改良分步消化法培养原代软骨细胞

背景:胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂,容易污染,但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道.目的:采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,以获取大量纯净的软骨细胞.方法:将新西兰白兔6只随机分2组,酶消化法组运用酶消化法分两步获取原代软骨细胞,对照组用传统法进行原代软骨细胞培养.培养1周后观察两组培养的软骨细胞的生长状态,并进行细胞鉴定、计数,评估改良后的方法对细胞的影响.结果与结论:酶消化法组采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞,与对照组相比,可将6 h以上的消化时间缩短至3 h.两组原代软骨细胞培养24 h均多呈圆形,悬浮状态,48 h后贴壁,培养1周后,两组软骨细胞可铺满培养瓶底.结果证实,采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,在缩短了消化时间的同时其细胞生长及形态变化均无改变,可以顺利获取大量纯净的软骨细胞.     

犬关节软骨细胞的体外分离与培养

背景：自1967年Manning等提出的通过胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法分离软骨细胞以来,软骨细胞的体外分离培养研究较多,但目前尚无统一标准。目的：研究犬关节软骨细胞在体外分离以及培养的条件,寻求体外扩增软骨细胞较简便、可行、高效的实验方法。方法：取3周龄幼犬关节软骨组织,应用胰酶、胶原酶制定8种消化方法获取软骨细胞,对比不同方法所获取细胞数量及细胞成活率,分离细胞进行原代及传代培养,观察各代软骨细胞形态。结果与结论：在体外分离犬关节软骨细胞的各种方法中,单纯应用Ⅱ型胶原酶消化法获得的软骨细胞数最多,细胞成活率最高。软骨细胞可以通过体外培养获得扩增,并且维持良好的细胞形态及表型,但仅限于5代以内。     

两种消化酶在培养晶状体上皮细胞中的消化作用

目的：分析Ⅰ型胶原酶和胰酶在晶状体上皮细胞体外培养中的不同消化作用,以寻找更好的实验方法。方法采用胰酶消化培养法,Ⅰ型胶原酶消化培养法,分别进行晶状体上皮细胞的原代培养,设立对照组和实验组,倒置相差显微镜观察细胞的生长情况,并通过台盼蓝染色观察经消化酶解后游离细胞的存活数量,判别两组间消化作用的差异。结果Ⅰ型胶原酶消化的组织片更容易贴壁,生长速度更快,其游离细胞台盼蓝不着色率为（78．85±6．78）％,胰酶消化法为（27．20±3．28）％,两种酶消化后细胞存活率比较,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论Ⅰ型胶原酶消化法培养晶状体上皮细胞的成功率远优于传统改良的胰酶消化法。     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较

背景：通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的：对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法：①预损伤法：预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法：直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论：预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义（P〉0.05）。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

乳兔成骨细胞原代培养与鉴定：改良胶原酶与胰酶的分段消化

背景：成骨细胞获取的方法较多,如何简便而迅速的获得高纯度的成骨细胞成为研究的热点。目的：比较组织块法、胶原酶消化法、改良胶原酶和胰酶分段消化法体外培养纯化乳兔颅骨来源的成骨细胞结果及其细胞的生物学特点。方法：取新生24 h内新西兰大白兔乳兔颅盖骨,采用组织块法、胶原酶消化法和改良胶原酶和胰酶分段消化法分离获取兔原代成骨细胞,并进行传代培养。通过倒置显微镜下形态学观察、锥虫蓝排斥法计数活细胞率及MTT法绘制细胞生长曲线、茜素红染色、细胞培养上清液碱性磷酸酶和骨钙素检测、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫组织化学法和RT-PCR检测骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达等对成骨细胞进行鉴定。结果与结论：分离培养的成骨细胞均一性好、增殖能力强,具备成骨细胞的典型特征,茜素红染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,Ⅲ型胶原免疫组织化学染色阴性,细胞培养上清液碱性磷酸酶、骨钙素均有表达,PT-PCR结果有Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素mRNA表达。改良胶原酶和胰酶分段消化法较传统胶原酶消化法有更高的细胞获取率,更好的细胞活性,且比传统胶原酶消化法耗时短（P〈0.05）;组织块法操作方法最为简单,细胞活性最高,但是细胞产出率最低、耗时最长,不适合用于成骨细胞大规模培养。用改良的胶原酶和胰酶分段消化法可获得数量较多且纯度较高的成骨细胞,可以成为一种相对可靠、有效的原代成骨细胞的体外培养方法。     

不同消化酶对体外培养的原代乳鼠雪旺细胞的影响

目的　比较不同消化酶对体外培养的原代乳鼠雪旺细胞的影响。方法　取1周龄SD乳鼠坐骨神经,分别用胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ型、混合酶消化,相同方法及实验条件下进行雪旺细胞培养,观察细胞形态、计算2 4h贴壁活细胞百分比及MTT微量比色法比较细胞的生长增殖状况。结果　胰蛋白酶消化组细胞收获量相对最小,细胞损伤程度较大;胶原酶组细胞有一定程度损伤;混合酶组细胞收获量最大,细胞生长状态较好。结论　单纯使用胰蛋白酶或胶原酶消化对原代雪旺细胞的活性及增殖有一定影响,采用胰蛋白酶与胶原酶联合消化效果较好。     

骨关节炎软骨细胞的体外分离培养

背景:由于体外分离培养骨关节炎患者软骨细胞存在难度,同时软骨组织中因富含大量的基质,且软骨细胞分布于其中的软骨陷窝中,因此与其他细胞相比,软骨细胞的分离更为困难.目的:从骨关节炎行人工膝关节置换者的关节软骨中分离软骨细胞,并改良其酶消化法分离软骨组织,观察软骨细胞的生物学特性.设计、时间及地点:对比观察,实验于2007-04/2008-03在解放军第三军医大学烧伤研究所实验室完成.对象:标本取材于解放军第三军医大学西南医院关节外科中心同期收治的10例人工膝关节置换患者软骨组织(＞3 cm).方法:切取原发性骨关节炎患者关节软骨,将软骨剪成1mm×1 mm×1mm左右的碎块,以Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶消化分离关节软骨细胞,同期对比用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶消化法消化软骨后的收获细胞数及细胞成活率,分离细胞进行原代和传代培养.主要观察指标:以倒置相差显微镜观察体外培养软骨细胞形态;以甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行软骨细胞鉴定;四甲基偶氮唑盐法测定骨关节炎细胞增殖情况.结果:改良的Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶法,对原代关节软骨细胞的分离取得了优良而稳定的效果,与传统的胰蛋白酶消化法相比,收获细胞数为3.72×106,细胞存活率为97.5%,二者相比有显著性差异(P＜0.05).体外培养观察软骨细胞贴壁和生长均较缓慢.原代和传代后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝异染反应均较弱.软骨细胞增殖和生长缓慢.结论:Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶分离骨关节炎患者软骨细胞的技术简单且易操作,分离培养的软骨细胞符合骨关节炎时软骨退变的表现,可为骨关节炎的病因研究及软骨细胞移植治疗骨性关节炎提供实验基础.     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较(英文)

背景:通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的:对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法:①预损伤法:预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法:直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论:预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P>0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶消化获取关节软骨细胞

背景:近年来,众多研究欲采用体外分离培养的关节软骨细胞作为修复缺损的关节软骨的种子细胞,然而,获得纯化的具有生物活性的关节软骨细胞较为困难.目的:拟运用胰蛋白酶与Ⅱ型胶原酶联合消化获取关节软骨细胞.方法:从SD大鼠的正常股骨及胫骨关节表面获取关节软骨,先后运用0.25%的胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶消化,显微镜下见大量细胞游离后,弃去大块的未消化的关节软骨碎片,离心,去上清,PBS洗涤2次后,加入软骨细胞原代培养液进行培养、增殖.应用甲苯胺蓝及苏木精-伊红染色方法检验所得细胞是否为关节软骨细胞.结果与结论:在严格掌握酶的浓度及消化时间的前提下,通过0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶联合酶解关节软骨的方法,成功从大鼠股骨及胫骨关节软骨内分离培养出细胞,并经过甲苯胺蓝染色及苏木精-伊红染色证实,所得的细胞为具有生物活性的关节软骨细胞.     

改良型混合酶消化法培养小鼠乳腺上皮细胞

背景:目前采用的A型胶原酶和胰蛋白酶混合酶分离乳腺细胞团的方法操作复杂,实验条件要求高.目的:观察改良型混合酶消化法能否成功进行乳腺上皮细胞的体外培养.方法:采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶(1∶1∶1)混合消化直接用眼科剪剪碎的小鼠乳腺组织,37 ℃振荡消化获取乳腺细胞团,并采用差速贴壁法去除成纤维细胞,将细胞团接种于细胞培养瓶进行培养.结果与结论:倒置显微镜下观察显示,改良型混合酶消化法能获得较多的细胞团,且培养12 h后细胞团绝大多数贴在细胞瓶壁,培养72 h后细胞团完全铺开融合成片,细胞呈典型的铺路石样.免疫荧光细胞化学染色结果显示,培养细胞角蛋白18呈阳性反应.说明应用改良型混合酶消化法能在短时间内获得大量较纯的乳腺上皮细胞.     

成人关节软骨细胞增殖与人参皂甙Rg1的促进作用

背景：人参总皂甙的主要有效成分为人参皂甙Rg1,有促进细胞增殖、抗衰老、抗细胞凋亡、抗炎及抗自由基等作用,但以往实验对象多为鼠、兔等动物的关节软骨细胞。目的：体外培养成人软骨细胞,观察人参皂甙Rg1对体外培养的成人关节软骨细胞增殖的促进作用。方法：实验分2组,Rg1组使用含质量浓度为40mg/L人参皂甙Rg1的DMEM培养液培养,对照组使用未加人参皂甙的DMEM培养液培养,每日应用倒置相差显微镜观察细胞生长情况至第7天,并进行细胞计数。同时培养至第6天检测软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：对照组自培养第2天起细胞进入对数增殖期,到第7天细胞数约为接种时的8倍。Rg1组自培养第2天起细胞增殖能力较对照组增强（P〈0.05）,到第7天细胞数约为接种时的18倍（P〈0.05）。免疫组织化学SABC法检测结果显示,Rg1组与对照组细胞胞浆均可见Ⅱ型胶原表达,两组差异无显著性意义（P〉0.05）。说明人参皂甙Rg1可促进成人软骨细胞的增殖。     

滑膜间充质干细胞与软骨细胞三维条件下混合培养向软骨细胞的分化

背景：软骨细胞通过自分泌及旁分泌的作用可以为滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化提供所需的生长因子及微环境,三维条件下更有利于细胞的黏附增殖与分化。目的：观察滑膜间充质干细胞与软骨细胞混合培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中向成软骨细胞分化的能力。方法：取SD大鼠滑膜组织及软骨组织,用酶消化法获得滑膜间充质干细胞及软骨细胞分别进行培养。取第3代滑膜间充质干细胞及第2代软骨细胞,将二者以1∶2的比例混合培养负载于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料21 d,进行激光共聚焦扫描及免疫组织化学检测。结果与结论：培养72 h后,扫描电镜观察细胞黏附于支架材料表面,并可见细胞分泌大量基质成分。培养21 d后,激光共聚焦扫描可见细胞在支架表面分布均匀,逐层扫描后细胞逐渐减少。免疫组织化学检测可见基质能被Ⅱ型胶原染色,细胞染色呈现棕黄色。结果表明壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料提供三维生长空间,利用软骨细胞分泌生长因子及细胞间的相互作用可以诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化。     

冷酶消化法分离和培养新生大鼠许旺细胞

背景：常规酶消化法在许旺细胞分离培养实验中应用较多,但由于胰蛋白酶在37℃超过30min对细胞有毒性作用,会对许旺细胞的数量和纯度有一定的影响。目的：探索快速分离和培养大量许旺细胞的新方法。方法：采用4℃胰蛋白酶消化剥离好的乳鼠坐骨神经6~18h分离许旺细胞,培养一段时间,进行MTT实验绘制细胞生长曲线和苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色观察许旺细胞的形态,并对阳性细胞进行计数。结果与结论：结果得到的细胞数量超过1×106,经抗S-100蛋白免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,细胞纯度达到90%以上。从培养的细胞形态和细胞生长曲线可见,冷酶消化法是一种简单快捷的方法,其细胞具有良好的生物学特性,在分离时间、细胞数量和纯度、细胞的生物活性均达到临床上的要求。     

人脂肪来源间充质干细胞成骨及成软骨的潜能

背景:人脂肪来源间充质干细胞是种具有较强的体外增殖和多系分化能力的成体干细胞,可以从美容吸脂手术中获得,取材方便,原料来源丰富,在生物治疗应用方面蕴藏着巨大的价值。目的:体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,探讨其基本生物学特性及成骨成软骨的潜能。方法:取美容吸脂获得的脂肪组织,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养;观察细胞形态、测定细胞周期、流式细胞仪鉴定细胞表面标志;取第3代细胞,分别加入成骨诱导培养基及成软骨诱导培养基行体外成骨及成软骨诱导。结果与结论:体外培养人脂肪来源间充质干细胞呈纤维样形态,原代细胞24h内贴壁,培养5~7d后开始形成细胞集落;经细胞周期检测显示G0/G1,S和G2/M所占比例分别为(88±2)%,(12±2)%和0.03%。经流式细胞仪检测CD29和CD105呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达。RT-PCR检测显示,人脂肪间充质干细胞经成骨诱导分化后细胞中骨桥蛋白mRNA呈阳性表达,经软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原mRNA呈阳性表达。结果证实,实验成功体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,其具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。     

人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化

背景：关于人脐带间充质干细胞的分离培养方法不一,如何提高人脐带来源间充质干细胞获得效率的问题尚未解决。目的：优选人脐带来源间充质干细胞制备的消化酶组分。方法：无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带近胎儿段,按不同混合酶浓度比值划分为3组,混合酶Ⅰ组成分为0.4%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅱ组成分为0.1%Ⅱ型胶原酶、0.4%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅲ组成分为0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶。每组再按消化时间分为1,2,3h3个亚组。最后重悬细胞终体积均定位4mL并计数,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞。结果与结论：采用3种不同混合酶浓度进行消化,发现相同消化时间内,混合酶Ⅲ组消化细胞最多（P〈0.05）。在作用3h时,混合酶Ⅲ组获取的细胞中活细胞比值显著低于混合酶Ⅰ组和混合酶Ⅱ组（P〈0.01）。提示0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶混合液消化脐带组织块2h为获取脐带间充质干细胞的最佳条件。     

改性聚乳酸-羟基乙酸/Ⅰ型胶原复合支架与兔耳软骨细胞的细胞相容性

背景:聚乳酸-羟基乙酸是一种应用前景较好的细胞支架材料,其亲水性和细胞亲和性较差,因此对其改性很有必要.目的:观察改性聚乳酸-羟基乙酸/Ⅰ型胶原复合支架的亲水性及与兔耳软骨细胞的细胞相容性.方法:利用多聚赖氨酸对聚乳酸-羟基乙酸改性后与Ⅰ型胶原构成改性复合支架,倒置显微镜下观察支架的大体结构.将改性复合支架(实验组)与聚乳酸-羟基乙酸支架(对照组)分别浸泡在双蒸水中,间隔0.5,1,2,4,8,12,24 h后计算吸水率.用酶消化法培养兔耳软骨细胞并传代,取第2代软骨细胞,浓度为1×10~(11)L~(-1)接种在两种支架上并培养,倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况,采用细胞计数法计算细胞接种24 h后支架对细胞的吸附率;以及采用细胞增殖法(MTT比色试验)分别于1,2,4,6 d测细胞吸光度值.结果与结论:改性复合支架具有高孔隙率,表面粗糙度较对照组增加.两种支架吸水率在相同时间点比较差异有显著性意义(P<0.01),说明改性复合支架具有较好的亲水性.第2代软骨细胞接种后24 h,实验组对细胞的吸附率为0.908 0±0.019 2,对照组为0.733 2±0.047 5,两组比较差异有显著性意义(P<0.05),说明改性复合支架具有较好的细胞亲和性.软骨细胞在实验组和对照组支架上接种培养后1,2,4,6 d吸光度值比较,差异均有显著性意义(P<0.05),说明改性复合支架对细胞增殖有显著的促进作用.     

透明质酸对人骨关节炎软骨细胞骨桥蛋白和CD44表达的影响

背景：软骨进行性破坏为晚期骨关节炎的特征性病变,骨关节炎相关因子透明质酸、骨桥蛋白、CD44在骨关节炎软骨中表达增加。目的：通过透明质酸干预体外培养的人膝骨关节炎软骨细胞,探讨透明质酸对人膝骨关节炎软骨细胞CD44与骨桥蛋白表达的影响。方法：将软骨标本进行体外培养获取纯化的软骨细胞,分为3组：空白对照组、透明质酸干预组（100 mg/L）和透明质酸酶干预组（200 mg/L）。培养48 h后,采用Real-time Q PCR检测软骨细胞骨桥蛋白mRNA,CD44mRNA表达水平。用SPSS 17.0统计软件包分析骨桥蛋白mRNA和CD44 mRNA经透明质酸干预前后表达的差异。结果与结论：透明质酸组的骨桥蛋白mRNA表达水平较空白组高,透明质酸酶组的骨桥蛋白mRNA表达水平较空白组低;透明质酸组及透明质酸酶组的CD44 mRNA表达水平均较空白组低。结果提示透明质酸可以上调骨关节炎软骨细胞骨桥蛋白的表达;透明质酸在骨关节炎软骨细胞内对CD44表达的影响具有双相性,其影响结果可能与透明质酸的相对分子质量有关。     

四种不同处理方法体外培养大鼠滑膜细胞

背景：常用的原代滑膜细胞培养方法主要是组织块培养法、酶消化法、机械分散法等。目的：用4种不同方法处理大鼠滑膜组织观察体外培养中滑膜细胞生长情况,探索大鼠膝关节滑膜细胞体外培养的最优方法。方法：将大鼠滑膜细胞组织块组与剪碎组分别按4种不同的方法处理：①不加消化酶消化。②加Ⅱ型胶原酶消化。③加胰蛋白酶消化。④先加Ⅱ型胶原酶消化、再加胰蛋白酶消化。各组处理后分别进行自然沉壁和人工贴壁培养,利用倒置显微镜观察不同方法下滑膜细胞的生长状况。结果与结论：培养9d后,组织剪碎不加消化酶人工贴壁培养的细胞得数为2.03×106,是所有培养方法中细胞的数最多的,细胞活力为95%,细胞活力最强,优于自然贴壁。提示组织的形状、所加入酶的成分以及沉壁的方式均对细胞的生长有重要影响,大鼠膝关节滑膜细胞体外培养的最优方法为组织剪碎不加消化酶人工贴壁培养。