人脂肪组织来源CD34＋／CD31-细胞向内皮细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨将人脂肪组织来源CD34 /CD31-细胞诱导为内皮细胞的可行性.方法 脂肪组织来自5例接受脂肪抽吸术的患者,酶消化法获取原代细胞,细胞扩增培养至第二代,应用免疫磁珠仪分选CD34 /CD31-细胞.将此群细胞用VEGF及bFGF进行诱导.流式细胞仪检测分选前后细胞纯度;免疫细胞荧光检测细胞vWF和CD31的表达;荧光显微镜观察细胞摄取低密度脂蛋白的功能;三维培养观察细胞形成血管样结构的能力.结果分选前后CD34 /CD31-细胞比例分别为(12.57±1.83)%和(96.05±6.73)%;细胞诱导10d后呈现内皮细胞典型的"铺路石"样形态,vWF、CD31表达阳性,细胞具有摄取低密度脂蛋白的功能,三维培养条件下形成"树枝样"分叉结构.结论人脂肪组织来源的CD34 /CD31-细胞能够诱导分化为成熟内皮细胞.     

H-2Kb-tsA58转基因小鼠肾小球内皮和足细胞株的分离培养与鉴定

目的：利用H-2K^b-tsA58转基因小鼠的条件永生性，从肾脏中分离、纯化和培养肾小球内皮细胞株和足细胞株。方法：筛网法分离肾小球，利用内皮细胞表面特异性抗原CD31的表达，采用免疫磁殊初步分离肾小球内皮细胞，结合限制性稀释法获取均一细胞来源的细胞克隆后持续传代培养。间接免疫荧光法鉴定分离纯化后的细胞特性。结果：分离纯化后的细胞克隆在33℃和γ-干扰素诱导下具有无限增殖能力，37℃无γ干扰素条件下细胞趋于分化成熟。所获得的内皮细胞株特异性表达CD31，并形成管腔样结构；所获得的足细胞分化成熟，形成大量足突结构并特异性表达成熟足细胞的标志性抗原nephrin和synaptopodin。结论：本研究成功地建立了获取具有成熟足细胞特征的条件永生性小鼠足细胞株和肾小球内皮细胞株的技术方法，为体外研究这两种细胞的功能及其在疾病中的作用提供了备件。     

小干扰RNA抑制成熟树突细胞表面抗原CD80/CD86的表达

背景：成熟树突细胞可通过其表面抗原CD80/CD86来启动Th细胞活化,促使Th细胞向Th1细胞分化减少、向Th2细胞方向分化增多。〈br〉 目的：探讨小干扰RNA抑制哮喘小鼠成熟树突细胞表面抗原CD80/CD86表达后对Th1及Th2型细胞因子干扰素γ、白细胞介素4分泌的影响。方法：建立哮喘小鼠模型,分离哮喘小鼠骨髓成熟树突细胞,流式细胞术检测表面标记物 CD11c、CD80、CD86的阳性表达率;设计合成CD80/CD86相关小干扰RNA转染哮喘小鼠成熟树突细胞,荧光定量PCR、流式细胞术检测干扰前后成熟树突细胞中CD80/CD86 mRNA和相应蛋白的表达,将干扰组、未干扰组、转染试剂对照组的成熟树突细胞分别与小鼠T淋巴细胞共培养,ELISA检测上清液中Th1及Th2型细胞因子干扰素γ、白细胞介素4分泌水平。结果与结论：①正常组成熟树突细胞的CD80/CD86的表达与哮喘组相比均明显降低（均P＜0.05）。②小干扰RNA转染哮喘小鼠成熟树突细胞后,干扰组CD80/CD86 mRNA及其蛋白表达水平较其他组均明显降低（均P＜0.05）。③小干扰RNA转染后干扰组共培养体系中干扰素γ水平明显高于其他组（均P＜0.05）,白细胞介素4水平则明显低于其他组（均P ＜0.05）。提示哮喘小鼠成熟树突细胞高表达CD80/CD86,小干扰RNA特异性抑制哮喘小鼠成熟树突细胞中CD80/CD86的表达,能增加干扰素γ并减少白细胞介素4的分泌,从而纠正Th1/Th2失衡。     

单方绿豆粉干预哮喘小鼠肺组织中白三烯C4和5-脂氧合酶及其激活蛋白的变化效应

目的探讨压热解毒单方绿豆粉对哮喘肺小鼠组织中白三烯及5-脂氧合酶、5-脂氧合酶激活蛋白含量的影响. 方法实验于2002-10/2003-04在广东医学院呼吸疾病研究所完成.32只清洁级雄性昆明种纯白小鼠,随机分为4组生理盐水对照组、卵蛋白哮喘模型组、地塞米松治疗组、绿豆粉治疗组,每组8只.参照文献[1]建立小鼠卵蛋白哮喘模型.除对照组小鼠予生理盐水处理外,其余各组小鼠于第1,7,14天给予鸡卵白蛋白抗原液0.5 mL(含氢氧化铝凝胶2 mg和鸡卵白蛋白15μg)腹腔注射,第21天始用1%鸡卵白蛋白雾化吸入来激发小鼠哮喘发作,2次/d,每次1 h,连续3 d.每次雾化前30 min,生理盐水对照组和卵蛋白哮喘模型组给予生理盐水10 mL/kg,地塞米松治疗组给予地塞米松2 mg/kg,绿豆粉治疗组给予绿豆粉液10 mL/kg,灌胃.肺组织匀浆中白三烯B4、白三烯C4含量检测应用ELISA方法;各组肺组织中5-脂氧合酶、5-脂氧合酶激活蛋白的表达应用免疫组化方法检测. 结果实验所用32只小鼠均进入结果分析.①小鼠肺组织中白三烯B4比较生理盐水对照组明显低于卵蛋白哮喘模型组[(0.151±0.055,0.293±0.058)mg/L,(P＜0.01)].②小鼠肺组织中白三烯C4比较绿豆粉治疗组明显低于哮喘模型组[(2.091±0.273,2.482±0.278)mg/L,(P＜0.01)].③小鼠肺组织中5-脂氧合酶的活性比较免疫组化法检测结果显示绿豆粉组明显低于哮喘模型组[(12.3±4.9,25.0±6.6),(P＜0.01)].④小鼠肺组织中5-脂氧合酶、5-脂氧合酶激活蛋白的表达绿豆粉治疗组、地塞米松治疗组与生理盐水对照组比较无显著性变化(P＞0.05). 结论白三烯B4、白三烯C4在肺组织中的高水平,5-脂氧合酶、5-脂氧合酶激活蛋白表达的增加在鸡卵白蛋白致敏小鼠的哮喘发病中起重要作用.单方绿豆可显著降低哮喘小鼠肺组织中白三烯C4含量,抑制哮喘小鼠肺组织中5-脂氧合酶、5-脂氧合酶激活蛋白的表达,从而表现出抗哮喘的活性.     

5-脂氧合酶在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中的表达

目的　探讨 5 脂氧合酶 (5 LO)在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中的表达。方法　分离大鼠腹腔巨噬细胞培养一定时间 ,用高效液相色谱、Westernblot和RT PCR分别观察 5 LO催化的代谢产物的生物合成、5 LO和 5 脂氧合酶激活蛋白 (FLAP)表达的变化 ,并用毛细管电泳定量分析RT PCR产物。结果　体外培养 2 4h对 5 LO以及FLAP的表达没有明显影响 ,5 LO酶活性没有明显的变化 ;培养到第 72小时 ,5 LOmRNA和蛋白表达没有明显的影响 ,但FLAP几乎检测不到 ,mRNA的量明显降低 ,检测不到白三烯B4(LTB4)和 5 羟二十碳四烯酸 (5 HETE)。进一步培养到第 12 0小时 ,5 LO的mRNA和蛋白表达明显下降 ,FLAP的mRNA和蛋白检测不到。毛细管电泳定量分析结果显示 ,培养 1、2 4和 72h ,5 LO的相对表达量没有明显变化 ,培养到 12 0h则下降了约 80 %。结论　 5 LO可以在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中稳定表达 72h。     

微波辐照对血管内皮细胞CD31表达、分布及其磷酸化的影响

目的研究微波辐照对血管内皮细胞血小板-内皮细胞粘附分子- 1( platelet- endothelial cell adhesion molecule,PECAM- 1/CD31)表达、分布、磷酸化的影响,探讨微波辐照引起单核细胞浸润的分子机制. 方法培养的大鼠肺血管内皮细胞接受 30 W/cm2微波辐照,在辐照后不同时间,分别检测 CD31 mRNA和蛋白表达及磷酸化,观察 CD31和细胞骨架蛋白 F- actin 分布,检测单核样 HL- 60细胞在单层内皮细胞上迁移及 CD31单抗的干预. 结果微波暴露 4 h后 CD31 m RNA表达上调, 8 h后 CD31蛋白表达开始上调,此时单核样 HL- 60细胞在受照内皮细胞上的迁移数显著增多,而加入 CD31单抗可明显干预 HL- 60细胞迁移. CD31磷酸化在暴露后 2 h达到峰值.微波暴露还引起 CD31在细胞连接间隙处分布减少和 F- actin分布紊乱. 结论一定剂量微波暴露引起诱导的单核样 HL- 60细胞在内皮细胞上迁移增多,与辐照诱导内皮细胞 CD31表达上调、 CD31分布改变和磷酸化增强有关,拮抗 CD31表达有减少细胞浸润作用,是防治微波暴露后细胞浸润的策略之一.     

转录因子t-bet在人CD8+ T细胞和γδ T细胞干扰素-γ产生中的作用

目的:探讨转录因子t-bet对人CD8 T细胞和γδT细胞干扰素-γ(IFN-γ)产生的调控作用。方法:化学合成针对人t-bet基因的小干扰RNA(siRNA),转染体外培养的人γδT细胞和αβT细胞,利用流式细胞仪分选纯化CD8 T细胞和δγT细胞,半定量RT-PCR检测CD8 T细胞和γδT细胞中t-bet mRNA的表达变化,流式细胞术检测转染前后IFN-γ产生的变化情况。结果:转染siRNA后的人CD8 T细胞和γδT细胞t-bet mRNA表达强度分别为(24.75±1.18)%和(25.28±1.04)%,较转染前明显减小(P<0.05);在t-bet表达受到抑制的同时,γδT细胞中IFN-γ 细胞为(56.57±6.67)%,与错义序列组比较差异有显著性(P<0.05)。结论:siRNA可有效降低人CD8 T细胞和γδT细胞t-bet的基因表达,转录因子t-bet在γδT细胞IFN-γ产生中所起的作用与CD8 T细胞不完全相同。     

单方绿豆粉干预哮喘小鼠肺组织中自三烯C4和5-脂氧合酶及其激活蛋白的变化效应

目的：探讨压热解毒单方绿豆粉对哮喘肺小鼠组织中白三烯及5-脂氧合酶、5-脂氧合酶激活蛋白含量的影响。方法：实验于2002—10／2003—04在广东医学院呼吸疾病研究所完成。32只清洁级雄性昆明种纯白小鼠，随机分为4组：生理盐水对照组、卵蛋白哮喘模型组、地塞米松治疗组、绿豆粉治疗组，每组8只。参照文献[1]建立小鼠卵蛋白哮喘模型。除对照组小鼠予生理盐水处理外，其余各组小鼠于第1，7，14天给予鸡卵白蛋白抗原液0．5mL（含氢氧化铝凝胶2mg和鸡卵白蛋白15μg）腹腔注射，第21天始用1％鸡卵白蛋白雾化吸人来激发小鼠哮喘发作，2次／d，每次1h，连续3d。每次雾化前30min．生理盐水对照组和卵蛋白哮喘模型组给予生理盐水10mL／kg，地塞米松治疗组给予地塞米松2mg／kg，绿豆粉治疗组给予绿豆粉液10mL/kg，灌胃。肺组织匀浆中白三烯B4、白三烯C4含量检测应用ELISA方法；各组肺组织中5-脂氧合酶、5-脂氧合酶激活蛋白的表达应用免疫组化方法检测。结果：实验所用32只小鼠均进人结果分析。①小鼠肺组织中白三烯B。比较：生理盐水对照组明显低于卵蛋白哮喘模型组[（0．151&;#177;0．055，0．293&;#177;0．058）mg／L，（P〈0．01）]。②小鼠肺组织中白三烯C4比较：绿豆粉治疗组明显低于哮喘模型组[（2．091&;#177;0．273，2．482&;#177;0．278）mg／L，（P〈0．01）]。③小鼠肺组织中5-脂氧合酶的活性比较：免疫组化法检测结果显示绿豆粉组明显低于哮喘模型组[（12．3&;#177;4．9,25．0&;#177;6．6），（P〈0．01）]。④小鼠肺组织中5-脂氧合酶、5-脂氧合酶激活蛋白的表达：绿豆粉治疗组、地塞米松治疗组与生理盐水对照组比较无显著性变化（P〉0.05）。结论：白三烯B4、白三烯C4在肺组织中的高水平，5-脂氧合酶、5-脂氧合酶激活蛋白表达的增加在鸡卵白蛋白致敏小鼠的哮喘发病中起重要作用。单方绿豆可显著降低哮喘小鼠肺组织中自三烯C4含量，抑制哮喘小鼠肺组织中5-脂氧合酶、5-脂氧合酶激活蛋白的表达，从而表现出抗哮喘的活性。     

血管内皮细胞生长因子受体KDR基因靶向RNA干扰质粒的构建

目的:应用RNA干扰技术设计构建针对血管内皮细胞生长因子受体KDR的小干扰RNA,并观察脂质体转染肺癌细胞A549后的干扰效果。方法:实验于2005-03/2006-01在沈阳医学院生物化学及分子生物学教研室完成。①设计针对KDR编码区有短发夹结构的3条mRNA序列,经退火成互补双链,克隆到pGCsi.H1/neo/GFP载体中构建3个重组质粒,分别命名为KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3。②设立5组:小干扰RNA组,分别转染KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3;阳性对照组,转染pGCsi.H1/neo/siGFP,该质粒载体中的插入序列为针对绿色荧光蛋白的小干扰RNA,不干扰待研究的内源性基因;阴性对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP/NON,该载体为不干扰任何内源性基因的小干扰RNA;空白对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP空载体;正常对照组,不进行任何转染。③对重组质粒进行酶切鉴定、DNA测序分析;脂质体法转染质粒至肺癌A549细胞株后,实时定量PCR检测KDRmRNA的水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线。结果:①小干扰RNA表达载体的鉴定:KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3表达载体用限制性内切酶NdeⅠ和SmaⅠ进行单酶切后,均产生约713bp、5480bp和2403bp、3790bp两个片段,与预期结果相同。测序结果与设计的编码相应短发夹状KDR-小干扰RNA的寡核苷酸序列一致,证明KDR-小干扰RNA真核表达载体构建成功。②KDR-小干扰RNA对A549细胞中KDRmRNA水平的影响:与阳性对照组、阴性对照组、空白对照组和正常对照组的A549细胞相比,KDR-siRNA1,2,3表达载体转染后的A549细胞KDR基因表达水平均明显受到抑制,抑制率分别为64%、81%和72%,其中以KDR-siRNA2抑制作用最为明显。③KDR-小干扰RNA对A549细胞生长的影响:阳性对照组、阴性对照组、空白对照组、正常对照组的A549细胞生长趋势较为一致,且生长速度均明显高于转染3种KDR-小干扰RNA表达载体的A549细胞,从接种第2天开始差异有显著性意义(t=15.29～17.65,P均<0.01)。结论:血管内皮细胞生长因子受体KDR靶向RNA干扰重组质粒构建成功,该载体能有效抑制肺癌A549细胞KDR基因表达与细胞增殖。     

雷公藤内酯醇抑制小鼠肾小球系膜细胞表达CXCL10的实验研究

目的探讨雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)对γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)诱导的小鼠肾小球系膜细胞(SV40MES13)表达趋化因子CXCL10 m RNA的影响及其可能机制。方法将对数生长期SV40MES13随机分为空白组、刺激组、干预组,用不同浓度的IFN-γ(0U/ml~2000U/ml)刺激细胞不同时间(0h~48h)后,观察细胞表达CXCL10 m RNA的变化;用CCK-8法检测不同浓度(2ng/ml~20ng/ml)TPL对SV40MES13生存率的影响,选用细胞生存率大于90%的TPL用于后续实验,观察TPL对SV40MES13表达CXCL10 m RNA的影响;选用JAK/STAT信号通路特异性抑制剂AG490干预细胞,探讨IFN-γ是否通过JAK/STAT信号通路诱导CXCL10表达;收集以上细胞,用Real-Time PCR技术检测各组CXCL10 m RNA表达水平。结果 IFN-γ能诱导SV40MES13表达CXCL10 m RNA,并呈时间、剂量依赖性;AG490具有抑制IFN-γ诱导的SV40MES13表达CXCL10 m RNA;TPL具有抑制IFN-γ诱导的SV40MES13表达CXCL10 m RNA的作用。结论 IFN-γ可能通过激活JAK/STAT信号通路,诱导SV40MES13表达CXCL10 m RNA;TPL具有抑制IFN-γ诱导的SV40MES13表达CXCL10的作用。