结缔组织生长因子反义寡核苷酸对人增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子表达及胶原合成的作用

目的:观察结缔组织生长因子反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导的人增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子mRNA、蛋白的表达和胶原合成的影响。方法:实验于2005-03/12在哈尔滨医科大学免疫教研室完成。选取哈尔滨医科大学附属第二医院整形美容中心手术标本,包括正常皮肤和增生性瘢痕。将手术中切下的正常皮肤、增生性瘢痕组织在无菌条件下去除表皮后采用组织块贴壁法培养于含体积分数为0.1的胎牛血清的RPMI1640培养液中,置37℃,体积分数为0.05的CO2条件下原代培养。经2.5g/L胰蛋白酶消化传代,传代至3～5代时进行实验。实验分4组:①正常皮肤成纤维细胞组。②增生性瘢痕成纤维细胞组。③增生性瘢痕成纤维细胞 5.0mg/L转化生长因子β1组(简称转化生长因子β1组)。④增生性瘢痕成纤维细胞 5.0mg/L转化生长因子β1 结缔组织生长因子反义寡核苷酸组(简称反义寡核苷酸组)。用5.0mg/L转化生长因子β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞后,以脂质体介导方法将结缔组织生长因子反义寡核苷酸转染增生性瘢痕成纤维细胞中,用反转录-聚合酶链反应方法和WesternBlot方法检测细胞中结缔组织生长因子mRNA和蛋白质的表达;采用3H-脯氨酸掺入法检测细胞的胶原合成量。结果:①反转录-聚合酶链反应结果:结缔组织生长因子mRNA在正常皮肤成纤维细胞中无表达,在增生性瘢痕成纤维细胞中表达增强,转化生长因子β1刺激后表达量0.64±0.32明显高于增生性瘢痕成纤维细胞0.31±0.14,差异显著(P<0.01);反义寡核苷酸组可以大部分抑制结缔组织生长因子mRNA的表达,表达量0.12±0.62明显低于增生性瘢痕成纤维细胞组和转化生长因子β1组,差异显著(P<0.01)。②Western印迹结果:蛋白水平趋势与mRNA水平相一致。结缔组织生长因子蛋白在正常皮肤成纤维细胞中无表达,在增生性瘢痕成纤维细胞中表达增强84.63±11.49,转化生长因子β1刺激后表达量102.89±14.35明显高于增生性瘢痕成纤维细胞组,差异显著(P<0.01);反义寡核苷酸组可以大部分抑制转化生长因子β1的作用,结缔组织生长因子蛋白表达量41.75±10.56低于增生性瘢痕成纤维细胞组和转化生长因子β1组(P<0.01)。③结缔组织生长因子反义寡核苷酸对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的作用:增生性瘢痕成纤维细胞组、转化生长因子β1组、反义寡核苷酸组的3H-脯氨酸掺入率分别为5381±185,8273±357,2475±859,转化生长因子β1可以显著增加成纤维细胞胶原的合成(P<0.01);而结缔组织生长因子反义寡核苷酸对转化生长因子β1刺激后的成纤维细胞胶原合成有明显抑制作用,差异显著(P<0.01)。结论:结缔组织生长因子反义寡核苷酸能够抑制转化生长因子β1引起的结缔组织生长因子mRNA、蛋白质表达的增高和胶原合成的增多,表明阻断结缔组织生长因子可能是延缓瘢痕纤维化的有效手段。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对人增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子表达及胶原合成的作用

目的：观察结缔组织生长因子反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导的人增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子mRNA、蛋白的表达和胶原合成的影响。 方法：实验于2005—03／12在哈尔滨医科大学免疫教研室完成。选取哈尔滨医科大学附属第二医院整形美容中心手术标本，包括正常皮肤和增生性瘢痕。将手术中切下的正常皮肤、增生性瘢痕组织在无菌条件下去除表皮后采用组织块贴壁法培养于含体积分数为0．1的胎牛血清的RPM11640培养液中，置37℃，体积分数为0．05的CO2条件下原代培养。经2．5g/L胰蛋白酶消化传代，传代至3～5代时进行实验。实验分4组：①正常皮肤成纤维细胞组。②增生性瘢痕成纤维细胞组。③增生性瘢痕成纤维细胞＋5，0mg／L转化生长因子β1组（简称转化生长因子β1组）。④增生性瘢痕成纤维细胞＋5．0mg／L转化生长因子β1＋结缔组织生长因子反义寡核苷酸组（简称反义寡核苷酸组）。用5．0mg／L转化生长因子β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞后，以脂质体介导方法将结缔组织生长因子反义寡核苷酸转染增生性瘢痕成纤维细胞中，用反转录一聚合酶链反应方法和Western Blot方法检测细胞中结缔组织生长因子mRNA和蛋白质的表达；采用^3H-脯氨酸掺入法检测细胞的胶原合成量。 结果：①反转录-聚合酶链反应结果：结缔组织生长因子mRNA在正常皮肤成纤维细胞中无表达，在增生性瘢痕成纤维细胞中表达增强，转化生长因子β1刺激后表达量0．64&;#177;0．32明显高于增生性瘢痕成纤维细胞0．31&;#177;0．14，差异显著（P〈0．01）；反义寡核苷酸组可以大部分抑制结缔组织生长因子mRNA的表达，表达量0．12&;#177;0．62明显低于增生性瘢痕成纤维细胞组和转化生长因子β1组，差异显著（P〈0．01）。②Western印迹结果：蛋白水平趋势与mRNA水平相一致。结缔组织生长因子蛋白在正常皮肤成纤维细胞中无表达，在增生性瘢痕成纤维细胞中表达增强84．63&;#177;11．49，转化生长因子β1刺激后表达量102．89&;#177;14．35明显高于增生性瘢痕成纤维细胞组，差异显著（P〈0．01）；反义寡核苷酸组可以大部分抑制转化生长因子β1的作用，结缔组织生长因子蛋白表达量41．75&;#177;10．56低于增生性瘢痕成纤维细胞组和转化生长因子β1组（P〈0．01）。③结缔组织生长因子反义寡核苷酸对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的作用：增生性瘢痕成纤维细胞组、转化生长因子β1组、反义寡核苷酸组的^3H-脯氨酸掺入率分别为5381&;#177;185．8273&;#177;357．2475&;#177;859，转化生长因子β1可以显著增加成纤维细胞胶原的合成（P〈0．01）；而结缔组织生长因子反义寡核苷酸对转化生长因子β1刺激后的成纤维细胞胶原合成有明显抑制作用，差异显著（P〈0．01）。 结论：结缔组织生长因子反义寡核苷酸能够抑制转化生长因子β1引起的结缔组织生长因子mRNA、蛋白质表达的增高和胶原合成的增多，表明阻断结缔组织生长因子可能是延缓瘢痕纤维化的有效手段。     

秋水仙碱体外通过RhoA/ROCK信号通路缓解心脏纤维化

目的:旨在研究秋水仙碱体外对心脏纤维化的影响。方法:使用TFGβ1建立心脏纤维化的细胞模型,2.5ng秋水仙碱或DMSO处理,通过qPCR和蛋白印迹检测成纤维细胞活化的相关指标。结果:TFGβ1促进心脏成纤维细胞活化,Collagen I、α-SMA、CTGF表达增多,秋水仙碱预处理在转录和翻译水平抑制TFGβ1诱导的Collagen I、α-SMA、CTGF升高。RhoA/ROCK信号通路是TGFβ1下游信号通路之一,秋水仙碱可抑制该信号通路。结论:秋水仙碱体外通过抑制RhoA/ROCK信号通路抑制心脏成纤维细胞活化。     

Smad3和转化生长因子β1在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮肤中的表达:48∶40∶40例标本病理检测

目的:与病理性瘢痕发生机制相关的Smad3/转化生长因子β1信号传递通路研究多集中在体外成纤维细胞的培养上,在瘢痕疙瘩中的表达少见报道.检测病理性瘢痕中Smad3和转化生长因子β1蛋白的表达,探讨其在病理性瘢痕发生及发展中的作用.方法:实验标本均来自2004-06/2008-0 6河北医科大学附属唐山工人医院烧伤整形科手术患者,瘢痕疙瘩48例,年龄16～52岁;增生性瘢痕40例,年龄18～56岁;选取同期因其他手术切除的正常皮肤组织40例作为对照组.应用流式细胞术检测48例瘢痕疙瘩、40例增生性瘢痕及40例正常皮肤组织Smad3和转化生长因子β1的表达.结果:Smad3和转化生长因子β1在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中的表达明显高于正常皮肤组织中的表达(P＜0.05),Smad3和转化生长因子β1在瘢痕疙瘩和增生瘢痕中的表达差异无显著性意义(P＞0.05).瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中Smad3和转化生长因子β1表达呈正相关(r=0.489 2,P=0.000 4;r=0.471 0,P=0.002 2),Smad3和转化生长因子β1在正常皮肤组织中的表达未见明显相关性(P=0.4714).结论:Smad3和转化生长因子β1在病理性瘢痕中高表达,Smad3和转化生长因子β1的协同作用可能参与病理性瘢痕的发生发展.     

转化生长因子β、癌基因c-myc和c-fos在瘢痕形成中的作用

目的了解c-myc和c-fos蛋白产物在瘢痕中的表达情况以及转化生长因子β(TGF-β1)对其表达及胶原合成分泌的影响,探讨瘢痕增生机制。方法采用免疫组织化学方法对增生性瘢痕(HS)、非增生性瘢痕(NHS)和正常皮肤各9例标本进行了c-myc和c-fos蛋白产物的检测和比较;通过细胞培养的方法研究了TGF-β1对增生性瘢痕成纤维细胞癌基因c-myc和c-fos的表达及胶原分泌的影响。结果癌基因c-myc和c-fos蛋白产物在增生性瘢痕成纤维细胞中呈强阳性表达,TGF-β1可显著提高HS成纤维细胞c-myc和c-fos的表达及胶原合成分泌的增加。结论c-myc和c-fos蛋白产物可能是TGF-β1引起成纤维细胞内生物学效应的中间信号途径。     

转化生长因子β1Ⅱ型受体对增生性瘢痕成纤维细胞的影响

目的探讨转化生长因子β1(TGFβ1)Ⅱ型受体同源序列多肽的生物学功能及其对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响.方法根据TGFβ1Ⅱ型受体的氨基酸序列人工合成一段短肽,以增生性瘢痕成纤维细胞为靶细胞,分别于蛋白水平和mRNA水平检测该短肽对TGFβ1所诱导的细胞胶原合成的拮抗作用.结果该短肽可以明显抑制TGFβ1所诱导的增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成量及细胞内Ⅰ型前胶原mRNA的表达.结论该短肽可能作为TGFβ1 Ⅱ型受体的竞争性拮抗剂,抑制或降低了该生长因子对细胞的刺激作用.     

维药异常黑胆质成熟剂对增生性瘢痕及转化生长因子β/Smad信号通路的影响

背景：近年来,研究发现异常黑胆质成熟剂具有良好的减轻瘢痕增生的作用,但具体机制尚未清楚,考虑异常黑胆质成熟剂是否是通过影响转化生长因子β/ Smad信号通路的表达来抑制瘢痕增生的。目的：验证维药异常黑胆质成熟剂对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及对转化生长因子β/Smad 信号通路的影响。方法：用组织块法培养人增生性瘢痕成纤维细胞,将成纤维细胞分为6组：①空白对照组：加入等体积的培养液。②异常黑胆质成熟剂处理组：分成5组,分别加入质量浓度为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 g/L的异常黑胆质成熟剂。对各组细胞采用相应药物进行干预,采用MTT、流式细胞术、免疫细胞化学方法检测其在正常状况和应用维药异常黑胆质成熟剂后细胞增殖与转化生长因子β/Smad信号通路的改变。结果与结论：与空白对照组相比,异常黑胆质成熟剂对增生性瘢痕来源成纤维细胞的增殖有抑制作用,且在0.2-0.8 g/L质量浓度范围之间,随着质量浓度增加,抑制作用呈增强趋势。细胞免疫化学结果测定表明,异常黑胆质成熟剂干预后减少了成纤维细胞中转化生长因子β1的含量,增加了细胞中Smad7的含量。提示异常黑胆质成熟剂抑制瘢痕的作用可能是通过转化生长因子β/Smad 通路,使成纤维细胞增殖受阻而发挥作用的。     

基质金属蛋白酶13和转化生长因子β1在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中的表达

背景:与瘢痕疙瘩和增生性瘢痕发生机制相关的基质金属蛋白酶13和转化生长因子β1信号传递通路研究多集中在体外成纤维细胞的培养上,而在组织中的相关研究少见报道.目的:观察瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中基质金属蛋白酶13和转化生长因子β1蛋白的表达.方法:取自2004/2008唐山市工人医院烧伤整形科手术患者,瘢痕疙瘩54例,增生性瘢痕42例.选取同期45例因非感染手术切除的正常瘢痕组织作为对照组,选取同期45例正常皮肤组织作为正常对照组.应用流式细胞仪检测4组中基质金属蛋白酶13和转化生长因子β1的表达,分析两者的相关性.结果与结论:瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中转化生长因子β1的表达明显高于正常瘢痕组织和正常皮肤组织;正常瘢痕组织中转化生长因子β1的表达明显则高于正常皮肤组织,而基质金属蛋白酶13的表达与之相反.瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常瘢痕组织中基质金属蛋白酶13和转化生长因子β1表达呈负相关.由此推测基质金属蛋白酶13和转化生长因子β1在瘢痕组织中异常表达,二者可能具有协同负向作用,共同参与病理性瘢痕的发生发展.     

转化生长因子β、癌基因c—myc和c—fos在瘢痕形成中的作用

目的：了解c-myc和c-fos蛋白产物在瘢痕中的表达情况以及转化生长因子β（TGF－β1）对其表达及胶原合成分泌的影响，探讨瘢痕增生机制。方法：采用免疫组织化学方法对增生性瘢痕（HS）、非增生性瘢痕（NHS）和正常皮肤各9例标本进行了c-myc和c-fos蛋白产物的检测和比较；通过细胞培养的方法研究了TGF－β1对增生性瘢痕成纤维细胞癌基因c-myc和c-fos的表达及胶原分泌的影响。结果：癌基因c-myc和c-fos蛋白产物在增生性瘢痕成纤维细胞中呈强阳性表达，TGF－β1可显提高HS成纤维细胞c-myc和c-fos的表达及胶原合成分泌的增加。结论：c-myc和c-fos蛋白产物可能是TGF－β1旨起成纤维细胞内生物学效应的中间信号途径。     

5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和转化生长因子βⅠ型受体表达的影响

背景:很多实验已证明5-氟尿嘧啶应用于瘢痕疙瘩治疗可收到良好的效果.但作者所查针对5-氟尿嘧啶经由转化生长因子β信号通路作用于瘢痕疙瘩分子机制的报道较少.目的:实验拟观察5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和转化生长因子βⅠ型受体表达的影响.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-02/10在安徽医科大学微生物教研室完成.材料:标本分别取自因瘢痕疙瘩入院的6例整形手术患者.方法:①瘢痕疙瘩组织成纤维细胞原代培养,取4～6代传代细胞加入5个不同浓度5-氟尿嘧啶(10,20,40,80,160 μmol/L)干预24,48,72 h.②待细胞长至80%汇合时,加入5-氟尿嘧啶配成10,20,30 μmol/L 3个药物干预浓度组,每组再加入转化生长因子β1继续培养.设空白对照和单纯加转化生长因子β1(5 μg/L)的阳性对照.主要观察指标:①利用四甲基偶氮唑盐法测定瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力.②蛋白免疫印迹检测各组瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad7和转化生长因子βⅠ型受体的表达.结果:①5-氟尿嘧啶浓度为10,20 μmol/L 作用24 h 时未发现成纤维细胞死亡,与空白对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05);其他浓度下作用各组均有显著的成纤维细胞死亡现象(P < 0.01).②与空白对照组相比,转化生长因子β1组Smad7表达明显减弱,转化生长因子βⅠ型受体表达则显著增强(P均 < 0.01).③加入5-氟尿嘧啶干预后可显著增强Smad7的表达,且在5-氟尿嘧啶浓度为20 μmol/L 时的表达最强(P < 0.01).④不同浓度5-氟尿嘧啶对转化生长因子βⅠ型受体表达无明显影响.结论:5-氟尿嘧啶浓度为10～20 μmol/L 时无细胞毒性,与转化生长因子β1共同培养成纤维细胞,能够提高该细胞转化生长因子β1诱导的Smad7表达,但对于转化生长因子βⅠ型受体的表达没有明显影响.