壳聚糖复合支架材料的生物学功能：本刊中文部

5 壳聚糖-胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学变化 推荐理由：实验采用成软骨诱导培养基诱导骨髓间充质细胞为骨软骨祖细胞,联合新型支架材料壳聚糖-胶原蛋白复合物修复兔关节软骨缺损,前期工作表明移植物能够较好的修复软骨缺损,组织学指标达到修复要求,此方法为临床软骨损伤修复提供了思路,具有深入研究的价值。     

软骨源形态发生蛋白基因转染自体骨髓间充质细胞修复关节软骨缺损

背景:以支架或干细胞在一定程度上能够修复软骨缺损,但是研究中发现较大块的缺损修复效果还达不到令人满意的程度.基因转染后的干细胞能够不断的释放生长因子有可能够为软骨缺损研究带来突破.目的:进一步验证软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞是否会促进体内兔软骨修复.方法:从兔骨髓内分离获得骨髓间充质干细胞,脂质体感染的方法将软骨源形态发生蛋白基因转染到骨髓间充质干细胞中.实验组移植转染后的细胞;单纯骨髓间充质干细胞组移植未转染的骨髓间充质干细胞;空白对照组缺损区不移植细胞.术后行组织学检测及组织学评分分析修复情况.结果与结论:体内修复过程中,软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞促进了软骨再生.透明软骨填充了软骨缺损区,并且深部区域显示了软骨下成骨.透明软骨的重建区域优于单纯骨髓间充质干细胞移植组.组织学评分实验组高于骨髓间充质干细胞对照组和空白组.提示转染软骨源形态发生蛋白基因的骨髓间充质干细胞能够促进和提高关节软骨的改建和修复.     

骨髓间充质干细胞复合多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损

背景：多肽水凝胶因为其具有良好的可塑型性,能够与损伤部位很好的无缝隙结合,所以采用该材料作为支架是骨、软骨组织工程中一种可行的探索。目的：骨髓间充质干细胞联合新型可注射多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损,观察其修复效果。方法：首先分离培养兔骨髓间充质干细胞,兔左侧膝关节处制备直径5 mm,深3 mm的全层骨-软骨缺损模型;右侧造模后空置作为对照。实验分为3组,单纯自组装多肽凝胶移植组,自组装多肽凝胶+成软骨因子组和自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组。采用的成软骨因子包括转化生长因子β1,地塞米松和胰岛素样生长因子1,三者混合后加入到自组装多肽凝胶或骨髓间充质干细胞中。于处理后12周时处死动物行大体及组织学观察、X射线摄片、免疫组织化学法进行组织学评分评估修复情况。结果与结论：单纯自组装多肽凝胶移植在12周后显示出非常好的修复效果,可见番红O染色,Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色强度以及组织学评分明显高于其他组(P <0.05)。自组装多肽凝胶+成软骨因子组修复效果较好,与自组装多肽凝胶组相似,但其修复区域蛋白聚糖表达比对照组明显升高(P <0.01)。自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组修复效果不佳,12周未能完全修复缺损区域,与单纯自组装多肽凝胶组比较骨赘的形成有所增加。结果表明,单纯自组装多肽凝胶能够在原位修复骨软骨缺损并促进软骨修复,提示以自组装多肽凝胶支架移植有望提高目前修复软骨缺损的效果。     

Ⅰ/Ⅲ型胶原膜联合自体骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨缺损

研究表明Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原都有利于骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和分化.目的:观察Ⅰ/Ⅲ型胶原膜联合自体骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨缺损的可行性.方法:取24只新西兰大白兔制作双膝股骨滑车直径3.8 mm、深2 mm关节软骨缺损模型,分为2组:实验组缺损区植入Ⅰ/Ⅲ型胶原膜-自体骨髓间充质干细胞复合物,对照组缺损区植入单纯Ⅰ/Ⅲ型胶原膜.结果与结论:膝关节股骨标本组织学染色显示,实验组植入8周时为类透明软骨修复,12周时接近于正常软骨;对照组植入8周时以纤维样组织修复为主,12周时为纤维软骨修复.实验组植入后8,12周组织学评分均明显高于对照组(P<0.001).表明运用Ⅰ/Ⅲ型胶原膜-自体骨髓间充质干细胞复合物可修复关节软骨缺损.     

不同来源骨髓间充质干细胞的体内成软骨

背景：骨髓间充质干细胞经体外诱导后可修复软骨缺损,但目前采用的种子细胞多来源于自体或同种异体。目的：观察同种异体及异种来源的骨髓间充质干细胞诱导成软骨后修复喉软骨缺损的效果。方法：分别取人胚胎骨髓间充质干细胞和刚出生兔骨髓间充质干细胞的第3代细胞种植于聚乳酸-羟基乙酸共聚物生物支架上,并加入转化生长因子β1和软骨形态发生蛋白诱导成软骨细胞。将两种细胞体系植入新西兰白兔体内,并于植入后4,8周取材行大体、组织学观察。结果与结论：植入后4,8周人胚胎骨髓间充质干细胞和兔骨髓间充质干细胞均有新生组织填充,经组织学观察大部分为软骨细胞,分泌软骨细胞基质糖胺聚糖和Ⅱ型胶原,且两种细胞支架复合物所生成的软骨细胞数大致相同,并无明显的免疫排斥反应。提示异种来源的骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物在转化生长因子β1和软骨形态发生蛋白联合诱导下所得的组织工程化软骨,与同种来源的骨髓间充质干细胞所获得的组织工程化软骨修复喉软骨缺损具有可比性。     

自体骨膜复合骨髓间充质干细胞移植修复免关节软骨缺损

背景:自体骨髓间充质干细胞及骨膜移植等方法可促进关节软骨缺损的修复,但其各自的成软骨能力有限,治疗效果欠佳.目的:观察自体骨膜复合向软骨细胞诱导的骨髓间充质干细胞移植修复软骨缺损的疗效.设计、时间及地点:随机分组对照动物实验,于2005-08/2007-03在山西医科大学第二医院骨科实验室完成.材料:6～8月龄新西兰白兔18只,按随机数字表法分为3组,即骨膜复合骨髓间充质干细胞组、单纯骨膜组及空白对照组,每组6只12个膝关节标本.方法:骨膜复合骨髓间充质干细胞组采用胰酶消化法采集骨髓间充质干细胞进行贴壁培养,加入转化生长因子β1向软骨细胞进行诱导分化,同时进行PKH-26细胞膜免疫荧光标记.在全部兔双侧股骨内侧髁造成直径3 mm,深度3 mm的全层软骨缺损,骨膜复合骨髓间充质干细胞组、单纯骨膜组取同侧胫骨上段内侧骨膜,骨膜生发层朝向骨髓腔覆盖软骨缺损,骨膜复合骨髓间充质干细胞组先期缝合3针,向缺损区注入1×109L-1骨髓间充质干细胞细胞悬液20μL,植入细胞后缝合最后1针.单纯骨膜组只进行单纯骨膜覆盖缺损处理;空白对照组只钻孔不作任何处理.主要观察指标:术后6,12周时,对缺损部位进行大体观察、组织学观察、Wakitani评分以及Ⅱ型胶原免疫组化及原位杂交检测.结果:所有缝合骨膜未发现脱落,骨膜复合骨髓间充质干细胞组6周时,软骨缺损已由透明软骨样修复组织填充,12周时修复组织进一步改建,且修复组织中细胞主要为带有PKH-26荧光标记的植入细胞.单纯骨膜组缺损区修复组织为乳白色,表面光滑稍微凹陷,与周围正常软骨组织之间界限清晰;空白对照组缺损区多数比较凹陷,或缺损部位形状不规则,周围软骨组织断裂.术后6,12周时,骨膜复合骨髓间充质干细胞组Wakitani组织学评分均优于单纯骨膜组和空白对照组(P＜0.05),单纯骨膜组的评分优于空白对照组(p＜0.05).同时,骨膜复合骨髓间充质干细胞组修复组织内细胞周围基质Ⅱ型胶原免疫组化及原位杂交染色阳性,证实修复组织内的细胞为植入细胞.结论:自体骨膜复合向软骨细胞诱导的骨髓间充质干细胞移植可形成透明软骨样修复组织修复关节软骨缺损.     

微重力三维动态诱导骨髓间充质干细胞复合可注射型支架材料Pluronic F-127修复关节软骨缺损

目的:利用三维动态诱导的同种异体非软骨来源种植细胞,复合可注射型支架材料聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物Pluronic F-127修复关节软骨缺损。方法:实验于2005-06/2006-03在哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心完成。①选取2个月龄新西兰大白兔27只,3只用于骨髓间充质干细胞的分离,剩余24只随机数字表法分为诱导细胞复合支架组、单纯支架组、空白对照组,8只(16膝)/组。可注射型支架材料Pluronic F-127为白色粉沫状,无味,其水溶液在低温4℃呈液态,37℃形成固态凝胶(sigma公司,产品批号P2443)。②兔麻醉后穿刺抽取胫骨骨髓,分离培养骨髓间充质干细胞,取3代细胞进行实验。③收集细胞,离心成团,分4组不同诱导条件。三维动态培养组:10g/L藻酸钠溶液洗涤并重新悬浮细胞,细胞浓度为5×1010L-1,滴入200mmol/L氯化钙溶液,立即形成藻酸钙凝胶微球,细胞被悬浮固定于球内部,静止5min,取出凝胶微球,置于旋转式细胞培养系统,微重力条件下动态诱导。二维动态培养组:细胞直接接种于旋转式细胞培养系统,微重力条件下动态诱导。三维静态培养组:藻酸钙凝胶微球悬浮细胞接种于培养瓶静态培养。二维静态培养组:细胞直接接种于平面培养瓶静态培养。各组细胞诱导培养2周,制备切片,分别行甲苯胺蓝染色及Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。柠檬酸钠溶液溶解藻酸钙凝胶微球,测定各组胶原和蛋白多糖含量。④各组兔的双膝均制备膝关节全层软骨缺损模型。诱导细胞复合支架组选取诱导分化最佳的骨髓间充质干细胞与25%可注射型支架材料Pluronic F-127在低温下混匀,重悬,细胞终浓度为5×1010L-1,注入股骨内髁软骨缺损区。单纯支架组只将25%Pluronic F-127注入股骨内髁软骨缺损区。空白对照组关节软骨缺损区不作任何处理。各组分别于术后4,8,12,24周取材,大体及镜下观察关节软骨表面缺损修复情况,同时进行组织学评分。结果:24只兔全部进入结果分析。①骨髓间充质干细胞体外诱导培养及鉴定结果:藻酸钠接触钙离子迅速形成透明凝胶微球,有光泽,凝胶微球中的细胞呈球形,核仁清晰,与正常软骨细胞立体结构相似。培养过程中各组细胞甲苯胺兰染色均呈阳性,并表达Ⅱ型胶原,但无明显Ⅰ型胶原表达。②不同体外诱导分化条件下细胞生化指标的表达:三维、二维动态培养组的胶原和蛋白多糖含量均明显高于三维、二维静态培养组,且以三维动态培养组效果最佳[(0.078±0.002),(0.048±0.002),(0.035±0.001)A,P<0.05;(0.111±0.003),(0.069±0.003),(0.058±0.002)A,P<0.05]。③关节软骨缺损修复情况:诱导细胞复合支架组术后12周修复软骨表面光滑,质地坚硬,为透明软骨组织结构,与周围软骨结合紧密,至24周仍保持透明软骨形态;而单纯支架组、空白对照组均未被修复。术后4,8,12,24周,诱导细胞复合支架组关节软骨组织学评分均优于单纯支架组、空白对照组(P<0.05),且术后时间越长,修复效果越佳。结论:微重力条件下三维动态诱导骨髓间充质干细胞可提高分化质量,获得的种植细胞复合可注射型支架材料修复关节软骨缺损能够取得稳定的长期修复效果。     

聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维三维多孔支架复合骨髓间充质干细胞修复兔骨缺损

背景：骨髓间充质干细胞具有向多种间质细胞谱系分化的能力,且支架材料的性能对骨缺损的修复有重要影响。目的：观察聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维三维多孔支架复合骨髓间充质干细胞治疗骨缺损。方法：对骨缺损模型兔分别采用空白植入、髂后上棘自体松质骨移植、聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维多孔支架移植和复合了骨髓间充质干细胞的聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维多孔支架移植修复缺损部位。结果与结论：至移植12周,移植复合了骨髓间充质干细胞的聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维多孔支架的实验兔的缺损处有骨组织生成,支架材料降解,已完成缺损修复,其修复情况接近松质骨组;髂后上棘自体松质骨移植的实验兔的缺损修复完好,新形成的骨组织较规则;只植入聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维多孔支架的实验兔有少量骨组织形成,材料部分降解;空白植入的实验兔缺损处无新生骨组织生成,主要由纤维结缔组织填充。说明新型的生物支架材料聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维三维多孔支架与来源于新西兰大白兔的骨髓间充质干细胞复合培养后,植入同种异体兔股骨髁缺损处,使骨缺损的修复速度加快,表现为较好的体内诱导成骨的作用。     

纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架复合骨髓间充质干细胞修复膝关节骨软骨缺损

背景:关节软骨损伤修复面临的难题主要表现在再生软骨的结构及生理功能距正常软骨相差较远,无法满足正常生理需要,目前修复方法很多,但效果均不理想.目的:探讨纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架-骨髓间充质干细胞复合物修复犬膝关节骨软骨缺损的可行性.方法:12月龄杂种犬10只,随枫分为实验组、缺损对照组,无菌条件下自髂后嵴处抽取骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,传至第3代消化、收集,调整细胞浓度为2×109L-1,与纳米β磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原共培养24 h,即制成纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架-骨髓间充质干细胞复合物.两组犬均制备右膝关节骨软骨缺损,实验组于缺损处植入支架-细胞复合物,缺损对照组不做任何处理.结果与结论:第12周,实验组缺损内充填以白色半透明组织,表面光滑,触之较软,稍高出周围软骨面,软骨细胞分布较均一,排列无方向性;第24周,实验组缺损内充填白色半透明新生软骨组织,色泽与正常软骨相似,质韧,表面平整,与正常软骨界限消失,表面细胞平行于关节面,深层细胞排列紊乱,细胞呈团状,基质异染广泛,与周围正常软骨连接良好.缺损对照组缺损未修复,底部为白色纤维组织.提示骨髓间充质干细胞是修复关节软骨缺损较理想的种子细胞,在新生软骨形成的同时,纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架逐渐降解吸收,是组织工程修复关节软骨缺损适宜的支架材料.     

动物源性骨软骨支架复合骨髓间充质干细胞/软骨细胞修复兔膝关节骨软骨复合缺损

背景:以往支架材料修复骨软骨的实验大都存在骨软骨耦合界面修复不良的情况.目的:观察骨髓间充质干细胞/软骨细胞复合动物源性骨软骨支架修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性.方法:将新西兰大白兔随机抽签分为实验组、对照组、空白组,制作单侧膝关节骨软骨复合缺损后,实验组于骨缺损处植入自体骨髓间充质干细胞/诱导分化的软骨细胞与同种异体动物源性骨软骨复合支架,对照组于骨缺损处植入同种异体动物源性骨软骨支架、空白组未植入任何材料.术后4,8,12周行大体观察、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色.结果与结论:实验组大体观察见复合缺损区完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合,苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色见软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好,甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分优于对照组、空白组(P < 0.05).说明诱导分化的自体软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养复合动物源性骨软骨支架所构建的细胞-支架复合体能成功修复兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损,是一种理想的骨软骨复合缺损修复方法.