限制性酶切扫描技术测定DNA甲基化组的方法建立

目的优化试验条件，建立用于DNA甲基化组测定的限制性酶切扫描技术（RLGS）。方法选取冰冻胃癌组织及其周围非癌组织各2份，提取基因组大分子DNA（〉50000bp），用甲基化敏感的限制性内切酶Not Ⅰ等对DNA进行多重酶切、同位素”P标记、二维电泳、扫描分析，并且根据已有的位点DNA序列数据库，确定所得扫描图谱上位点所对应的序列信息。结果成功得到RLGS扫描图；有效点平均在1200个左右，标本质量较好的图谱平均可获得有效点1800个左右，与国外实验室的平均水平相当，经过比对可找出放射自显影信号强度减弱或增强的点，结果可重复，并能在Not Ⅰ-EcoR V克隆文库中找到这些点所对应的序列信息。结论成功建立了RLGS技术平台，并能够稳定工作。     

16S rRNA基因序列在分枝杆菌分类鉴定的研究进展

16S rRNA基因序列高度保守,其核苷酸位点的变化具有种的特异性,用分子生物学技术分析16S rRNA基因,能够将分枝杆菌鉴定到种的水平.本文就用16S rRNA基因进行PCR扩增、DNA直接测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析、DNA探针杂交来鉴定分枝杆菌进行综述.     

人类血小板抗原基因分型

本文介绍了5个对人类影响最大且已被国际上公认的血小板抗原系统的分子生物学研究结果及其分型方法,包括最早采用的血清学方法、近几年发展起来的分子生物学方法:DNA序列分析、等位基因特异性寡核苷酸点杂交(PCR-ASO)、聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)及聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)。其中重点介绍了PCR-SSP方法的可靠性及实用性。     

贵州省2000年甲型副伤寒沙门菌分离株16SrRNA基因型分析

近年来贵州省出现甲型副伤寒的流行。为探讨贵州省不同地区甲型副伤寒流行菌株的分子流行病学特征以及菌株间的相关关系 ,对贵州省 6个地 (市 ) 2 0 0 0年部分甲型副伤寒沙门菌分离株进行染色体DNA基因限制性酶切 16srRNA探针杂交图谱分析。PstⅠ酶切后进行的杂交显示 6 4株均为一个基因型 ,然后进一步采用BglⅠ、SalⅠ两个内切酶对其中部分菌株进行酶切杂交分析 ,核糖体杂交谱上仍没有差异 ,分析认为同一个克隆群的菌株广泛传播是造成贵州省甲型副伤寒流行的主要原因.     

分子生物学技术在临床微生物实验室的应用

分子生物学家为研究DNA结构和基因功能而建立的DNA分析技术,正被临床微生物实验室所应用。一、质粒分析(Plasmidanalysis)已成为鉴定细菌株别的简便而快速的方法,能帮助区分临床和流行病学标本的有关菌株。二、对细菌和病毒指纹(fin-ger printing)的限制性分析法,(restriction-analysis):限制性酶(restriction ewzy-mes)在特定部位切断DNA,使DNA成为顺序上有差别的不同片段,用于鉴别。三、     

用Digoxigenin-HBV DNA探针检测血清HBV DNA影响因素探讨

本文对利用Dig-HBV DNA(异羟基洋地黄毒甙配基标记HBV DNA)探针杂交检测血清HBV DNA 的方法进行了探讨,结果发现在血清抽滤点膜前,先用抗HBs浓集Dane 氏颗粒,再行点膜,结果最佳.利用脱脂奶粉液可替代传统的预杂交液.杂交液中Dig-HBV DNA 探针浓度在50～100 ng/ml 已经足够.将点有DNA 的膜置80℃作用30 min可使DNA 牢固地固定在膜上.同时还发现可用带有HBV DNA 的P~(Am-12)质粒作探针检测血清HBV DNA,从而建立了一种较为简便、可靠的非同位素探针杂交方法.     

人宫颈癌DNA与HPV16型核酸分子杂交的研究

本文以人乳头状瘤病毒(HPV)16型-PBR_(322)重组质粒,对大肠杆菌HB101进行转化实验。经筛选、扩增、酶切、电泳鉴定。获得满意的电泳图谱及kb值,HPV-16Bam HI DNA为7.2kb,其260/280O.D比值为1.9-2。纯度合乎要求,可用以制备探针。以HPV-16DNA7.2kb片段为探针,应用~(32)P(α)-dATP标记进行了点杂交及Southern印迹杂交实验。结果表明38例宫颈癌组织DNA,其点杂交阳性率为76.3％,Southern杂交阳性率为65.7％。点杂交与Southern杂交结果基本符合。上述结果说明了在人宫颈癌组织中,存在着HPV-16相关的基因组,Southern杂交表明其以整合形式存在。说明宫颈癌的发病可能与HPV-16型的感染有密切关系。从分子水平进一步探讨了宫颈癌的病毒病因。     

AFLP技术在细菌学分型和流行病学调查中的应用

基于DNA水平的生物遗传多态性分析大大丰富了生物多样性的发现和分析。近年来,对于基因多态性的研究及基因标记技术迅速发展。目前用于多态性分析的方法主要有限制性片段长度多态性(RFLP)、随机引物PCR(RAPD)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、细菌的核糖体基因分型(Ribotyping)、多位点序列分析(MLST)以及扩增片段长度多态性(AFLP)等[1]。这些方法所得到的多态性,都是运用染色体DNA通过限制性内切酶消化或/和PCR扩增的方法,根据带型中一些特征条带的存在或缺失来比较。带型的差异是实验菌株之间遗传距离的直接反映,因而认为这些带型是…     

Bcr／abl特异性RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建特异性的抗慢性髓细胞白血病融合基因bcr／abl mRNA的siRNA真核细胞表达载体，探索RNA干扰(RNAi)分子靶向治疗慢性髓细胞性白血病(CML)的作用。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列，按照Tusehl设计原则，选择设计双链小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，再转化为能表达其小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs，shRNA)的DNA序列，并与pTER质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER／shRNA1、pTER／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果：构建慢性粒细胞白细胞bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER／shRNA1、pTER／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论：抗慢性粒细胞白细胞bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体的构建成功。     

Silica-KI快速提取外周血基因组DNA的实验研究

目的　建立一种快速的外周血基因组DNA提取方法。方法　用硅胶 碘化钾 (Silica KI)吸附法直接从外周血提取基因组DNA。结果　提取的基因组DNA相对分子质量大 ,纯度较高 ,A2 60 / 2 80nm为 1.75～ 1.93。每毫升外周血可获得 2 5～ 35 μgDNA ,体外扩增和限制性内切酶酶切结果满意。 结论　Silica KI吸附法是一种简单、高效、快速、安全、适用于大量临床标本处理DNA的提取方法。     

Sau-PCR法分析由洋葱伯克霍尔德菌引起的院内感染

目的 通过使用Sau-PCR方法分析一起由洋葱伯克霍尔德菌引起的院内感染,为追溯感染源和感染途径提供有效的信息.方法 Sau-PCR首先使用限制性内切酶Sau3AI对基因组DNA进行酶切,获得以GATC序列为黏性末端的酶切产物,然后使用能够识别酶切位点(GATC)的引物对酶切产物进行PCR扩增,最后根据DNA琼脂糖凝胶电泳图谱分析样本之间同源性.结果 11株来自患者的菌株中,除1株以外,其余均表现出100%同源性,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对样本进行验证,结果与Sau-PCR完全一致.结论 Sau-PCR是一种实用、简便、迅速的DNA指纹图谱分析工具,在对同源性的研究当中具有广阔应用前景.     

用PCR-RFLP检测血红蛋白E基因CD26突变

目的建立PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)法检测血红蛋白E(HbE)基因CD26突变。方法对HbE复合β地中海贫血(β地贫)家系的患者基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶MnlⅠ消化,通过分析酶切产物PAGE图谱确定是否携带CD26突变。结果筛选出2个家系中4例CD26突变携带者。结论CD26突变在四川人群中有一定的频率,PCR-RFLP方法能快速、准确、特异地检测CD26突变。     

Silica-KI快速提取外周血基因组DNA的实验研究

目的 建立一种快速的外周血基因组DNA提取方法。方法 用硅胶-碘化钾(Silica—KI)吸附法直接从外周血提取基因组DNA。结果 提取的基因组DNA相对分子质量大，纯度较高，A260／280nm为1．75～1．93。每毫升外周血可获得25～35μg DNA，体外扩增和限制性内切酶酶切结果满意。结论 Silica—KI吸附法是一种简单、高效、快速、安全、适用于大量临床标本处理DNA的提取方法。     

16S rRNA基因序列在分析杆菌分类鉴定的研究进展

16S rRNA基因序列高度保守,其核苷酸位点的变化具有种的特异性,用分子生物学技术分析16S rRNA基因,能够将分枝杆菌鉴定到种的水平。本文就用16S rRNA基因进行PCR扩增、DNA直接测序、限制性酶切片段长度多态性（RFLP）分析、DNA探针杂交来鉴定分枝杆菌进行综述。     

什么是人乳头瘤病毒?

答 :人乳头瘤病毒 (humanpapillomaviruses,HPV)是感染人的乳头瘤病毒 ,属于乳多空泡病毒科。HPV是无包膜的二十面体立体对称的核衣壳结构 ,表面有 72个壳微粒 ,直径为4 5～ 5 5nm ,基因组是双股环状DNA ,分子大小约 80 0 0bp。195 7年从跖疣中提取到病毒DNA ,确定了人乳头瘤病毒的第一个限制性内切酶物理图谱 ,定为人乳头瘤病毒 1型。以后新发现的人乳头瘤病毒 ,核酸杂交与原来型别显示同源性小于 5 0 %的定为新型别 ,同源性大于 5 0 % ,但限制性内切酶片段不同的称为亚型。迄今已发现 70多个型。什么是人乳头瘤病毒?@刘志远 @许…     

巯嘌呤甲基转移酶基因多态性分析方法探讨

建立以PCR为基础的位点特异性PCR、限制性内切酶消化、变性高效液相色谱分析和SNaPshot定点的序列分析等方法。并结合DNA直接测序检测巯嘌呤甲基转移酶(TPMT)基因的5个单核苷酸多态性(SNP)位点的多态性频率。在实验过程中还探讨基因多态性检测的方法学，比较几种方法的可信度、可行性及其优劣。研究结果显示。限制性内切酶消化法能准确地检测TPMT基因外显子区的SNP，变性高效液相色谱分析技术能快速筛选出TPMT第5和第10外显子区的SNP，但不能检测出第7外显子的SNP；位点特异性PCR不能检测出TPMT基因外显子区的SNP，SNaPshot定点的序列分析检测TPMT基因外显子和启动子区的SNP准确率高。通过比较几种SNP检测方法后获得的结论是。TPMT基因SNP位点的检测应根据标本量和实验条件首选限制性酶切消化法、DNA测序或SNaPshot定点序列分析，有时一种技术不能完全满足检测的需要，必须几种方法的相互补充。     

多重PCR诊断线粒体突变聋病的临床应用价值

目的采用多重PCR和多重限制性内切酶法同时检测线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）1555^G、3243^G,7445^G三个突变位点，探讨多重PCR法在线粒体突变聋病中的诊断价值。方法收集311例耳聋患者外周血标本，提取DNA模板，以三对引物在同一PCR反应体系中进行多重PCR扩增；产物在同一体系中用三种相应的限制性内切酶分析，同时对扩增产物进行mtDNA基因序列测定。结果采用本法检测出mtDNA1555^G。点突变20例，7444^A点突变1例，结果与测序相符。结论多重PCR和酶切法可同时检测多个mtDNA突变位点，利用这一方法可快速简捷地诊断线粒体突变聋病，便于临床推广应用。     

双重实时荧光PCR与DNA测序分析及PCR—RFLP方法检测白细胞介素-6基因启动子区多态性方法的比较研究

目的比较双重实时荧光PCR与DNA测序分析以及PCR-RFLP三种检测方法对同一样本检测结果的一致性。方法分别采用三种方法对77例样本IL-6基因启动子区-572G／C，-597G／A2个位点多态性进行检测。结果在77例样本中，采用双重实时荧光PCR方法与DNA测序分析相比仅有3例结果不一致。用限制性内切酶BSrBI酶切，有20例与实时荧光PCR方法结果不一致。当PCR产物用限制性内切酶FokI酶切时，仅有5例被发现是GA型，另外两例未被检测出。结论双重实时荧光PCR方法与其它方法比较具有简单、准确、快速的特点，便于临床实验室大规模样本筛壹。     

双重实时荧光PCR与DNA测序分析及PCR-RFLP方法检测白细胞介素-6基因启动子区多态性方法的比较研究

目的比较双重实时荧光PCR与DNA测序分析以及PCR-RFLP三种检测方法对同一样本检测结果的一致性。方法分别采用三种方法对77例样本IL-6基因启动子区-572G／C，-597G／A2个位点多态性进行检测。结果在77例样本中，采用双重实时荧光PCR方法与DNA测序分析相比仅有3例结果不一致。用限制性内切酶BSrBI酶切，有20例与实时荧光PCR方法结果不一致。当PCR产物用限制性内切酶FokI酶切时，仅有5例被发现是GA型，另外两例未被检测出。结论双重实时荧光PCR方法与其它方法比较具有简单、准确、快速的特点，便于临床实验室大规模样本筛壹。     

DNA探针在临床诊断学中的应用

分子生物学新技术的迅速发展,给医学临床诊断学以巨大冲击。重组DNA 技术、核酸杂交、限制性酶切图谱和DNA 序列分析除作为当今研究基因结构、排列、调控和表达最有力的手段外,目前已广泛地应用到临床诊断学中,尤其是遗传性疾病的产前诊断和传染性疾病病原微生物的诊断,使人们能够