腺病毒介导细胞外信号调节激酶2表达对去分化软骨细胞增殖及胞外基质合成的影响

目的：观察腺病毒介导细胞外信号调节激酶2的过度表达对去分化软骨细胞增殖和细胞外基质合成的影响，以及腺病毒介导细胞外信号调节激酶2用于修饰去分化软骨细胞的可行性。 方法：实验于2004-09／2005-05在暨南大学组织移植与免疫研究中心进行。SD大鼠5只，周龄为3-5周，此处请核对体质量为（150&;#177;20）g，分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞，利用Adeasy系统构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体。流式细胞仪检测不同感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率，Western blot检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1／2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达，^3H-TdR,^3H-proline和^35 S-sulfate同位素掺入检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染对大鼠肋生长板软骨细胞增殖、胶原和蛋白多糖合成的影响。 结果：①成功构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体重组腺病毒。②100感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率大于90％。③携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染的第5代大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1／2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达均显著增加，分别是Ad-CMV组的15．58和1．85倍。④同位素检测结果表明携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体的感染促进^3H-TdR、^3H-proline和^35S-sulfate的掺入，分别是对照组的2．52，1.61和1．53倍（P〈0．05）。 结论：腺病毒介导细胞外信号调节激酶2基因的过度表达促进去分化大鼠肋生长板软骨细胞的增殖和细胞外基质成分的合成。     

兔软骨细胞与骨髓基质细胞的平面共培养:两者培养比例筛选

背景:骨髓基质细胞一定条件下可以分化为软骨细胞,但目前还缺少将软骨与骨髓基质细胞平面共培养的深入探讨.目的:拟明确骨髓基质细胞与软骨细胞共培养时比例的选择、细胞增殖活性、软骨特异性蛋白表达的规律,用于细胞移植的最佳时间和传代次数.方法:软骨细胞与骨髓基质细胞的分离培养,传代后分为5组:单纯软骨细胞组;共培养组,软骨细胞与骨髓基质细胞7:3,5:5,3:7组;以及单纯骨髓基质细胞组.传代至第4代(G4),倒置相差显微镜观察各组细胞在不同传代时期的细胞形态,MTT实验检测细胞增殖活性,甲苯胺蓝与阿利新蓝染色,细胞免疫化学法检测Ⅱ型胶原的表达.结果与结论:共培养各组在各个时期细胞表型正常.G1～G3代细胞增殖活跃,G4代细胞增殖能力下降.共培养各组甲苯胺蓝与阿利新蓝染色以及Ⅱ型胶原表达在G2和G3代均较高.综合各指标认为,以软骨细胞与骨髓基质细胞的比例为5:5,3:7组为最佳.软骨细胞与骨髓基质细胞平面共培养,保持了软骨细胞的形态和蛋白表达特性,如进行细胞移植,选取软骨细胞与骨髓基质细胞5:5或3:7的比例为最佳.     

骨关节炎中影响软骨细胞凋亡的因素

目的：近年来国外对骨关节炎的发生及发展机制有许多研究成果，骨关节炎中软骨细胞凋亡影响因素的研究颇具新意。资料来源：应用计算机检索Medline 1985-01／2004—12与骨关节炎中软骨细胞凋亡相关的文献，检索词“osteoarthrltis，chondrocyte，apoptosis”，并限定文献语种为English。资料选择：对资料的摘要进行阅读初审，选取包括试验组和对照组的文献，开始查找全文。纳入标准：①随机对照试验。②试验包括对照组。排除标准：①没有设立对照组的文献。②综述类文献、Meta分析、重复研究。资料提炼：共收集到111篇关于骨关节炎中软骨细胞凋亡影响因素的试验，纳入符合标准的文献35篇。排除的文献为综述类文献28篇和重复研究48篇。35篇文献多为软骨细胞体外培养有关的试验，分别对各种凋亡影响因素进行评价。资料综合：在骨关节炎患者和老年人的软骨中，由于细胞外基质成分降解或通过高级糖基化、酪氨酸亚硝基化等修饰作用破坏了正常的细胞外基质从而使软骨细胞发生炎症反应并促进其死亡。各种机械性刺激是软骨细胞功能的重要调节因素，施加机械压力的加速率也决定软骨损伤和软骨细胞死亡的类型与程度。经某些细胞因子作用的正常软骨和分离培养的软骨细胞产生高水平的NO，而NO产物又能诱导软骨细胞死亡。肿瘤坏死因子受体超家族成员与相应的死亡配体结合能激活凋亡信号通路，当存在其他前凋亡因子或缺乏某些促存活因子时肿瘤坏死因子α能诱导软骨细胞凋亡。正是由于能量代谢受损使软骨细胞对其他的致死因子变得更加敏感。在发育和骨关节疾病相关过程中，软骨细胞的死亡虽然有p53的参与，但其精确的机制有待阐明，同时没有足够的直接证据表明c—myc能够影响软骨细胞的存活或死亡。结论：骨关节炎中影响软骨细胞凋亡的因素很多，机制复杂，许多因素导致软骨细胞凋亡的通路有待进一步阐明。     

自体骨髓间充质干细胞和同种异体软骨细胞共培养优化软骨组织工程种子的细胞源

背景：至今尚无一种细胞能完全满足组织工程对种子细胞的要求。目的：探讨自体骨髓间充质干细胞和同种异体软骨细胞共培养的可行性。方法：酶消化分离法获得兔软骨细胞,使用密度梯度离心和贴壁筛选的方法获得骨髓间充质干细胞。取细胞浓度为3×108L-1的第2代骨髓间充质干细胞和软骨细胞,随机分为3组,共培养组：将骨髓间充质干细胞和软骨细胞按2：1比例混匀;实验组：取同代同浓度的软骨细胞（浓度与共培养细胞的终浓度相同）;对照组：取低浓度软骨细胞1×108L-1（与共培养组中软骨细胞终浓度相同）。结果与结论：共培养组、实验组及对照组细胞平均群体倍增时间分别为3,7,8d;共培养组共培养细胞增殖比其他2组明显增快（P〈0.05）;糖胺多糖水平明显多于其他2组（P〈0.05）;自体骨髓间充质干细胞与同种异体软骨细胞共培养未见明显排异反应,提示自体骨髓间充质干细胞与同种异体软骨细胞为种子细胞共培养,骨髓间充质干细胞能促进软骨细胞的增殖和细胞外基质合成,缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数,同时软骨细胞可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向转化,节省大量软骨细胞。     

软骨组织工程中细胞外基质的研究

目的：分析软骨组织工程中软骨细胞、软骨基质、生长因子之间的相互作用及细胞外基质替代物的开发。 资料来源：应用计算机检索Medline1995-01／2005-12有关软骨组织工程中软骨细胞外基质的文章，检索词为“cartilage；extraeellular matrix”．并限定文章语言种类为English。 资料选择：对资料进行审阅,选取包括软骨组织工程的文章，并查阅全文。纳入标准：①软骨细胞外基质及其受体。②软骨组织重建相关生长因子。③软骨细胞外基质替代物。排除标准：Meta分析、综述文献、重复研究。 资料提炼：共收集到1 179篇关于组织工程软骨及细胞外基质的文献．纳入符合标准的文献29篇。 资料综合：软骨组织无血管，其自我修复及重建能力有限，较小的创伤就会造成严重的软骨损伤及变性。软骨基质在软骨自身动态平衡及软骨修复等方面起着非常重要的作用，软骨细胞合成、分泌软骨基质并受软骨基质的调控。重建软骨组织就必须考虑软骨细胞及其周围环境的相互作用。 结论：重建关节软骨基质、促进软骨复原，研究软骨细胞和其周围环境之间的相互作用是关键。     

低温冻存同种异体软骨细胞在喉功能重建中的应用

目的：通过对深低温冻存的软骨细胞作为种子细胞构建组织工程化软骨修复喉软骨缺损的能力研究，寻找一种活性软骨细胞的保存方法。方法：取3周龄新西兰兔关节软骨，经深低温冻存，复苏冻存不同时间的软骨细胞，体外培养，培养细胞呈单层细胞铺满培养瓶底后收集细胞，制成细胞悬液，接种于聚羟基乙酸(polyglycolicacid，PGA)三维支架材料上，复合物体外培养1周，接种于同种异体兔甲状软骨缺损处，术后2，4，8周取材，行大体及组织学观察。结果：经深低温冻存的软骨细胞与新鲜软骨细胞修复区愈合良好，无瘢痕及坏死现象，组织学观察均有软骨生成及基质分泌；冻存不同时间的软骨细胞组之间无明显差异。结论：经深低温冻存的软骨细胞保持了分裂增殖及合成基质的能力，可用于组织工程修复软骨缺损，冻存时间对其功能无明显的影响。     

腺病毒介导细胞外信号调节激酶2表达对去分化软骨细胞增殖及胞外基质合成的影响

目的:观察腺病毒介导细胞外信号调节激酶2的过度表达对去分化软骨细胞增殖和细胞外基质合成的影响,以及腺病毒介导细胞外信号调节激酶2用于修饰去分化软骨细胞的可行性。方法:实验于2004-09/2005-05在暨南大学组织移植与免疫研究中心进行。SD大鼠5只,周龄为3～5周,此处请核对体质量为(150±20)g,分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞,利用Adeasy系统构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体。流式细胞仪检测不同感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率,Westernblot检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1/2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达,3H-TdR,3H-proline和35S-sulfate同位素掺入检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染对大鼠肋生长板软骨细胞增殖、胶原和蛋白多糖合成的影响。结果:①成功构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体重组腺病毒。②100感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率大于90%。③携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染的第5代大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1/2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达均显著增加,分别是Ad-CMV组的15.58和1.85倍。④同位素检测结果表明携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体的感染促进3H-TdR、3H-proline和35S-sulfate的掺入,分别是对照组的2.52,1.61和1.53倍(P<0.05)。结论:腺病毒介导细胞外信号调节激酶2基因的过度表达促进去分化大鼠肋生长板软骨细胞的增殖和细胞外基质成分的合成。     

骨髓间充质干细胞与关节软骨细胞Transwell共培养诱导形成软骨

背景:研究证实,关节软骨细胞具有分泌诱导因子促进骨髓间充质干细胞向关节软骨细胞分化的能力,但至今未见两种细胞运用Transwell共培养诱导骨髓间充质干细胞形成软骨的报道.目的:观察在Transwell共培养系统中共培养后,关节软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞向关节软骨样细胞转化的能力.方法:骨髓间充质干细胞来源于4周龄SD大鼠的股骨及胫骨干骨髓,关节软骨细胞来源于4周龄SD大鼠的正常股骨头表面的关节软骨.分别吸取第3代骨髓间充质干细胞和关节软骨细胞,按1:1的细胞比例分别植于Transwell共培养系统中,下室植入骨髓间充质干细胞,上室植入关节软骨细胞.同时设置相同浓度单纯骨髓间充质干细胞对照组,分别在含胎牛血清的DMEM培养基中培养,相差显微镜下观察细胞的增殖和基质合成情况,并对各组细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组化染色及氨基聚糖含量检测.结果与结论:共培养组骨髓间充质干细胞数量增多,细胞外基质合成丰富,其基质能被Ⅱ型胶原免疫组化染色,细胞染色呈现黄色.氨基聚糖含量随着诱导时间增加而增多.提示关节软骨细胞分泌物具有促进骨髓间充质干细胞向关节软骨样细胞转化的能力,与此同时,骨髓间充质干细胞还能分泌促进组织细胞修复的细胞因子,使共培养中的软骨细胞功能得以加强.由此可见,软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养诱导具有独特的优势.     

低强度脉冲超声经整合素-FAK-p38 MAPK通路对膝关节脂肪垫共培养下软骨细胞的影响

目的观察低强度脉冲超声(LIPUS)通过整合素-黏着斑激酶(FAK)-p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路对膝关节脂肪垫共培养下软骨细胞的影响。 方法24例女性膝脂肪垫及膝关节软骨均由骨科手术室提供,年龄25～35岁,均为膝关节急性外伤手术患者,排除其他膝关节病史。切取脂肪垫行苏木精-伊红染色(HE);制作脂肪垫培养液(FCM);于表面完好部分提取正常软骨细胞进行体外培养,按随机数字表法分成对照组、模型组（正常软骨细胞+FCM）、治疗组（正常软骨细胞＋FCM＋LIPUS干预）和抑制剂组（正常软骨细胞＋FCM＋LIPUS＋整合素抑制剂GRGDSP干预）。采用Ⅱ型胶原(COL2)免疫细胞化学染色法比较并鉴定对照组与模型组的软骨细胞。治疗组和抑制剂组接受LIPUS辐射,LIPUS辐射强度为40mW/cm2,每次辐射20min,每日1次,每周6d;其余各组接受LIPUS假辐射。第6天收集各组细胞,应用免疫印迹(Western blot)技术检测软骨细胞中Ⅱ型胶原、蛋白多糖(Acan)、基质金属蛋白酶(MMP)-13、整合素β1、磷酸化FAK(p-FAK)、磷酸化p38(p-p38)的蛋白含量。 结果免疫细胞化学染色显示,模型组软骨细胞表达的COL2免疫反应物显著少于对照组。Western blot检测显示,模型组COL2、Acan蛋白含量［(0.16±0.04)、(0.12±0.02)］较对照组［(0.55±0.03)、(0.62±0.03)］降低,MMP-13、整合素β1、p-FAK和p-p38蛋白含量［(0.49±0.04)、(0.34±0.04)、(0.33±0.05)和(0.51±0.04)］较对照组［(0.07±0.02)、(0.13±0.03)、(0.16±0.04)和(0.10±0.03)］增高,且组间差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,治疗组COL2、Acan、整合素β1和p-FAK蛋白含量［(0.42±0.07)、(0.50±0.07)、(0.74±0.06)和(0.64±0.07)］增高,而MMP-13、p-p38蛋白含量［(0.37±0.06)、(0.37±0.08)］下降,差异有统计学意义(P<0.05);而抑制剂组COL2、Acan、MMP-13、整合素β1、p-FAK和p-p38蛋白含量［(0.19±0.04)、(0.09±0.03)、(0.51±0.03)、(0.33±0.02)、(0.30±0.05)和(0.53±0.04)］无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),但与对照组和治疗组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论LIPUS可通过整合素β1-FAK-p38 MAPK通路抑制脂肪因子诱导的软骨细胞MMP-13增高,减少COL2、Acan降解,从而对膝关节脂肪垫共培养下的软骨细胞起一定的保护作用。     

丝裂原活化蛋白激酶信号通路对骨关节炎软骨的作用

背景：骨关节炎的主要病理过程是软骨损伤,而软骨细胞间信号转导的异常是软骨损伤的重要因素。目的：综合分析丝裂原活化蛋白激酶信号通路的最新进展,进一步分析丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在骨关节炎软骨中的作用。方法：由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库（CNKI：1990/2011）和Pubmed数据库（1990/2011）,检索词分别为骨性关节炎,关节软骨,ERK,JNK,P38,MAPK signaling palhway,osteoarthritis,chondrocytes,语言分别设定为中文和英文。纳入有关MAPKs信号通路及其相关蛋白激酶对骨关节炎软骨作用的研究,排除重复性研究。结果与结论：保留32篇文献进一步分析。结果发现,丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性,通过保守的三级酶促级联反应激活转录因子,调节特定的基因表达。目前已证实,丝裂原活化蛋白激酶信号参与并调控关节软骨中软骨细胞的增殖、分化、凋亡,而丝裂原活化蛋白激酶信号的失调在骨关节炎的发生、发展中扮演着十分重要的角色。明确丝裂原活化蛋白激酶信号通路在骨关节炎发病机制中的确切作用将有助于骨性关节炎的靶向治疗。     

Advanced glycation end products‐induced chondrocyte apoptosis through mitochondrial dysfunction in cultured rabbit chondrocyte

Advanced glycation end products (AGEs) are an important mediator in osteoarthritis (OA) and cause apoptosis in articular chondrocytes. Mitochondrial function is involved in modulating apoptosis of articular chondrocytes. This study was performed to investigate the mechanism of AGEs‐induced chondrocyte apoptosis. The ratio of apoptotic cell and cell viability was surveyed by TUNEL, MTT,LDH release assay. The reactive oxygen species was determined by the fluorescent probe 2’, 7’‐dichlorofluorescein diacetate. The expression of caspase‐3 and cytochrome c was detected by Western blot. The mitochondrial membrane potential (?Ψm) was evaluated by rhodamine‐123 fluorescence. We found that AGEs induced apoptosis in primary rabbit chondrocytes, upregulation of ROS production, cytochrome c, and caspase‐3 levels. Simultaneously, AGEs decreases the levels of ?Ψm and ATP production; however, the antibody of AGEs (sRAGE) and antioxidant‐N‐acetylcys‐teine (NAC) significantly reversed AGEs‐induced the above damage thus to protect the cells from apoptosis. These observations suggested that the mechanism of AGEs‐induced chondrocyte apoptosis was primarily via ROS production and mitochondria‐mediated caspase‐3 activation.     

自体软骨细胞移植技术的回顾与展望

目的：在过去10年中，自体软骨细胞移植技术成为治疗关节软骨缺损的最佳方案。回顾自体软骨细胞移植技术的发展过程并对其未来方向作以简单设想。 资料来源：应用计算机检索Medline 1957-01／2005-09的文章，检索词为“autologous／autogeneous chondrocyte implantation／transplantation．cartilage defect，ACI”，限定文章语言种类为English；同时计算机检索中国期刊全文数据库1994-01／2005-09期间的相关文章，检索词“骨性关节炎、关节软骨剥脱、关节软骨缺损、关节软骨损伤、软骨细胞移植、自体软骨细胞移植”，限定文章语言种类为中文。另外在google搜索引擎及有关生物医学公司网站搜集相关资料。 资料选择：纳入标准：①软骨细胞体外培养及移植的基础理论。②动物实验。③FDA审批文件。④临床应用报告。⑤患者随访分析。⑥自体软骨细胞移植技术与其他治疗方法疗效对比。排除标准：①较陈旧的文献。②重复研究。 资料提炼：共收集到300余篇（页）与关节软骨损伤、缺损及其治疗相关的文献及网页，其中56篇（页）符合纳入标准，排除的240篇（页）文章系同一类重复性研究和近似的网络文章。 资料综合：①软骨细胞的体外大规模培养技术和在动物体进行的软骨细胞移植实验为自体软骨细胞移植在人体的进一步研究奠定了理论基础。②初期的自体软骨细胞移植技术通过缝合自体骨膜来制造封闭关节软骨缺损病灶的空腔，再将体外培养扩增后的自体软骨细胞混悬液注射进入该空腔从而使细胞在病灶处形成新生软骨。③后发展为胶原膜被用来替代自体骨膜作为自体软骨细胞移植术中的病灶封闭材料。④近年来又研制出将体外培养扩增后的自体软骨细胞与Ⅰ／Ⅲ型胶原膜复合制成固态膜片，再将该膜用生物胶贴附在关节软骨缺损部位，移植的细胞以胶原膜为基质而增生，修复原软骨缺损。⑤基质诱导的自体软骨细胞移植技术还不是最完美的方案，仍然存在不足。因此需要向更安全、有效，更易于运输、保存及更低制造成本等方向研究。 结论：经过lO多年的不断改进，自体软骨细胞移植技术已经成为目前治疗关节软骨缺损的最佳方案，其新一代的基质诱导的自体软骨细胞移植技术应该得到临床普及来治疗这一疾病。     

Magnetic resonance imaging of autologous chondrocyte implantation

There is now over 10 years experience with autologous chondrocyte implantation (ACI) for the management of full-thickness chondral injuries in the knee. This article briefly reviews the surgical procedure, the time lines of graft maturation, and patient rehabilitation in the context of postoperative magnetic resonance imaging (MRI) assessment. The normal and abnormal appearances of ACI repair cartilage on MR images are described, with an emphasis on the MR appearances of the complications that may occur after this procedure, and the usefulness of MR imaging for the surgeon.     

自体软骨细胞移植技术的回顾与展望

目的:在过去10年中,自体软骨细胞移植技术成为治疗关节软骨缺损的最佳方案。回顾自体软骨细胞移植技术的发展过程并对其未来方向作以简单设想。资料来源:应用计算机检索Medline1957-01/2005-09的文章,检索词为“autologous/autogeneouschondrocyteimplantation/transplantation,car-tilagedefect,ACI”,限定文章语言种类为English;同时计算机检索中国期刊全文数据库1994-01/2005-09期间的相关文章,检索词“骨性关节炎、关节软骨剥脱、关节软骨缺损、关节软骨损伤、软骨细胞移植、自体软骨细胞移植”,限定文章语言种类为中文。另外在google搜索引擎及有关生物医学公司网站搜集相关资料。资料选择:纳入标准:①软骨细胞体外培养及移植的基础理论。②动物实验。③FDA审批文件。④临床应用报告。⑤患者随访分析。⑥自体软骨细胞移植技术与其他治疗方法疗效对比。排除标准:①较陈旧的文献。②重复研究。资料提炼:共收集到300余篇(页)与关节软骨损伤、缺损及其治疗相关的文献及网页,其中56篇(页)符合纳入标准,排除的240篇(页)文章系同一类重复性研究和近似的网络文章。资料综合:①软骨细胞的体外大规模培养技术和在动物体进行的软骨细胞移植实验为自体软骨细胞移植在人体的进一步研究奠定了理论基础。②初期的自体软骨细胞移植技术通过缝合自体骨膜来制造封闭关节软骨缺损病灶的空腔,再将体外培养扩增后的自体软骨细胞混悬液注射进入该空腔从而使细胞在病灶处形成新生软骨。③后发展为胶原膜被用来替代自体骨膜作为自体软骨细胞移植术中的病灶封闭材料。④近年来又研制出将体外培养扩增后的自体软骨细胞与Ⅰ/Ⅲ型胶原膜复合制成固态膜片,再将该膜用生物胶贴附在关节软骨缺损部位,移植的细胞以胶原膜为基质而增生,修复原软骨缺损。⑤基质诱导的自体软骨细胞移植技术还不是最完美的方案,仍然存在不足。因此需要向更安全、有效,更易于运输、保存及更低制造成本等方向研究。结论:经过10多年的不断改进,自体软骨细胞移植技术已经成为目前治疗关节软骨缺损的最佳方案,其新一代的基质诱导的自体软骨细胞移植技术应该得到临床普及来治疗这一疾病。     

骺板软骨细胞的冻存及复苏

目的　研究骺板软骨细胞冻存的方法。方法　取对数生长期的骺板软骨细胞 ,加入配制好的冻存液 (冻存液A :培养液与DMSO ;冻存液B :含 5 %小牛血清的培养液与DMSO ;冻存液C :含 2 0 %小牛血清的培养液与DMSO ;冻存液D :小牛血清与DMSO混合 ;其中DMSO终浓度均为 10 %。) ,冻存。细胞复苏后用台盼蓝拒染试验检测细胞存活率。然后接种于培养皿中 ,采用苏木 伊红染色和甲苯胺蓝染色 ,观察细胞形态及合成糖胺多糖的能力。结果　细胞活率为 :A冻存液 70 % ,B冻存液 75 % ,C、D两种冻存液无明显差别 ,分别为 89%和 92 %。复苏的细胞贴壁时间延迟 ,但培养 72小时以后 ,细胞活力明显增强。甲苯胺蓝异染提示 ,经冷冻保存后软骨细胞仍能保持合成异染基质 (糖胺多糖 )的能力。结论　本实验冻存、复苏的方法结果稳定 ,可用于保存骺板软骨细胞。     

体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象

背景：兔是软骨组织工程研究中应用非常广泛的实验动物模型,关节软骨细胞的去分化现象已经被广泛认可.目的：观察体外传代培养过程中兔关节软骨细胞的去分化现象.方法：将从新西兰大白兔膝关节分离获取的原代软骨细胞进行传代培养至第7代,对细胞生长、形态、基质分泌以及基因表达等方面分别采用细胞计数,显微镜观察,F机动蛋白染色、番红O染色,糖胺聚糖定量测定以及半定量聚合链式反应进行鉴定和比较.结果与结论：光学显微镜下,兔关节软骨细胞在体外传代培养过程中细胞形态由小且圆形或多角形,逐步转变大且为成纤维细胞样的梭形形态,对F机动蛋白的染色进一步佐证了这样的形态变化.细胞计数结果表明,细胞增殖能力随代次增加显著下降,特别是第3代以后的软骨细胞基本无明显增殖;经过番红 O 染色以及定量测定糖胺聚糖的含量,发现软骨特性胞外基质分泌量从第2代细胞开始就呈现显著的降低.半定量聚合链式反应检测结果表明,随着传代次数的增加,特别是第3代以后,软骨相关特征分子（包括Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、软骨寡聚基质蛋白和SOX9等）基因表达水平下调;而与去分化相关的特征分子Ⅰ型胶原和多能蛋白聚糖基因表达水平上调,同时,细胞表面分子CD90基因表达上调,而CD14基因表达未见明显变化.结果证实,兔软骨细胞在体外传代过程中可出现快速地去分化现象,呈现出特征基因表达水平的变化,第3代以内的软骨细胞适合应用于软骨组织再生修复.     

改良分步消化法培养原代软骨细胞

背景：胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂,容易污染,但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道。目的：采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,以获取大量纯净的软骨细胞。方法：将新西兰白兔6只随机分2组,酶消化法组运用酶消化法分两步获取原代软骨细胞,对照组用传统法进行原代软骨细胞培养。培养1周后观察两组培养的软骨细胞的生长状态,并进行细胞鉴定、计数,评估改良后的方法对细胞的影响。结果与结论：酶消化法组采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞,与对照组相比,可将6h以上的消化时间缩短至3h。两组原代软骨细胞培养24h均多呈圆形,悬浮状态,48h后贴壁,培养1周后,两组软骨细胞可铺满培养瓶底。结果证实,采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,在缩短了消化时间的同时其细胞生长及形态变化均无改变,可以顺利获取大量纯净的软骨细胞。     

改良分步消化法培养原代软骨细胞

背景:胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂,容易污染,但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道.目的:采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,以获取大量纯净的软骨细胞.方法:将新西兰白兔6只随机分2组,酶消化法组运用酶消化法分两步获取原代软骨细胞,对照组用传统法进行原代软骨细胞培养.培养1周后观察两组培养的软骨细胞的生长状态,并进行细胞鉴定、计数,评估改良后的方法对细胞的影响.结果与结论:酶消化法组采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞,与对照组相比,可将6 h以上的消化时间缩短至3 h.两组原代软骨细胞培养24 h均多呈圆形,悬浮状态,48 h后贴壁,培养1周后,两组软骨细胞可铺满培养瓶底.结果证实,采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,在缩短了消化时间的同时其细胞生长及形态变化均无改变,可以顺利获取大量纯净的软骨细胞.