胶原蛋白复合壳聚糖支架的制备及生物学性状:壳聚糖及胶原比例筛选

背景:壳聚糖和胶原类支架已成为组织工程常用的载体材料.但是,现阶段如何能够通过调节二者比例而达到理想的细胞载体仍是目前需要解决的问题之一.目的:调节胶原与壳聚糖二者配制比例制备支架材料,检测及对比不同比例支架材料生物学性质.方法:制备1:1,1:2,1:3,1:4,1:5比例的壳聚糖、Ⅰ型胶原蛋白成分,经紫外线交联后冷冻干燥,再将其用NAOH与蒸馏水进行中和,二次冻干制备好支架.观察不同比例支架的材料性质、孔隙率、降解率、溶胀率;扫描电镜观察孔径的大小及形态.结果与结论:在壳聚糖含量固定,支架的大体孔径经统计比较差异有显著性意义(P<0.05).1:3比例制备的孔径最大,达到(298.0+36.0)μm;支架总体的孔隙率为93.9%～97.5%,胶原比例的增加对支架孔隙率的影响较轻微.各组支架的溶胀率可达到80%左右,支架的溶胀程度随胶原比例增加而减少.在支架的降解率随着胶原比例增加而增加,而壳聚糖含量越高,降解速度越慢.结果证实,通过紫外光交联法,按照1:3配比的胶原和壳聚糖的支架材料更加适合软骨组织工程的要求.     

不同比例壳聚糖胶原复合骨、软骨缺损支架材料的制备及性状比较

背景:骨组织工程支架材料由最初的自体骨,软骨材料到生物活性陶瓷,乃至后来的有机材料胶原蛋白等细胞外基质材料,其生物相容性及性能越来越优越,越来越接近体内的真实情况.但是这些材料在抗压性及强度方面还有待进一步提高.目的:应用胶原与壳聚糖制备生物支架并对其检测其生物学性质,为骨、软骨缺损提供移植替代物.方法:将不同比例壳聚糖-胶原蛋白溶解,经冷冻冻干后紫外线交联后冷冻干燥,二次冻干制备好支架.检测不同比例支架的孔隙率,降解率,溶胀率.扫描电镜观察孔径的大小及形态.结果与结论:制备的支架外观呈海绵多孔状.支架的孔径大小随着胶原比例增加而减小.胶原比例的增加对支架孔隙率的影响较轻微.支架的溶胀率可达到80%左右,支架的溶胀程度随胶原比例增加而减少.胶原含量越大支架柔韧度增加明显.支架的降解率随着胶原比例增加而增加,而壳聚糖含量越高,降解速度越慢.结果提示,通过调整壳聚糖-胶原蛋白比例使支架具有作为骨、软骨缺损移植材料的替代物可能.     

羧甲基壳聚糖-羧甲基纤维素防粘连膜的制备及其理化特性

背景:壳聚糖能有效预防粘连,可制成不同的剂型,如凝胶、溶液、海绵状以及薄膜等,但其缺点是溶液、凝胶易流动,不易在局部形成较高浓度,而单纯应用壳聚糖制成海绵状及薄膜机械强度及韧性不够.目的:以羧甲基壳聚糖、羧甲基纤维索为主要成分,制备具有优良物理、生物性能,预防粘连的生物膜.方法:将羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素按一定比例混合,加入戊二醛、硫酸铝铵进行双交联,甘油增塑.根据膜的色泽、拉伸强度、吸水率、溶胀比等指标通过正交试验筛选处方构成,优化膜的制备工艺,初步确定膜的制备工艺流程.通过扫描电镜、红外光谱等对制各样本的理化特性进行检测,并将膜植入SD大鼠体内观察膜的降解情况.结果与结论:得到优化后膜的处方构成为:羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素为1:1;硫酸铝铵浓度为0.15%;甘油含量为0.8%;戊二醛含量为0.003%.在以上工艺条件下制得的膜呈半透明状,微黄,上表面略租躁,下表面光滑;膜的平均厚度为0.09 mm;吸水率为964%;溶胀比为3.25:干态下膜的最大拉伸强度为20 MPa,湿态下膜的最大拉伸强度为5 MPa;接触角平均为35°.羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维索间形成了较强的分子间作用力.膜表面结构呈相互交错的纤维状,表面有不规则的孔状结构.膜植入鼠体内后10 d左右水化成凝胶,1个月后体内完全降解吸收.提示羧甲基壳聚糖-羧甲基纤维素膜是一种生物相容性良好、可降解吸收、具有一定手术缝合强度的生物膜.     

丝素-壳聚糖复合制作的三维可降解多孔支架

背景:单独使用天然材料如胶原、明胶及纤维蛋白制备的支架虽然解决了生物相容性等问题,但由于其降解太快,在作为细胞支架时往往提前塌陷而达不到诱生新组织的目的.目的:探讨应用丝素与壳聚糖复合制作生物可降解三维多孔的支架,并对其特性进行检测.设计、时间及地点:材料学观察实验,于2008-06/2009-06在浙江省医学科学院生物工程研究所完成.材料:春蚕茧由浙江省海宁市马桥镇黄墩庙村蚕农赠送,壳聚糖为上海伯奧生物科技有限公司产品.方法:通过脱胶、溶解、透析这3个主要步骤制成质量浓度为15 g/L的丝素溶液,将壳聚糖溶解在2%的醋酸溶液中制成25g/L.的壳聚糖-乙酸溶液,然后将两者混合,配制成丝素/壳聚糖质量比分别为10:0,5:5,4:6,3:7,2:8,0:10的6种溶液,分别吸入24孔板中,4℃排出气泡后,-20℃预冷冻12 h,再冷冻干燥30 h.取出后梯度乙醇水化,再用NaOH-乙醇溶液中和稳定1h,漂洗后再次冻干.主要观察指标:光镜和扫描电镜观察各种质量比配制的支架孔径、结构;采用改良的液体替代法测定各种支架的孔隙率;测定各种支架在体外4周的降解率.结果:丝素/壳聚糖质量比为10:0制成的支架孔隙粗大,非常蓬松,易碎,溶失率太高;相反仅以壳聚糖制成的支架冻干后较硬,缺乏足够的弹性;以5:5,4:6,3:7,2:8制成的复合支架冻干后,支架较松软,类似海绵,随着壳聚糖浓度增加,支架硬度增加,支架上有分布均匀且细密的小孔.光镜下各个孔形态不规则,每个孔紧密相连并联通,孔径大小均匀,孔径20~100 μm,随着壳聚糖浓度增加,孔径逐渐减小.支架孔隙率测定结果显示,丝素/壳聚糖质量比为4:6组>5:5组>3:7组>2:8组,与丝素/壳聚糖质量比为2:8组比较,5:5组和4:6组的支架孔隙率均明显增大(P<0.05).各种质量配比制成的丝素-壳聚糖复合支架吸水膨胀率无明显差异(P>0.05).第4周时丝素/壳聚糖质量比为2:8组降解最慢,5:5组降解最快.结论:在理化性能方面,将丝素与壳聚糖混合制作的复合支架较单纯用丝素或壳聚糖制作的支架均显示出明显优势,其中用丝素/壳聚糖质量比为5:5及4:6制成的复合支架最符合软骨组织工程的需要.     

壳聚糖管状支架的制备及生物降解性

背景:作者课题组在进行肺组织瓣修补食管缺损实验中,发现硅胶支架和金属支架都不理想,都存在排斥反应和远期并发症,为寻找一种理想的生物型可自行降解支架,将壳聚糖制成管型支架,观察其在生物体内的相容性和降解性,为食管重建提供一种可降解支架.目的:探讨壳聚糖管状支架的制备方法及其生物特性.方法:利用乙酸溶液制备60 g/L的壳聚糖乙酸水溶胶,采用成膜方法制管后用NaOH脱下壳聚糖导管,取内径5 mm管,切成段,长度2 mm,消毒,并将壳聚糖管植入大鼠组织内,分别于不同时间段大体及光镜下观察其生物相容性及体内降解性.结果与结论:壳聚糖导管光滑,韧性好,吸收水分变软,组织生物相容性好,随时间可被组织吸收降解.该方法提供了制备壳聚糖导管的一种新方法,并证实了其组织相容性和生物可降解性.     

不同质量配比壳聚糖/聚乙烯醇复合材料组织工程支架的制备:结构及性能比较

背景:聚乙烯醇具有与人体组织相近的含水量、良好的生物相容性和较高的机械强度,适合作为组织工程基质材料.但如何改善其细胞亲和性,是将其作为组织再生支架材料的关键.目的:制备壳聚糖/聚乙烯醇复合支架,探讨其作为修复人体损伤组织或器官组织工程支架材料的可行性.方法:将固定相对分子质量和醇解度的聚乙烯醇124与固定脱乙酰度的壳聚糖按不同质量配比复合,分别用成膜法、成颗粒法、冷冻干燥法制备壳聚糖/聚乙烯醇复合支架.测定复合膜的透光率、含水率、膨胀率;测定复合颗粒和复合海绵的含水率;并用扫描电镜观察复合支架横截面的形貌.结果与结论:通过改变复合支架中壳聚糖与聚乙烯醇和含量,制备7种不同质量配比的复合支架.成膜法制备的复合支架,其透光率为70%～80%,含水率为121.2%～162.5%,膨胀率为60.3%～133.7%;成颗粒法和冷冻干燥法制备的复合支架,其含水率分别为82.0%～461.2%和280.8%～1939.0%.聚乙烯醇与壳聚糖的质量配比为0.75/0.15时,复合支架的综合性能最好.扫描电镜观察显示,聚乙烯醇与壳聚糖的质量配比为0.75/0.15时,用冷冻干燥法制备的复合支架其内部结构规整,呈蓬松纤维状,有较好的力学性能和较高的含水率.     

构建壳聚糖-磷酸钙/重组人骨形态发生蛋白2复合材料及在体内的异位成骨

背景：研究表明,重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖-磷酸钙支架复合体具有良好的细胞相容性,且材料内部的多孔结构和孔径也能满足于细胞长入和骨的再生,但要应用于临床还需证明能否体内成骨。目的：构建壳聚糖-磷酸钙与重组人骨形态发生蛋白2的复合材料,并观察其植入兔肌袋模型后的异位成骨能力。设计、时间及地点：观察性实验,于2007-06/08在暨南大学附属第一医院中心实验室、外科实验室及暨南大学理工学院材料科学与工程系实验室完成。材料：将固相的磷酸三钙粉末及液相的壳聚糖溶液在室温下混合,制备壳聚糖-磷酸钙支架。再将壳聚糖-磷酸钙支架放入重组人骨形态发生蛋白2溶液中浸泡,真空抽吸后冷冻干燥,制备壳聚糖-磷酸钙材料/重组人骨形态发生蛋白2复合材料。方法：测量改良后支架的孔隙率及抗压强度,扫描电镜观察其超微结构;20只新西兰大白兔局部麻醉后在左后肢大腿外侧切口,暴露大腿肌肉,分离形成肌袋。随机分为3组,空白对照组5只不植入材料,单纯壳聚糖-磷酸钙材料组5只、壳聚糖-磷酸钙/重组人骨形态发生蛋白2复合材料组10只分别植入壳聚糖-磷酸钙材料、壳聚糖-磷酸钙/重组人骨形态发生蛋白2复合材料。主要观察指标：在植入后4周,通过大体观察、X射线摄片、组织学检测其体内异位成骨能力及生物反应性。结果：制备的复合重组人骨形态发生蛋白2后的壳聚糖-磷酸钙支架的孔隙率为87%,压缩弹性模量为20MPa。扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构,孔径超过100μm。空白对照组苏木精-伊红染色可见肌肉纤维间少量淋巴细胞浸润。单纯壳聚糖-磷酸钙材料组大体观察可见材料周围有薄层的结缔样组织包裹,材料与周围肌肉连接松散,苏木精-伊红染色可见材料植入区为圆形空腔。壳聚糖-磷酸钙/重组人骨形态发生蛋白2复合材料组大体观察可见材料周围有薄层的结缔样组织包裹,材料中间可见空洞,有降解现象及少量淡红色纤维样结构长入,X射线示左大腿内材料高密度影无明显改变,苏木精-伊红染色可见少量血管样组织长入,Masson三色染色可见编制骨岛中有胶原纤维形成。结论：壳聚糖-磷酸钙/重组人骨形态发生蛋白2复合材料具有良好的孔隙率、抗压强度及超微三维结构,复合材料在兔体内具有异位成骨能力。     

胶原-壳聚糖支架与软骨细胞的生长

背景:目前软骨支架材料的种类比较多,但还没有一种材料能完全符合软骨修复的要求。目的:观察在混合材料胶原-壳聚糖支架中软骨细胞的生长情况。方法:采用冷冻干燥法将质量分数为2%胶原与3%壳聚糖混合制备胶原-壳聚糖多孔支架。将分离培养的第2代兔软骨细胞接种到胶原-壳聚糖支架上,对照组将软骨细胞接种到无支架的培养板中。观察支架的孔隙率、吸水性及内部形态结构,MTT法检测软骨细胞在支架上的增殖情况,组织切片苏木精-伊红染色,扫描电镜观察细胞在支架的生长、贴附情况,RT-PCR检测细胞支架复合物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果与结论:胶原-壳聚糖支架的吸水性为(80.0±0.55)%,孔隙率为(88.5±1.5)%,孔径为100～150μm,复合细胞培养2周后,细胞增殖活力高,软骨细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于对照组。说明质量分数为2%胶原与3%壳聚糖的混合支架适合软骨细胞生长和快速增殖,是一种良好的修复和重建软骨载体。     

羧甲基壳聚糖/纳米胶原复合支架修复兔腓骨损伤

背景：研究证实,壳聚糖及其衍生物可作为骨损伤的填充材料以及骨组织工程支架材料,但壳聚糖降解缓慢且不可控制的特性限制了其在骨组织工程中广泛应用。目的：评估羧甲基壳聚糖/纳米胶原纤维复合支架对兔腓骨损伤的修复作用。设计、时间及地点：随机分组设计、对照动物实验,于2007-06/2008-03在清华大学生物科学与技术系生物膜与膜生物工程国家重点实验室完成。材料：以羧甲基壳聚糖和纳米胶原纤维为基础材料,模拟骨的结构设计制备了双层羧甲基壳聚糖/纳米胶原纤维复合支架。方法：选择成年新西兰大白兔10只,按随机数字表法分为3组,阴性对照组2只,壳聚糖支架组4只,复合支架组4只。制备兔腓骨10mm的损伤,分别以旷置缝合、植入壳聚糖支架、植入双层羧甲基壳聚糖/纳米胶原纤维复合支架处理各组。主要观察指标：扫描电镜观察支架微观形貌。术后12周,检测损伤部位的再生情况,以四环素荧光和Von Kossa染色检测实验动物骨损伤部位新生骨钙化情况。结果：10只兔均进入结果分析。①扫描电镜观察到外层致密光滑的壳聚糖膜和多孔的中心区域,多孔区域有大量纳米胶原纤维网络结构填充。其孔径分布的峰值为60～100μm,孔隙率大于85%。②手术后12周,不脱钙切片的四环素染色,可发现阴性对照组两个断端间还没有连上,依旧以游离端存在。复合支架组移植物中形成多个大的钙化岛,其中心网状材料已经大部分降解,钙化岛分布在整个支架的内部区域;而壳聚糖支架组,材料基本没有降解,未见钙化区域。③Von Kossa银染色显示,复合支架组动物骨损伤的中心区域,出现染成黑色的钙化区,中间夹杂着中性红复染的骨组织细胞。壳聚糖支架组动物没有明显的钙化区,多为组织细胞充斥在材料的孔隙中,可见材料基本没有降解。结论：双层羧甲基壳聚糖/纳米胶原纤维复合支架植入动物体内12周后,未见明显的炎症反应和坏死,降解明显,能够促进骨修复,是很有前景的骨组织工程用支架材料。     

简单快速制备壳聚糖支架导管的方法

背景：乳液冷冻干燥法是近年来最常用制备壳聚糖的方法，制备工艺复杂。 目的：介绍一种简单的壳聚糖支架导管制备方法并分析其生物特性。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2007～04／12存中国医科大学附属第二医院中心实验室完成。 材料：SPF级出生8周的Wistar大鼠10只。散装医用级壳聚糖粉，纯度99％，脱乙酰度为99％，为山东济南海洋生物制品，有限公司产品。 方法：利用乙酸溶液制备8％壳聚糖乙酸水溶胶，溶胶放置1d，将硬塑料管浸入溶胶后迅速取出放入1mol／L氢氧化钠液内3min，见管外溶胶变白凝固成胶冻状，取出后晾到五分干后轻轻退下内管，晾干后即成为壳聚糖导管。取内径5mm壳聚糖管，切成段，长度2mm，将其植入大鼠右侧麦氏点皮下肌肉组织内，同时在大鼠左侧相当于麦氏点处切口，分离到肌肉层，不植入壳聚糖管，单纯缝合，作为对照。 主要观察指标：壳聚糖管的大体观察，壳聚糖管存大鼠肌肉组织中的降解百分比，苏术精-伊红染色观察壳聚糖周组织炎症变化。 结果：制成的壳聚糖导管光滑、坚韧。肌内埋植实验强示，术后4，8周壳聚糖管可分别被组织吸收50％和90％以上，管周组织炎性反应逐渐减退。 结论：采用该方法制备壳聚糖管具有所需材料少，成本低廉，制作方法简单，制作时间短的特点，并证实所制备壳聚糖管具有良好的组织相容性和生物可降解性。