 W/cm2) and exposure times (5, 10, and 20 minutes) was assessed for its potential to induce thrombolysis of fresh human blood clots. The ultrasound effect was also studied in combination with recombinant tissue-type plasminogen activator-mediated thrombolysis. Experiments were carried out in a flow model in degassed sodium phosphate buffer at 37 degrees C at a distance of 3 cm from the ultrasonic probe to the blood clots. Regardless of ultrasound exposure times, blood clots in all experimental groups and the control group were left in the flow system for 20 minutes. RESULTS: The use of ultrasound alone showed a significant thrombolytic effect compared with the control group, with a statistically significant effect at 0.15 W/cm2 and exposure of 10 minutes (P = .02). There was a clear correlation between the extent of weight loss and the chosen intensity level and exposure time. Complete disruption in 8 of 10 blood clots occurred at 1.2 W/cm2 within 10 min. Addition of ultrasound to recombinant tissue-type plasminogen activator-mediated thrombolysis significantly enhanced thrombolysis compared with application of recombinant tissue-type plasminogen activator or ultrasound alone (P = .0001), with the results pointing toward a purely additive, nonsynergistic effect of the 2 treatment modalities. Lysis was more effective in fresh thrombi. CONCLUSIONS: The use of low-frequency ultrasound alone, without addition of a thrombolytic drug, has the potential to induce thrombolysis over a distance. Combination of ultrasound with recombinant tissue-type plasminogen activator is superior to either treatment alone. Ultrasound is a promising tool for developing an alternative or additional treatment modality for acute cerebral vessel occlusion.     

赫赛汀靶向载阿霉素/印度墨水多功能分子探针的制备及其对乳腺癌成像诊断及治疗的实验研究

目的制备赫赛汀靶向载阿霉素/印度墨水（DOX-ink-HER-NBs）多功能分子探针,评估其在乳腺癌动物模型成像诊断及治疗中的应用价值。 方法通过薄膜水化、碳二亚胺法制备DOX-ink-HER-NBs多功能纳米造影剂,检测其基本物理特性。通过激光共聚焦显像及流式细胞术检测靶向纳米分子探针体外靶向乳腺癌细胞能力。选取6周龄雌性BALB/c裸鼠构建乳腺癌移植瘤模型。将18只移植瘤裸鼠随机分为靶向组（DOX-ink-HER-NBs）、非靶向组（DOX-ink-NBs）和对照组（PBS）,每组6只,通过尾静脉分别注射200 μl DOX-ink-HER-NBs混悬液、DOX-ink-NBs混悬液、PBS,应用超声诊断仪及光声成像系统观察分子探针在裸鼠体内超声、光声双模态显像情况。通过激光共聚焦对组织冰冻切片的显像,观察分子探针在肿瘤组织内的分布。对18只移植瘤裸鼠尾静脉注射200 μl DOX-ink-HER-NBs、DOX-ink-NBs、PBS,配合超声辐照,每3天注射治疗一次,持续治疗7次,观测分子探针抑制移植瘤生长的效果。 结果DOX-ink-HER-NBs分子探针粒径约（621.23±42.56）nm,电位约（-25.34±2.56）mV。流式细胞结果显示靶向组的体外寻靶率较非靶向组、对照组高［（71.64±9.32）% vs （16.99±4.84）%、（9.29±3.15）%］,差异均有统计学意义（P均<0.0001）。裸鼠移植瘤体内实验结果表明,与非靶向组和对照组相比,靶向分子探针能够大量聚集在肿瘤组织细胞周围。靶向组移植瘤部位的超声造影信号强度显著强于非靶向组及对照组［（60.33±4.51）dB vs （15.67±4.04）dB、（7.00±2.00）dB］,差异均有统计学意义（P均<0.0001）。与非靶向组及对照组比较,靶向组移植瘤的光声信号显像明显［（0.8567±0.0950）a.u. vs（0.3233±0.0950）a.u.、（0.1033±0.0153）a.u.］,差异均有统计学意义（P=0.0002、<0.0001）。与非靶向组和对照组相比,靶向组肿瘤抑制率最高［（62.93±6.96）% vs（22.73±8.05）%、（18.33±15.88）%］,差异均有统计学意义（P=0.0043、0.0026）。 结论本研究成功制备了DOX-ink-HER-NBs多功能分子探针。在赫塞汀的介导下纳米分子探针可聚集于靶组织,实现乳腺癌的超声及光声双模式分子成像,同时协同发挥抗肿瘤效应,为乳腺癌的分子诊断和可视化靶向治疗及疗效评估提供了新的思路。     

Therapeutic ultrasonic microbubbles carrying paclitaxel and LyP-1 peptide: preparation, characterization and application to ultrasound-assisted chemotherapy in breast cancer cells

The aim of this work was to develop a novel targeted drug-loaded microbubble (MB) and to investigate its chemotherapy effect in vitro. Paclitaxel (PTX)-loaded lipid MBs were prepared by a mechanical vibration technique. The LyP-1, a breast tumor homing peptide, was coated onto the surface of PTX-loaded MBs through biotin-avidin linkage. The resulting targeted drug-loaded MBs were characterized and applied to ultrasound-assisted chemotherapy in breast cancer cells. Our results showed the ultrasonic MBs were able to achieve 43%-63% of drug encapsulation efficiency, depending on drug loading amount. The binding affinity assay indicated the attachment of targeted MBs to human MDA-MB-231 breast cancer cells was highly efficient and stable even with ultrasonic irradiation on. The cellular uptake efficiency of payload in targeted MBs was 3.71-, 4.95-, 7.43- and 7.66-fold higher than that of non-targeted MBs at the applied ultrasound time of 30, 60, 90 and 120 s, respectively. In addition, the cell proliferation inhibition assay showed the cell viability of targeted PTX-loaded MBs was significantly lower than that of non-targeted PTX-loaded MBs and non-targeted unloaded MBs when ultrasound was utilized. In conclusion, the study indicated the LyP-1-coated PTX-loaded MBs significantly increased the antitumor efficacy and can be used as a potential chemotherapy approach for ultrasound-assisted breast cancer treatment.(E-mail: hr.zheng@siat.ac.cn)     

靶向超声造影剂促进反义基因转染的体外研究

目的 探讨超声破坏造影剂微泡联合半乳糖化多聚赖氨酸(G-PLL)对基因治疗肝癌的靶向促进作用.方法 将合成的超声造影剂微泡、G-PLL及c-myc反义寡核苷酸(ASODN)耦联物,结合超声辐照作用于表达c-myc基因的人肝癌及人肺癌细胞株进行体外效应研究.观察细胞形态学改变及耦合物与细胞结合情况并检测c-myc基因的表达情况.结果 镜下显示肝癌细胞较肺癌细胞更易于与耦联物结合,多数细胞呈凋亡改变.经超声辐照,耦联物作用后的人肝癌及肺癌细胞c-myc基因表达量均有降低,而G-PLL对肝癌细胞c-myc基因表达有明显抑制作用.结论 超声辐照下,造影剂结合G-PLL及反义基因耦联物可靶向性促进反义基因转染肝癌细胞.     

不同占空比和声压超声波溶解体外血栓的实验研究

目的观察研究不同超声占空比和超声声压对超声联合微泡溶解体外血栓的影响。方法取健康志愿者全血标本70 ml,分成70份,每份1 ml,在37℃恒温水浴箱内浸浴3 h后,将血栓存储于5°C的冰箱3 d,以获得稳定的血栓。样本共分成6个辐照组和1个对照组。其中4组辐照组的超声输出声压固定为5.47 mPa,将治疗超声仪的占空比分别设为0.216%、1.080%、3.600%、7.200%四种。另外2组辐照组固定治疗超声仪的占空比为7.200%,将治疗超声仪的超声强度分别设为3.75 mPa、2.80 mPa两种。对照组无超声处理。各组血栓治疗后立刻取出,计算各组溶栓率并进行比较。结果在超声输出声压和其它参数设置一定的条件下,占空比越高溶栓率越高。当占空比设为7.200%的条件时,微泡联合治疗超声的溶栓率最高,与其它各组比较均有显著性差异(P<0.01)。在超声占空比和其它参数设置一定的条件下,超声输出声压越大溶栓率越高。结论在治疗超声联合微泡治疗体外血栓实验中,在一定的超声治疗条件下,超声波占空比越高,溶栓率越高;超声输出声压越大,溶栓率越高。