急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34启动子的克隆及其核心区鉴定

目的:克隆急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34上游启动子序列并检测其活性、鉴定核心区域。方法:PCR扩增MLAA-34基因启动子区全长片段,将其连接至p GL3-Basic载体,克隆重组质粒;构建一系列MLAA-34基因启动子5'侧翼区截短质粒;将含MLAA-34启动子序列的重组质粒及其截短型质粒转染至U937、HEK293细胞,应用双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性,确定启动子最小活性区域,并通过生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果:构建了含有MLAA-34启动子序列的重组质粒及其截短型质粒;与空载体相比,其启动子活性明显增加(P 0. 001)。MLAA-34最小活性区域位于转录起始位点-402 bp至-200 bp之间,其中包含E2F1,MZF-1,SP1,USF2和STAT3等多个转录因子结合位点。结论:成功构建急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒,鉴定出核心启动子区,其中含有多个潜在的转录因子结合序列。     

急性单核细胞白血病新抗原MLAA-34基因突变的检测及其与疗效相关性的研究

目的:研究MLAA-34全外显子突变与白血病疗效的相关性。方法:对AML-M5组(40例)及健康对照组(5例),应用RT-PCR方法检测MLAA-34基因的表达水平,研究其对化疗疗效的影响。对该基因全部12个外显子进行测序,研究MLAA-34突变对M5患者OS和PFS的影响;分析白血病重要的5个预后基因突变与MLAA-34基因突变的相关性。结果:M5组MLAA-34基因表达显著高于正常对照组,高表达的患者化疗疗效差。E2外显子第59号碱基存在多态性,C59T位点突变的患者具有更高的MLAA-34基因表达。MLAA-34基因C59T位点突变与重要的分子标志基因FLT-3和DNMT3A的突变显著相关。结论:MLAA-34基因C59T位点突变为白血病复发的高危因素,并可成为一个白血病治疗的候选靶点。     

AML1-ETO融合蛋白对p14~(ARF)基因转录调控的影响

目的:探讨异常转录因子AML1-ETO融合蛋白对p14~(ARF)的转录调控机制。方法:应用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测转染细胞和对照组细胞以及AML-M2患者白血病细胞p14~(ARF)mRNA的表达;用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)对其p14~(ARF)启动子的甲基化状态进行分析;染色质免疫沉淀技术(Ch IP)研究转染细胞中AML1-ETO与p14~(ARF)启动子之间直接的相互作用情况;应用qRT-PCR检测5-氮杂胞苷(5-Aza)处理后细胞内p14~(ARF) mRNA表达水平。结果:转染了AML1-ETO的U937细胞系和具有AML1-ETO融合基因的AM L-M2患者中,p14~(ARF)的mRNA表达水平下调;p14~(ARF)启动子在对照组细胞株和无AML1-ETO融合基因的AML-M2患者中处于非甲基化状态,在转染细胞株和具有AML1-ETO融合基因的AML-M2患者中处于高甲基化状态;转染细胞沉淀富集的DNA中含有p14~(ARF)的启动子序列;5-Aza能上调p14~(ARF)mRNA的表达。结论:p14~(ARF)是AML1-ETO融合蛋白可能的靶基因,p14~(ARF)启动子高甲基化所致的基因沉默可能是M2b型白血病发生发展的一个重要因素。     

C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞Dlxin 1基因表达及骨形态发生蛋白2的调控机制

背景:Dlxin 1可与成骨相关转录因子Dlx、Msx家族成员相互作用调节其转录活性,骨形态发生蛋白2可诱导小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T 1/2)向成骨细胞分化.目的:对C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞中Dlxin 1基因的表达及骨形态发生蛋白2调控机制进行初探.设计、时间及地点:细胞分子水平实验,于2007-03/10在暨南大学生物工程研究所实验室完成.材料:C3H10T 1/2细胞为ATCC产品,骨形态发生蛋白2为自产,DH5α为自备.方法:用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨形态发生蛋白2对基因表达的影响,用双荧光报告载体系统搜寻Dlxin 1的上游启动子元件,用凝胶迁移实验(EMSA)对其精确定位.主要观察指标:①细胞中Dlxin 1基因mRNA的表达情况.②pGL3-Dlxin 1系列缺失突变报告载体荧光活性及启动子片段与C3H10T 1/2细胞核蛋白的结合能力检测.结果:在转录水平上骨形态发生蛋白2可以诱导Dlxin 1基因表达上调;Dlxin 1启动子基础活性和骨形态发生蛋白2诱导活性调控区域均位于转录起始位点上游-943～-728 bp之间;EMSA证实,-758～-748 bp这一片段是调控核心区域.结论:转录因子通过与Dlxin 1启动子上游TATA box结合来调控Dlxin 1基因的转录.     

MTS1基因ARF启动子基础转录调控区转录活性研究

目的　研究MTS1基因ARF启动子基础转录调控区的转录激活及其与E2 F1转录因子之间的关系。方法　以含ARF启动子基础转录调控区E2 F1结合位点野生型序列的W6重组质粒为模板 ,设计该片段中E2 F1A、B、C结合位点序列突变或缺失的引物 ,用聚合酶链反应构建该区域中E2 F1A、B、C结合位点序列突变或缺失的ZE、ZF、ZG重组质粒。再将W6、ZE、ZF、ZG重组质粒转染进Jurkat细胞 ,检测其荧光素酶报告基因的表达。结果　构建的ZE、ZF、ZG重组质粒经SacⅠ或NaeⅠ酶切鉴定和DNA序列分析得到证实。与E2 F1位点野生型重组质粒W6比较 ,突变型重组质粒ZE、ZF、ZG在Jurkat细胞中荧光素酶报告基因的表达量减少 ,以E2 F1A位点突变的重组质粒减少明显。结论　构建ARF启动子E2 F1A、B、C结合位点序列突变的重组质粒成功 ;MTS1基因ARF启动子基础转录调控区的转录激活可能与E2 F1转录因子的作用有关。     

转录因子Sp1在肝癌细胞VEGF表达调控中的作用

目的:研究转录因子Sp1在肝癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)转录调控中的作用。方法:构建VEGF启动子双报告基因质粒系统,脂质体转染至肝癌细胞株MHCC97H中,分析VEGF表达调控的主要作用区域及转录因子Sp1对VEGF转录活性的影响;采用凝胶电泳迁移率变动分析转录因子Sp1与VEGF启动子的结合活性;采用RNA干扰技术进一步分析转录因子Sp1对VEGF的转录调控作用。结果:应用VEGF全长启动子及5端缺失突变体报告基因分析发现VEGF启动子上88～-61区域是VEGF转录的最主要的调控区域;用点突变体报告基因技术发现此区域上的转录因子Sp1结合位点突变后VEGF表达明显下调;凝胶电泳迁移率变动分析证实Sp1可特异性结合于VEGF启动子上;Sp1特异性siRNA下调转录因子Sp1表达后发现VEGF的表达也随之明显下调。结论:转录因子Sp1与VEGF启动子特异性结合是VEGF转录调控最重要的机制,并进一步调控肝癌血管生成及转移复发,深入分析转录因子Sp1在肝癌中的表达将有利于探讨肝癌血管生成及转移复发机理。     

转录因子E2F1调控KIR3DL1基因表达的分子机制

目的 研究转录因子E2F1对KIR3DL1基因启动子转录活性的影响,明确其调控KIR3DL1基因表达的分子机制.方法 采用PCR方法 从K562细胞基因组DNA中扩增突变型KIR3DL1基因启动子序列,将产物连接到pGL3-Basic荧光素酶载体,构建报告重组子;采用染色质免疫共沉淀方法 检测E2F1与KIR3DL1启动子在细胞内的结合;采用阳离子脂质体SuperFect包裹突变型和野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子,然后转染K562细胞,染色质免疫共沉淀方法 检测E2F1与重组子在细胞内的结合,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性;将E2F1真核表达载体与野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子共转染K562细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.结果 成功构建突变型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子,测序证实,在K562细胞KIR3DL1启动子区1个潜在的转录因子E2F1结合位点有1个自然发生的点突变(TTTGGCGC→TTCGGCGC);E2F1完全不能与K562细胞中突变型KIR3DL1启动子结合,但能与NK-92MI细胞中没有突变的野生型KIR3DL1启动子结合;突变型KIR3DL1启动子.荧光素酶报告重组子保留了部分与E2F1的结合能力,但其相对荧光素酶活性较野生型降低了50%;共转染E2F1真核表达载体使野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子的相对荧光素酶活性增加为对照组的2倍以上.结论 转录因子E2F1参与调控KIR3DL1基因转录激活,E2F1结合位点上CpG二核苷酸的数量和甲基化模式可能影响转录因子E2F1与靶序列的结合.     

WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究

本研究探讨WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性,为开展基于WT1基因调控的白血病基因治疗奠定基础。以EGFP做报告基因,构建含有WT1基因启动子和增强子的重组表达载体;利用脂质体和电穿孔技术将重组质粒转染13个细胞株,包括WT1基因高表达的白血病细胞株(K562、NB4、THP-1、SHI-1),WT1基因低表达的白血病细胞株(U937和Jurkat);非造血细胞株中WT1基因高表达的MCF-7、T47D、293株细胞和WT1基因低表达的ECV304、SMMC7721、HT-29、SHG44细胞株;利用流式细胞术检测转基因细胞稳定表达EGFP的平均荧光强度。以平均荧光强度代表启动子和(或)增强子的转录活性。结果表明:通过基因重组技术构建了含有WT1基因启动子的表达载体pEWP,以及含有WT1基因启动子和增强子的表达载体pEWPA。就启动子的转录活性而言,在非白血病细胞株中,ECV304细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体(pEGFP-1)的16.54±2.45倍,明显高于白血病细胞株(p<0.05);MCF-7和SHG44细胞次之,分别为9.46±1.10和7.29±0.73倍,HT-29细胞表达最低,仅为0.99±0.02倍。在人类血病细胞株中,K562细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体pEGFP-1的2.93±0.27倍,明显高于Jurkat和SHI-1细胞株(p<0.05)。后二者分别为0.74±0.03和0.84±0.09倍。pEWPA可以使HT-29、SHI-1和K562细胞中WT1基因启动子的转录活性增强,分别增强到4.81、3.06和1.01倍。结论:WT1基因启动子的转录活性与细胞内在WT1基因的表达水平不相关,增强子增强部分细胞株中WT1基因启动子的转录活性,但不具有造血组织特异性。     

白血病相关基因MLAA-34在HeLa细胞中的抗凋亡作用

目的:研究白血病相关基因MLAA-34在He La细胞中的抗凋亡作用。方法:以HeLa细胞株为研究对象,构建MLAA-34重组慢病毒表达载体,建立了高表达MLAA-34的稳定转染Hela细胞株;应用As_2O_3诱导其凋亡,采用MTT法、平板克隆形成实验、流式细胞术分别检测细胞增殖能力、集落形成能力、凋亡及细胞周期分布的变化。结果:应用As_2O_3处理后,稳定转染MLAA-34的Hela细胞株的存活率明显高于对照组,其集落形成能力显著增加;MLAA-34基因高表达显著降低了HeLa细胞的凋亡率,同时相应的降低了G_2/M期细胞的比例。结论:白血病相关基因MLAA-34在HeLa细胞中具有抑制As_2O_3诱导的凋亡作用。     

急性单核细胞白血病新抗原MLAA-22的生物信息学分析及相关鉴定

本研究采用生物信息学方法对SEREX法筛库获得的急性单核细胞白血病抗原新基因MLAA-22进行分析，并进一步做基因表达鉴定。通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库检索MLAA-22基因的相关信息，分析MLAA-22抗原CTL表位，制备其多克隆抗体；利用荧光定量PCR及免疫印迹鉴定的方法，在转录翻译水平检测该基因的表达。结果表明：肿瘤抗原新基因MLAA-22 cDNA全长为2．0kb，定位于染色体17q11．2，编码631个氨基酸，蛋白分子量约72．4kD，非分泌型，亚细胞定位在胞浆，属于不稳定蛋白，但具有一定的亲水和热稳定性，无信号肽。MLAA-22有多个基序（motif），可能在细胞的生长、增殖、分化和凋亡中具有重要作用。应用Pwtean等软件分析选取了序列543—556位作为MLAA-22的抗原表位，采用多通道同步固相全自动合成系统合成15肽，将纯化后的MLAA-22预测抗原多肽通过C末端Cys的-SH与KLH偶联，免疫兔子，制备相应的多抗，ELISA法检测抗体效价1：8000。Real—time PCR和Western blot检测结果显示MLAA-22在M3患者中有不同程度的表达，且表达量高于正常人．在其他血液肿瘤细胞中低表达，但在胃、肾和前列腺癌等组织中不表达。结论：mlaua-22是一个新的急性单核细胞白血病相关抗原新基因．有进一步研究的价值。     

三七皂苷对造血细胞AP-1家族转录调控蛋白NF-E2,c-jun和c-fos的诱导作用

为了进一步研究三七总皂苷(PNS)对转录调控蛋白AP-1家族的主要成员NF-E2、c-jun和c-fos转录因子的诱导作用，探讨PNS在造血细胞内的信号传递途径，选用人粒系HL-60、红系K562、巨核系CHRF-288和Meg-01 4个细胞株作靶细胞，经PNS刺激处理后提取细胞核蛋白，分别用人抗NF-E2、c-jun和c-fos抗体与核蛋白作Western blot杂交试验，并用^32P标记的具有与NF-E2、c-jun和c-fos转录因子共同结合位点的AP-1双链寡核苷酸探针作电泳带移动阻滞试验(EMSA)。结果表明：①western blot显示PNS诱导HL-60，K562，CHRF-288和Meg-01 4株细胞的NF-E2和c-jun转录因子蛋白水平分别是未经处理细胞的1．5-2．5倍和2．0—3．0倍。诱导的c-fos蛋白在K562，CHRF-288和Meg-01 3株细胞分别提高2．0—3．0倍，但HL-60细胞的c-fos在PNS处理后无明显变化；②EMSA显示AP-1转录调控蛋白与DNA结合复合物的特异性条带，经PNS诱导后4株细胞的AP-1蛋白与DNA复合物条带密度明显高于未经处理的细胞。结论：PNS在造血细胞内对基因的转录调控涉及到AP-1家族转录因子成员NF—E2、c—jun和c—fos，通过诱导这些转录因子量的增加，与特异性DNA促进子结合的活性增高而调控与细胞增殖分化相关的基因的表达。     

三七皂甙对造血细胞GATA-1和GATA-2转录调控蛋白的诱导作用

目的　观察三七总皂甙 (PNS)对锌指结构GATA族转录调控蛋白的诱导作用 ,探讨PNS在造血细胞内的信号传递途径。方法　选择恰当浓度的PNS作用于正常人骨髓单个核细胞、HL 6 0、K5 6 2、CHRF 2 88和Meg 0 1细胞 ,2周后提取核蛋白 ,用GATA 1和GATA 2抗体行Western印迹杂交 ,检测GATA 1和GATA 2的表达情况。用3 2 P标记的GATA双链寡核苷酸探针行电泳带移动阻滞试验 (EMSA)和抗体胶移动实验 ,检测GATA DNA复合物及亚型。结果　PNS能够促进人骨髓红系、粒系祖细胞增殖。Western印迹杂交显示PNS诱导K5 6 2、CHRF 2 88和Meg 0 1细胞的GA TA 1和GATA 2蛋白表达量增高 ,分别是未经处理细胞的 1 .5～ 2 .8倍和 2 .0～ 3.1倍 ;EMSA结果表明PNS诱导三株细胞的GATA DNA结合复合物条带密度明显增高 ;HL 6 0细胞在PNS处理前后均未显示GATA活性。抗体胶移动实验证明PNS诱导的GATA DNA复合物的主要成分为GATA 1和GATA 2。免疫沉淀显示PNS诱导的GATA 1和GATA 2蛋白均处于磷酸化的功能激活状态。结论　PNS可通过诱导GATA 1和GATA 2蛋白合成增加 ,与相关基因上游调控区的启动子和 (或 )增强子结合的活性增高 ,而调控与造血细胞增殖、分化相关基因的表达     

AML1、AML1-ETO对nucb2基因转录调控活性的影响

本研究旨在探讨造血特异转录因子AML1及M2b型急性髓系白血病（AML-M2b）累及的异常融合蛋白AML1-ETO对凋亡相关基因nucb2（nucleobindin-2）启动子转录活性的影响,探索AML1-ETO对AML—M2h型白血病的分子致病机制。利用实时RT-PCR方法在AML1-ETO诱导型白血病细胞株中研究AML1-ETO在转录水平对于nucb2的调控情况;利用ChIP—qPCR方法在AML1-ETO阳性白血病细胞株中研究AML1、AML1-ETO与nucb2基因启动子之间直接的体内相互作用情况;采用双荧光素酶报告基因检测方法,研究AML1、AML1-ETO对nucb2启动子转录活性的调节作用。结果表明：AML1-ETO的表达与nucb2的表达呈负相关;nucb2可能是AML1、AML1-ETO的靶基因;AML1、AMLI—ETO皆对nucb2启动子具有转录抑制作用,且AML1-ETO对nucb2抑制更强。结论：nucb2是AML1、AML1-ETO的直接靶基因,AML1、AML1-ETO通过抑制nucb2启动子的活性对其进行转录调控。     

磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1在Notch1诱导的小鼠急性T淋巴细胞白血病发展中的作用

目的:应用Mx1-cre;Lox P系统,建立可诱导敲除PDK1的Notch1诱导的急性T淋巴细胞白血病小鼠模型,观察PDK1在急性T淋巴细胞白血病发展过程中的作用。方法:用流式细胞术检测小鼠骨髓白血病细胞的周期和凋亡率,应用实时荧光定量PCR检测小鼠白血病细胞中肿瘤相关基因和转录因子的表达水平。结果:成功建立诱导敲除PDK1的T-ALL小鼠模型;体内诱导PDK1敲除后,与对照组相比,敲除组白血病小鼠的生存期明显延长(P0.01);PDK1敲除对白血病细胞的周期无影响;敲除组小鼠骨髓白血病细胞的凋亡率显著高于对照组(P0.001);PDK1的敲除引起肿瘤相关基因和转录因子c-Myc和NF-κB表达水平降低(P0.01)以及P53表达水平升高(P0.01)。结论:PDK1的敲除可抑制T-ALL的发展,推测其机制可能是通过调控白血病细胞的凋亡和多种转录因子的表达来影响白血病的进程。     

人PNPLA3基因启动子转录调控的初步分析

目的构建人PNPLA3基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因裁体,在LO2细胞中比较不同长度启动子片段的活性,为研究PNPLA3基因的转录调控机制提供初步依据。方法对PNPLA3基因5’侧翼区约1 400个碱基进行生物信息学分析,预测其转录调控区域;利用PCR及酶切方法,以人外周血中全基因组DNA为模版扩增不同长度的PNPLA3基因上游启动子区序列,分别构建荧光素酶基因报告载体。瞬时转染LO2细胞,利用双荧光素酶报告基因分析系统检测各启动子的转录活性。利用在线分析软件预测PNPLA3基因主要转录调控区的潜在转录因子结合位点。结果成功构建5段不同长度的PNPLA3基因上游启动子区的报告载体;在LO2细胞内启动子活性随片段长度变化,表现为当PNPLA3启动子片段从-1015截短到-647,从-647截短至-553,从-553截短至-333时活性变化不大,而从-333截短至-8时活性显著下降(P<0.05);Match分析显示-333～-8片段具有多个转录因子结合位点。结论初步判断-333～-8区是PNPLA3基因的主要转录调控区。     

急性髓性白血病中hMLH1基因启动子区甲基化与表达水平检测及意义

目的检测急性髓性白血病（acute myeloid leukaemia,AML）细胞hMLH1基因启动子甲基化状态及转录水平,探讨其与AML发生发展的关系。方法运用甲基特异性PCR和Real-Time PCR法检测62例AML患者外周血有核细胞中hM-LH1基因启动子甲基化状态及其转录水平,分析白血病细胞hMLH1基因启动子区甲基化与临床资料的关系。结果 62例急性髓性白血病hMLH1基因启动子甲基化频率为14.52%（9/62）,甲基化白血病细胞与非甲基化白血病细胞hMLH1 mRNA的相对含量分别是0.51±0.19和0.87±0.24,两者的hMLH1转录水平有明显差异（P〈0.05）;AML细胞中hMLH1基因启动子甲基化与患者性别及FAB分型无明显相关性,与发病年龄及难治/复发显著相关。结论在AML中hMLH1基因转录水平受基因启动子甲基化调控,且hMLH1基因甲基化差异与白血病发生及进展恶化显著相关。     

三氧化二砷影响EVI1基因调控造血转录因子的体外研究

目的:观察三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)在体外影响反转录病毒整合位点1基因(ecotropic viral integration site-1,EVI1)基因对造血转录因子的调控作用。方法:实验选取EVI1高表达的急性髓系白血病细胞株THP-1,利用健康成人外周血单个核细胞作为对照,通过反转录实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RFQ-PCR),检测EVI1基因及造血转录因子GATA1、GATA2、RUNX1、MPO、LMO2、CMYB、PU.1和SCL的m RNA相对表达量。分别以1μmol/L、3μmol/L、5μmol/L的ATO溶液处理THP-1细胞株后,再通过反转录RFQ-PCR检测EVI1基因及造血转录因子的m RNA相对表达量。结果:通过反转录RFQ-PCR检测证实,存在EVI1基因的THP-1细胞中GATA2和CMYB基因的表达上调,而GATA1、RUNX1、MPO、LMO2、PU.1及SCL基因的表达水平下调。ATO对EVI1基因的下调作用具有浓度与时间依赖性,并对其他造血转录因子进行调控。结论:通过体外研究发现,高表达EVI1基因的THP-1细胞有GATA2基因的表达上调,同时存在其他造血转录因子的表达异常,与促进原始细胞增殖及髓系、红系的分化成熟受抑密切相关。ATO可特异性地下调EVI1基因的表达,并抑制GATA2转录因子的激活。     

急性单核白血病细胞系THP-1细胞MLL-AF9融合基因沉默对p27表达的影响

目的 研究急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞MLL-AF9融合基因沉默对p27表达及转录调控的影响.方法 选择THP-1细胞特有的MLL-AF9融合基因为靶基因,设计并俣成MLL-AF9小干扰RNA(siRNA)片段.应用脂质体转染.方法 将MLL-AF9 siRNA导入细胞,通过流式细胞术检测siRNA转染效率,用RT-PCR法比较转染前后MLL-AF9 mRNA表达水平的变化,Western blot检测MLL-AF9蛋白水平沉默效果,比较细胞周期抑制蛋白p27表达变化,利用染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技术研究MLL-AF9融合蛋白是否与p27启动子结合.结果 转染MLL-AF9siRNA后THP-1细胞MLL-AF9 mRNA相对表达水平(0.31±0.07)较对照组(1.25±0.13)明显受抑(P＜0.01),p27 mRNA表达水平(0.84±0.12)较对照组(0.35±0.03)明显上调(P＜0.01),应用ChIP结合PCR扩增的.方法 分析发现MLL-AF9融合蛋白可与THP-1细胞p27基因启动子区域的DNA片段结合.结论 MLL-AF9融合基因沉默后可使p27表达上调,其机制可能为MLL-AF9基因沉默解除了MLL-AF9融合蛋白与p27启动子的结合,从而恢复p27基因的表达.     

DNA甲基化调控K562细胞系kir3dl1基因表达

为分析kir3dl1基因启动子区的甲基化模式及其与基因表达的关系，探讨kir3dl1基因的表达调控机制，采用亚硫酸氢盐测序法检测K562细胞中kir3dl1基因启动子区的甲基化状况，应用甲基化抑制剂5．氮胞苷处理K562细胞以诱导CpG岛去甲基化，观察启动子区CpG岛甲基化与kir3dl1基因表达的关系。结果显示：K562细胞中kir3dl1基因核心启动子区CpG二核苷酸甲基化频率在20％-100％之间；K562细胞中kir3dl1基因启动子序列在转录因子E2F可能的结合位点上存在1个碱基的突变，并形成1个新的被甲基化的CpG二核苷酸；应用甲基化抑制剂5．氮胞苷可以诱导不表达kir3dl1基因的K562细胞重新表达该基因。结论：K562细胞中kir3dl1基因表达受启动子甲基化调控，对转录因子E2F的深入研究有助于了解其在kir3dl1基因表达调控中可能的作用。     

MRTF-A在体内和体外调控乳腺癌发展过程中COL1A1基因的表达

目的探讨心肌素相关转录因子-A (MRTF-A)对乳腺癌中I型胶原蛋白基因(COL1A1)基因表达的调控机制。方法选取18例经彩色多普勒超声确定为乳腺肿块的患者,后经病理检查,8例为良性,10例为恶性。实时定量PCR检测乳腺肿块及人乳腺癌细胞中MRTF-A和COL1A1的表达。MRTF-A干扰RNA转染乳腺癌细胞后,检测COL1A1的表达,荧光素酶报告检测MRTF-A与COL1A1启动子的结合。染色质免疫共沉淀(Ch IP)检测MRTF-A对COL1A1转录的影响。Wnt 3a和-catenin干扰RNA转染乳腺癌细胞后,检测MRTF-A和COL1A1的表达。结果MRTF-A和COL1A1在恶性肿块的表达显著高于其在良性肿块的表达。MRTF-A沉默可以抑制COL1A1 mRNA的表达,且降低COL1A1启动子荧光素酶活性。MRTF-A可与COL1A1启动子上CAr G DNA片段有效结合,MRTF-A沉默可降低乙酰化组蛋白H3K9和RNA聚合酶Ⅱ在COL1A1启动子处富集。Wnt 3a及-catenin在恶性肿块中的表达显著高于其在良性肿块中的表达,且无论是Wnt 3a沉默还是-catenin沉默均可显著抑制MRTF-A和COL1A1的表达。结论MRTF-A通过激活COL1A1的转录促进乳腺癌转移,Wnt/-catenin信号可调控此过程。