人脐带和骨髓源间充质干细胞生物学特征的对比研究

为了对比人脐带组织源间充质干细胞（UC-MSC）与骨髓源间充质干细胞（BM-MSC）的生物学特性,从足月胎儿脐带组织和成人骨髓中分离出间充质干细胞（MSC）。用有限稀释法、流式细胞术、倒置显微镜检及RT-PCR等方法检测UC-MSC和BM-MSC的分离成功率、细胞产量、成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）、增殖特性、免疫表型和多向诱导分化能力等并对比性研究二者的生物学特性。结果表明,UC-MSC和BM-MSC的分离成功率均达100%;虽然由脐带组织中分离的有核细胞数低于骨髓（1×10^6/cmvs5.5×10^7/ml）（p=0.0002）,但在培养第14天由脐带和骨髓中得到的贴壁细胞数无差异（8.6×10^5/cmvs8.4×10^5/ml）（p〉0.05）;UC-MSC形态、大多数分子表型、细胞周期状态、脂肪和骨诱导分化能力与BM-MSC相似,但UC-MSC的CFU-F比例（1∶1609±0.18）高于BM-MSC的CFU-F比例（1∶35700±0.01）（p〈0.05）。此外,UC-MSC具有比BM-MSC更强的增殖能力（p〈0.05）。UC-MSCHLA-ABC和CD106分子表达低于BM-MSC（p〈0.05）。结论：脐带组织源间充质干细胞产量和绝大多数生物学特征与BM-MSC的相似,且具有比BM-MSC更高的增殖能力、较低的HLA-ABC和HLA-DR表达,UC-MSC有望成为BM-MSC理想的替代来源。     

羊水、脐带和骨髓来源间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制效果比较

目的：比较羊水来源间充质干细胞（ AF-MSC）、脐带来源间充质干细胞（ UC-MSC）和骨髓来源间充质干细胞（ BM-MSC）对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用。方法从妊娠中期羊水、新生儿脱落脐带、正常成人骨髓中分离获取原代AF-MSC、 UC-MSC和 BM-MSC。观察形态并采用流式细胞术检测表面分子。取传代培养的第3代的AF-MSC、 UC-MSC和 BM-MSC体外诱导培养后,观察体外诱导成骨成脂多向分化情况。将不同细胞浓度的AF-MSC, UC-MSC和 BM-MSC分别加入到植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,比较3种不同来源的MSC对淋巴细胞增殖的调控作用。结果分离培养的AF-MSC, UC-MSC和BM-MSC分别表达MSC特异性表面分子CD29、CD70、 CD90,不表达造血干细胞表面分子CD45。体外传代培养的AF-MSC、 UC-MSC和BM-MSC对淋巴细胞增殖的抑制中,当淋巴细胞∶MSC为1∶1、1∶10、1∶50、1∶100时,对淋巴细胞增殖的抑制率AF-MSC最强, BM-MSC最弱。结论 AF-MSC、 UC-MSC和BM-MSC均具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用,其中以AF-MSC抑制效果最强, BM-MSC最弱,其抑制效果与MSC数量有关。     

大鼠脐带源间充质干细胞的分离及生物学性状

背景:关于大鼠骨髓来源的间充质干细胞用于移植免疫耐受及进行组织修复的研究很多,但尚无脐带来源间充质干细胞的相关研究.目的:建立从大鼠脐带分离间充质干细胞的方法,并观察其生物学性状.方法:大鼠脐带经酶消化和组织块培养两种方法进行分离培养,于DMEM-LG培养基中培养,倒置显微镜观察细胞形态,细胞计数绘制生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及细胞表型,免疫组织化学染色检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力.结果与结论:两种方法均能成功地从大鼠脐带中获得大量的间充质干细胞:原代培养显示,胶原酶消化法比组织块培养法的效率更高,大约10 d就可以进行传代,而组织块培养法要14 d才能传代:传代扩增两者之间没有差别.免疫表型分析显示,大鼠脐带源细胞表达黏附分子和基质细胞标记CD90、CD106,不表达造血细胞标记CD34、CD45.体外诱导实验证实,大鼠脐带间充质干细胞具有成脂肪和成骨分化的能力.     

脐带源间充质干细胞体外分离培养后形态学与表面抗原的鉴定

目的:观察脐带中含有的间充质干细胞体外分离、纯化及培养条件,并对其进行生物学特性、分化能力和表面抗原的鉴定。方法:实验于2004-10/2005-07在江苏省人民医院中心实验室完成。①无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带近胎儿段,剔除动静脉,取出其中的间质组织,胶原酶消化法原代培养细胞进行培养和纯化获得贴壁细胞。②用流式细胞仪检测间充质干细胞表面抗原的表达情况。③对间充质干细胞多向分化的能力进行初步鉴定。结果:①来源于脐带的单个核细胞经体外培养贴壁后出现间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态。②第1,3,5,7代细胞生长曲线基本相同。其生长共同特性:传代培养潜伏期约为24～36h;传代培养对数增殖期约为4～6d;对数增殖期结束后至接种后八九天,生长进入平台期。③表达间充质干细胞相关的抗原CD105,CD44,但不表达造血细胞抗原CD34,CD45,这与源于骨髓的间充质干细胞一致。④加入诱导剂5h后表现出典型的神经元样细胞形态,伴少量细胞开始死亡。24h后死亡细胞明显增多;诱导后的神经元样细胞NSE表达明显增强。结论:人脐带来源的间充质干细胞能在体外培养、扩增,并且具有和骨髓源间充质干细胞类似的生物形态和抗原表型。     

脐带源间充质干细胞体外分离培养后形态学与表面抗原的鉴定

目的：观察脐带中含有的间充质干细胞体外分离、纯化及培养条件，并对其进行生物学特性、分化能力和表面抗原的鉴定。 方法：实验于2004-10／2005-07在江苏省人民医院中心实验室完成。①无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带近胎儿段，剔除动静脉，取出其中的间质组织，胶原酶消化法原代培养细胞进行培养和纯化获得贴壁细胞。②用流式细胞仪检测间充质干细胞表面抗原的表达情况。③对间充质干细胞多向分化的能力进行初步鉴定。 结果：①来源于脐带的单个核细胞经体外培养贴壁后出现间充质样的细胞，间充质细胞为成纤维样的细胞形态。②第1，3，5，7代细胞生长曲线基本相同。其生长共同特性：传代培养潜伏期约为24-36h；传代培养对数增殖期约为4-6d；对数增殖期结束后至接种后八九天，生长进入平台期。③表达间充质干细胞相关的抗原CD105，CD44，但不表达造血细胞抗原CD34，CD45，这与源于骨髓的间充质干细胞一致。④加入诱导剂5h后表现出典型的神经元样细胞形态，伴少量细胞开始死亡。24h后死亡细胞明显增多；诱导后的神经元样细胞NSE表达明显增强。 结论：入脐带来源的间充质干细胞能在体外培养、扩增，并且具有和骨髓源间充质干细胞类似的生物形态和抗原表型。     

人胎盘源与人骨髓源间充质干细胞的生物学性状比较

背景:人骨髓源间充质干细胞具有很好的临床应用价值,但数量和取材都有限,而人胎盘源间充质干细胞则相反,目前已成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞.目的:比较人胎盘源间充质干细胞和人骨髓源间充质干细胞体外分离培养、扩增及生物学性状的差异.方法:采用胶原酶消化法分离人胎盘组织,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别加入体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM 培养液,待细胞汇合至90%后消化传代.分别取第3代的人胎盘和骨髓间充质干细胞,按1×106 浓度接种,当细胞达70%~80%融合时,换成成脂细胞诱导分化培养液,诱导16 d.结果与结论:胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞均成贴壁生长、形态均一的成纤维样细胞梭形外观,但后者体积略小.两种细胞均高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD106.二者均可分化为脂肪细胞.可见,从胎盘和骨髓中培养出的间充质干细胞在细胞形态、生长特性等方面基本相似,在体外均可有效扩增并成脂肪分化,均可作为组织工程的另一成体干细胞来源,而胎盘源间充质干细胞具有更好的应用前景.     

人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外支持造血能力的比较研究

本研究分离鉴定人骨髓和脐带来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）,比较两种间充质干细胞体外支持长期造血的能力。用密度梯度离心或酶消化方法分离骨髓和脐带间充质干细胞,通过贴壁培养的方法进一步纯化Msc。检测骨髓和脐带MSC的表型以及成脂、成骨分化潜能。通过LTC—IC（long—term culture—initiating cells）实验,检测骨髓和脐带间充质千细胞体外支持长期造血的能力,并在培养的第3、5、7周分析两种MSC组悬浮细胞的表型。结果表明,骨髓和脐带间充质干细胞体外培养时均呈纺锤形、贴壁生长,2种MSC均表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA—ABC,不表达HLA—DR、CD34和CD45。化学染色证实,2种MsC体外能分化为脂肪细胞和成骨细胞。LTC—IC实验第5周脐带间充质干细胞组CFC（colony forming cell）的产率与骨髓间充质干细胞组比较无统计学差异（P〉0．05）;第6、7、9周,脐带MSC组CFC的产率均低于骨髓MSC组（P〈0．05）。第3、5、7周悬浮细胞表型检测结果显示,随着培养时间的延长,2种MSC组CD34和CD117的阳性率均明显下降,而CD33、CD13、CD11b的阳性率逐渐上升。结论：从人骨髓和脐带组织中成功分离并鉴定出间充质干细胞,脐带间充质干细胞能够在体外支持长期造血,但其造血支持能力弱于骨髓间充质干细胞。     

人胎盘与骨髓源性间充质干细胞体外培养及生物学特性对比

背景:组织工程修复大块组织缺损需要高浓度、大量的细胞接种,骨髓间充质干细胞是种子细胞的主要来源,但存在数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题.目的:体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓间充质干细胞,并对其生物学性状进行比较.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-09/2009-02在东直门医院实验室完成.材料:胎盘由解放军空军总医院妇产科提供,骨髓来源于健康成人献髓者.方法:采用密度梯度离心法从胎盘中分离、纯化和传代培养人胎盘源性间充质干细胞;骨髓肝素抗凝后,采用密度梯度离心法分离、纯化和传代培养入骨髓基质干细胞.主要观察指标:用倒置相差显微镜观察两种细胞形态及细胞生长情况,流式细胞仪分析检测第5代细胞表面标志的表达,Von Kossa染色及油红O染色检测分化能力.结果:镜下两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样,传5代后细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,体外培养10代后细胞生长速度减慢,但人胎盘源性间充质干细胞扩增倍数较人骨髓基质干细胞平均高出两三个数量级.两种细胞具有均一的细胞衷型,均表达CD29,CD44,CD166,不表达CD34,CD45,HLA-DR.两种细胞都具有成骨、成脂分化潜能,但人胎盘源性间充质干细胞分化潜能更强.结论:人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓基质干细胞具有相似的生物学特性,且前者具有更强的增殖能力.     

脐带间充质干细胞分离培养和生物学特性的初步研究

目的 建立从脐带分离间充质干细胞的分离培养方法,探讨研究其基本生物学特征.方法 无菌条件下收集健康孕妇剖宫产的新生儿脐带,用酶消化法获取间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),经传代培养、倒置显微镜观察形态、细胞增殖能力观察及流式细胞仪检测脐带间充质干细胞免疫表型.结果 经传代培养后,脐带间充质干细胞呈长梭形、旋涡状生长.细胞免疫表型显示,CD34,CD45,CD14阴性;CD90,CD73,CD105阳性.结论 脐带间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞形态无明显变化,且免疫表型类似,是一种新的间充质干细胞来源.     

脂肪与骨髓来源间充质干细胞生物学特性的比较

背景:近几年来脂肪来源的间充质干细胞因其取材容易也被广泛研究。目的:比较脂肪来源和骨髓来源间充质干细胞的生物学特性。方法:分离及体外培养人骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞,比较它们的表型、细胞倍增时间及分泌因子水平等。结果与结论:脂肪来源和骨髓来源的间充质干细胞在细胞表型上类似,只有CD106的表达有差异。脂肪来源间充质干细胞增殖速率比骨髓来源的间充质干细胞快。在相同体积的脂肪组织中能够得到的干细胞前体细胞的数量是骨髓的10倍以上。提示脂肪来源和骨髓来源的间充质干细胞具有相同功能,但脂肪组织是一个更有应用前景的干细胞来源。     

血管内皮生长因子对人骨髓和脐带间充质干细胞中内皮细胞组分的影响

本研究旨在比较人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)和脐带间充质干细胞(UC-MSC)中的内皮细胞(EC)比例,并探讨血管内皮生长因子(VEGF)对MSC中EC比例的影响。利用流式细胞术检测EC标志CD34+CD133+和vWF+CD31+双阳性细胞的比例,用瑞氏染色观察经VEGF作用的MSC细胞形态变化,免疫荧光技术观察CD34、CD133、CD31、VWF的表达,最后采用实时荧光定量PCR检测VEGF对EC标志性基因表达的影响。结果表明:BM-MSC和UC-MSC中存在少量EC及内皮祖细胞(EPC),经VEGF 10 ng/ml作用24 h后,MSC的长宽比变大,EC比例上升而EPC比例下降,EC相关标志基因Tie-2和ecNOS等的表达均上调,其中UC-MSC对VEGF的反应更明显。结论:BM-MSC和UC-MSC中存在少量的EC及EPC,VEGF可以提高EC的比例和细胞功能。     

冻存前后脐带间充质干细胞生物学特性的比较

目的：比较冻存对脐带间充质干细胞生物学特性的影响,为其更广泛的应用提供基础。方法实验于2009年至2010年在南昌大学第二附属医院分子医学实验室、血液病研究所完成。（1）实验材料：剖宫产胎儿脐带取自自愿捐献者,实验经医学伦理委员会批准。（2）采用胶原酶消化法从脐带中分离培养间充质干细胞。（3）将传至第3代的细胞冻存半年后复苏。（4）通过显微镜观察细胞形态,通过流式细胞仪检测细胞的表面标志,体外诱导分化为软骨及脂肪细胞检测其多向分化能力,比较复苏前后上述指标的差异。结果脐带经胶原酶消化法所获得的细胞培养至第3代细胞呈长梭形,排列有明显方向性,细胞排列成网状、辐射状,冻存复苏后期形态学无明显改变。培养至第3代的细胞高表达CD29、CD54、CD166,不表达CD13、CD34、CD45、CD31、HLA-DR,冻存复苏后的细胞表达与未冻存的细胞无统计学差异。 MSC在体外分别向脂肪细胞及软骨细胞诱导分化,以油红O染色后可见染为红色的阳性细胞为脂肪细胞,经阿新兰染色后可见为蓝色的阳性细胞为软骨细胞,冻存复苏后的脐带间充质干细胞细胞也可向脂肪及软骨细胞分化。结论脐带作为一种新的MSC来源,可成为脐血和骨髓MSC 的替代来源,并且冻存对MSC的生物学特性无明显改变,使其能更广泛地用于科研和临床前试验。     

脐带间充质干细胞体外衰老过程中生物学特性及基因表达谱的变化

本研究探讨人脐带间充质干细胞(UC-MSC)在体外培养的衰老过程中细胞生物学特征及衰老相关基因的变化特点。体外分离培养UC-MSC,取第3代(对照组)和第15代(衰老组)细胞进行形态学观察、增殖检测、流式表型测定和人类全基因组表达谱芯片分析,并选取重要基因进行定量逆转录多聚酶链反应验证。结果显示,与对照组相比,衰老组细胞形态变大,增殖速度减慢,但CD44和CD105等细胞表型阳性率无变化;衰老细胞组的核糖体小亚基组成相关基因显著上调,上调的信号通路主要涉及类固醇合成、半乳糖代谢、自身免疫病和退行性疾病;下调明显的是细胞骨架,DNA、mRNA结构的结合以及蛋白质功能等相关基因,与细胞黏附功能和细胞增殖周期等相关。结论:第15代的UC-MSC出现细胞代谢与增殖功能下降,从而导致细胞衰老。     

脐带和胚胎肝来源间充质干细胞生长特性的比较

背景：不同来源的干细胞具有不同的分子特征及生长特性,对疾病治疗的机制及效果可能会有所差异。目的：比较两种来源间充质干细胞的生物学特性。方法：分离培养人脐带源、胚胎肝来源的间充质干细胞,传至第5代时分别进行细胞形态观察,细胞群体倍增时间计算,细胞表面标志鉴定,诱导分化能力检测。另外将脐带源间充质干细胞继续培养至第10,15代,绘制生长曲线并计算细胞群体倍增时间。结果与结论：两种来源的间充质干细胞在对数生长期均为梭形,旋涡状生长,均具有成骨、成脂、成软骨分化的能力。两种间充质干细胞的生长曲线均为S形。第5代胎肝来源间充质干细胞的倍增时间为（34.37±0.31）h,脐带源间充质干细胞的倍增时间为（35.63±0.38）h,差异无显著性意义（P〉0.05）。第10代和第15代脐带源间充质干细胞的倍增时间分别为（52.6±0.53）h和（53.27±0.92）h,与第5代比较差异有显著性意义（P〈0.05）。结果可见两种来源间充质干细胞生物学特性基本相同,肉眼观察胎肝来源间充质干细胞比脐带源间充质干细胞形态稍小,增殖较快,但统计学上差异无显著性意义。     

三维培养对脐带间充质干细胞表型及造血因子基因表达的影响

本研究探讨三维立体培养条件下脐带间充质干细胞（UC-MSC）的细胞表型变化及部分造血相关因子的基因表达,为下一步研究三维立体条件下的造血扩增及诱导分化提供基础.从脐带中分离出MSC,分别在二维及三维条件下培养,通过流式细胞术检测MSC表面抗原的表达水平,通过成血管试验比较了两种细胞的成血管能力,并通过实时定量PCR检测两种培养条件下造血相关细胞因子的基因表达情况.结果表明：从脐带中成功地分离出了MSC,在三维培养条件下其内皮细胞、内皮祖细胞和间充质原始干细胞的表面标记CD31、CD133和CD271等阳性细胞百分比显著增加,体外成血管能力增强;骨架蛋白β-actin基因在三维培养条件下表达上调,G-CSF、LIF、SCF、IL-1 α、IL-1β、IL-3、IL-7和IL-11等与造血调控有关的细胞因子基因表达也有不同程度的增高,其中LIF、IL-3和IL-7升高尤为明显;免疫调控相关的细胞因子IL-10的表达也增高,而SDF-1和IL-6的表达虽有轻微的降低,但无显著性差异.结论：三维培养条件下UC-MSC的CD31、CD133和CD271表达上调,体外成血管能力增强,并且多个造血相关因子的基因表达水平上调.     

人脐带、胎盘绒毛膜来源间充质干细胞的生物学特性比较研究

由于组织来源和增殖能力的优势,与骨髓间充质干细胞(MSC)相比,脐带和胎盘来源的MSC更具有临床应用前景,但脐带和胎盘来源MSC的生物学特性是否有差异值得进一步研究。本研究比较人脐带、胎盘绒毛膜来源MSC的生物学特性。将胎盘、脐带冲洗干净后,通过酶消化法分离脐带、胎盘来源的MSC。通过短串联重复序列分析(STR)检测细胞是否均来源于胎儿组织,用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术分析细胞表型,使用不同的诱导分化培养液检测其多向分化的能力。将MSC与植物血凝素刺激的外周血单个核细胞共培养,用酶联免疫吸附试验检测上清γ-干扰素的水平。结果表明,STR分析证实所得到的细胞均来源于胎儿组织,这两种细胞生长呈典型的成纤维细胞形态;细胞表达常见的MSC表面标记CD90、CD73、CD105、CD44,不表达CD45,CD11b和CD34;在不同的条件培养液培养下,细胞均可向成骨、成脂方向分化,但在成脂分化方面,绒毛膜来源MSC能形成更大的脂滴。结论:所得到的细胞均为MSC,均能抑制植物血凝素刺激的人外周血单个核细胞分泌γ-干扰素,且绒毛膜来源的MSC具有更强的抑制能力。这使得绒毛膜来源的MSC在治疗自身免疫系统疾病方面可能具有更大的优势。     

自体分选造血干细胞和异体脐带间充质干细胞移植治疗神经系统变性疾病

背景：将自体分选造血干细胞和异体脐带间充质干细胞技术应用于临床,试图寻找一种新的治疗神经系统变性疾病的可行方法。目的：探讨自体分选CD34＋造血干细胞和异体脐带间充质干细胞治疗神经系统变性病的可行性。方法：入选神经系统变性病患者21例,其中运动神经元病15例,脊髓小脑共济失调6例。取4mL的脐带间充质干细胞或自体分选干细胞液经腰穿注射到患者蛛网膜下腔,每次注射的细胞数1.0×107。于干细胞治疗后3个月进行评分。结果与结论：15例运动神经元病患者,治疗总有效率为80%,治疗前后的脊髓侧索硬化功能分级量表和自我评估问卷评分差异有显著性意义（P〈0.05）;6例脊髓小脑共济失调患者,按ICARS评分,4例病情等级下降,治疗总有效率为77%。21例中4例有轻度低颅压性头痛（腰穿后）,14例采用脐带间充质干细胞治疗的患者中2例在治疗后2h出现短暂发热,其余患者治疗后未见明显不良反应。结果初步表明自体分选造血干细胞和异体脐带间充质干细胞治疗神经系统变性病临床疗效肯定,安全可行。     

无血清培养脐带间充质干细胞的研究

本研究观察无血清培养液培养的人脐带间充质干细胞（UC-MSC）,并比较与含10％胎牛血清培养液培养的人脐带间充质干细胞的异同.采集正常足月剖宫产胎儿脐带,用MesenCult-XF无血清培养液或含10％胎牛血清培养液培养.观察不同培养液培养的间充质干细胞细胞的形态、免疫表型、细胞周期、增殖分化潜能及对混合淋巴细胞反应的抑制作用.结果表明,采用无血清MesenCult（R）-XF培养液培养的MSC平均传代倍增6.57±0.7倍,含血清培养液培养的MSC平均传代倍增4,59±0.45倍（P＜0.05）;两种培养液培养的MSC均表达CD44、CD90、CD73、CD105抗原,不表达CD31、CD45、HLA-DR及CD34等抗原,表达程度无明显统计学差异;无血清培养液培养的MSC（65±5.2）％均为G0/G1期细胞,含血清培养液培养的MSC（62±3.1）％为G0/G1期细胞（P＞0.05）;两种培养液培养的人脐带MSC均可向成脂细胞、成骨细胞分化;无血清培养液培养的脐带MSC按1 000、5 000、10 000、20 000个细胞/孔接种密度与反应细胞和刺激细胞共培养的每分钟闪烁值（CPM）分别为（6.43±0.47）×104、（4.30 ±0.38）×104、（1.97±0.13） ×104和（0.24±0.03）×104,含血清培养液培养的MSC与不同密度的混合淋巴细胞共培养的CPM值分别为（7.85 ±0.07） ×104、（5.64 ±0.12）×104、（3.09±0.18）×104和（1.73±0.05）×104.结论：无血清培养液培养的细胞均为MSC,有传代增殖潜能,传代可达临床治疗MSC细胞量,并可避免异种蛋白致敏.