AS-PCR法检测CLU基因SNP位点方法的建立

目的基于等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)原理,建立一种QPCR检测CLU基因与阿尔兹海默病(AD)相关性SNP位点基因型的筛选方法。方法根据CLU基因上的rs11136000,rs2279590和rs9331888 3个SNP位点设计特异性的野生型、突变型引物,使用实时荧光定量PCR(QPCR)对AD患者外周血样本进行SNP基因分型,以DNA基因测序法结果作为参考标准。结果 10例样本的QPCR定量分型结果显示,CLU基因rs11136000位点检测到CC基因型7例,CT基因型3例,未发现TT基因型;CLU基因rs2279590位点检测到CC基因型7例,CT基因型3例,未发现TT基因型;CLU基因rs9331888位点检测到CC基因型3例,CT基因型4例,TT基因型3例。检测结果与基因测序法结论完全一致。结论基于AS-PCR技术的QPCR检测法可以高效、简洁的对CLU基因上的SNP位点进行基因分型,并为后续大量AD临床样本的SNP筛查提供了一种新的检验方法。     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因诊断方法的建立

目的建立有效可行的高通量葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)基因诊断新技术。方法建立单管三重PCR扩增G6PD基因外显子2~13目的片段,构建双管25重SNaPshot反应体系检测25个已报道的中国人群的G6PD基因突变位点。用20份已知基因型的样品进行重复性试验。对60例未知样品同时用多重SNaPshot基因分型技术和DNA测序法进行双盲试验。结果建立的多重SNaPshot技术可同时检测25个G6PD基因突变位点,且可区分正常、女性杂合子与男性半合子/女性纯合子,有效检出复合突变。批内及批间的重复性均达到100%。60例未知样本检出23例突变,SNaPshot基因分型结果与测序结果完全一致,特异性和准确性均为100%。结论建立的单管三重PCR结合双管25重SNaPshot技术是一种有效可行的G6PD缺乏症基因诊断的新方法。     

Sanger测序技术在检测肺癌吉西他滨化疗耐药敏感基因CDA中的应用

目的分析吉西他滨耐药敏感基因胞苷脱氨酶(CDA)多态性位点突变,以实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法为参照,探讨Sanger测序技术应用于临床样本检测的适用性。方法随机选取255例ⅢB和Ⅳ期晚期非小细胞肺癌(NSCLC)外周血样本,提取DNA,分别采用qPCR法和Sanger测序法检测CDA基因G208A和A79C突变情况,评价Sanger测序法检测的敏感度和特异度。结果 255例ⅢB和Ⅳ期晚期NSCLC外周血样本Sanger测序法和qPCR法检测CDA基因突变的成功率分别为98.04%(250/255)和97.25%(248/255)。以qPCR法为参照,Sanger测序法检测的敏感度和特异度分别为92.50%和99.52%,两种方法检测出的突变分型完全吻合。结论采用Sanger测序法可有效检测耐药基因CDA突变,实现了突变分型,可准确、高通量、高效检测CDA突变位点,为临床NSCLC对吉西他滨用药敏感提供一种有效检测手段。     

荧光聚合酶链反应检测血液标本快速方法的建立及其在ADRB1单核苷酸多态性分型中的应用

目的:建立一种荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测血液标本的快速方法 ,并将其应用到ADRB1(1165GC)基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分型检测中。方法:建立可直接利用血液样本进行荧光PCR扩增法,与传统血液样本的基因SNP检测方法不同,本所建立的方法无需进行血液基因组DNA的提取。选取1 051份临床乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝全血样本,利用本研究建立的采用血液标本直接扩增的荧光PCR方法,进行ADRB1的SNP分型,并将分型结果与Sanger测序法这一"金标准"进行对比,评估两者之间的符合率和一致性。结果:本研究建立的方法与传统DNA提取加荧光PCR方法相比,具有较好的扩增性能;与Sanger测序法相比,本研究建立的方法在ADRB1(1165GC)基因SNP分型检测中的总体符合率达到98.98%,Kappa一致性系数达到0.971,具有较高的准确率。结论:与传统方法相比,本研究建立的方法可省略基因组DNA提取步骤,其操作简便、成本较低,且准确率高,适合在基因分型相关临床检验工作中推广和使用。     

乙型肝炎病毒耐药突变的焦磷酸测序与Sanger双脱氧链终止法检测试剂的比对及临床应用

目的:将检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)耐药突变位点的焦磷酸测序检测试剂与Sanger双脱氧链终止法(Sanger测序法,简称Sanger法)检测试剂进行临床比对,为临床诊断和个体化治疗提供参考。方法:分别用研制的焦磷酸测序检测试剂与Sanger法检测试剂检测415份临床慢性乙型肝炎(乙肝)患者的血清样本及30例对照血清样本,并与Sanger法检测试剂比对,计算焦磷酸测序检测试剂的特异度、灵敏度及总符合率,计算Kappa值,比较2种试剂检测结果的一致性。结果:与经典的Sanger法检测试剂比对,焦磷酸测序检测试剂的特异度为100%,灵敏度为99.82%,一致率为99.86%,受试者工作特征曲线下面积为0.999 4,两者间具有较强的一致性。结论:焦磷酸测序检测试剂适合于临床对HBV样本进行耐药性诊断,其特异度、灵敏度与Sanger测序法一致性较强,且具有检测速度快、操作方便、测序成本低等优点,能更快地对临床乙肝患者提供用药指导建议,具有良好的临床应用前景。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测华法林代谢酶基因多态性

目的用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术建立检测人群中华法林代谢酶基因多态性的方法。方法选取2011年1月至2013年1月北京安贞医院心脏外科心脏机械瓣膜置换术后接受华法林抗凝治疗的患者10例,采集外周血,提取全血基因组DNA,用MALDI-TOF-MS技术检测10例患者华法林代谢酶基因CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)、CYP2C9*6(rs9332131)、VKORC1 CT(rs9923231)(-1639GA)、GGCX GC(rs11676382)的单核苷酸多态性(SNP)位点,并用Sanger测序法进行验证。结果用MALDI-TOF-MS技术可以同时完成10份标本3个华法林代谢酶基因5个SNP位点的检测。10名服华法林的心脏机械瓣膜置换术患者中,发现VKORC1-1639GA AG型2例,AA型8例,A等位基因频率为90%。未发现CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)、CYP2C9*6(rs9332131)和GGCX GC(rs11676382)突变。经与Sanger测序法比较,符合率为100%。结论成功建立MALDI-TOF-MS技术检测华法林代谢酶基因多态性的平台,该法具有高通量、快速、准确的特点,在个性化医疗上有较大的推广应用价值。     

应用焦磷酸测序技术检测VKORC1和CYP2C9基因型

目的建立基于焦磷酸测序技术的维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1(VKORC1)和细胞色素P450 2C9(CYP2C9)基因分型的方法,用于检测华法林药物代谢酶相关基因多态性。方法收集50份健康人外周血样本,提取全血基因组DNA。针对VKORC1-1639GA、CYP2C9 430CT和CYP2C91075AC 3个单核苷酸多态性(SNP)位点,分别设计一套带生物素标记的扩增引物和测序引物。样本经PCR扩增后进行焦磷酸测序,结合信号峰型分析每个样本基因型,以Sanger测序法为对照,比较两种方法检测基因型结果的一致性。结果根据待测位点出峰的碱基和峰高,可以清晰判断3个SNP位点的基因型,50份样本中,VKORC1-1639GA基因型AA和AG分别有41例和9例,各占82%和12%;CYP2C9基因型*1/*1和*1/*3分别有45例和5例,各占90%和10%,未检出等位基因CYP2C9*2。焦磷酸测序技术与Sanger测序法所检测的基因型结果一致。结论焦磷酸测序技术在SNP基因分型中具有操作简便、耗时短、成本低和结果准确可靠等优点,该检测方法可快速对CYP2C9和VKORC1的SNP位点进行分型。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测药物代谢酶基因多态性平台的建立

目的 建立基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术检测患者体内药物代谢酶基因多态性的平台。方法 选取2013年10月～2014年6月在北京协和医院门诊就诊患者53例EDTA抗凝外周血,提取全血基因组DNA,用MALDI-TOF-MS技术检测53例患者药物代谢酶基因CYP2C9*2(rs1799853),CYP2C9*3(rs1057910),CYP2C19*2(rs4244285),CYP2C19*3(rs4986893),CYP2C19*4(rs28399504),CYP2C19*5(rs56337013)和CYP2C19*17(rs12248560)的单核苷酸多态性(SNP)位点,并用Sanger测序法进行验证。结果 用 MALDI-TOF-MS 技术可以同时完成53份样本,2个药物代谢酶基因,7个SNP位点的检测。53例患者中,发现CYP2C19*2(rs4244285)AG型25例,AA型6例,GG型22例,A等位基因频率为34.9%。CYP2C19*3(rs4986893)AG型4例,GG型49例,A等位基因频率为3.8%。CYP2C9*3(rs1057910)CA型5例,AA型48例,C等位基因频率为4.7%。未发现 CYP2C9*2(rs1799853),CYP2C19*4(rs28399504),CYP2C19*5(rs56337013)和CYP2C19*17(rs12248560)位点突变。经与Sanger测序法比较,两种检测方法结果的符合率为100%。结论 成功建立MALDI-TOF-MS技术检测药物代谢酶基因多态性的平台,该平台具有高通量、准确的特点,对个性化用药治疗具有重要的临床应用价值。     

贵州地区57例遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症遗传因素分析

目的探讨遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(HPFH)患者存在的珠蛋白基因突变类型及相关单核苷酸多态性(SNP)位点的基因型,分析HPFH中血红蛋白F(HbF)水平升高的分子机制。方法收集HPFH标本,提取全血基因组DNA,采用Gap-PCR检测常见缺失型HPFH;采用PCR扩增与HbF水平升高相关的SNP位点,Sanger测序进行基因分型检测。结果57份HPFH标本中,缺失型HPFH复合β珠蛋白生成障碍性贫血2份(均为SEA-HPFH/CD17);在非缺失型HPFH标本和对照标本中,rs4671393、rs3817621位点基因型分布比较,差异有统计学意义(P<0.05),rs7482144、rs4527238、rs28384513、rs9399137、rs2072597、rs117351327、rs10128556等SNP位点基因型分布比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论SEA-HPFH/CD17、BCL11A基因rs4671393和KLF1基因rs3817621位点多态性可能是导致HPFH发生的遗传因素之一。     

焦磷酸测序法检测ALDH2*2和MTHFR 677基因多态性的性能验证

目的对实验室自建焦磷酸测序法检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)*2和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)677基因多态性的方法进行性能评价。方法对不同浓度(10.0、2.0、0.4、0.0ng/μL)的杂合型DNA标本进行检测,评价方法的检出限;采用经焦磷酸测序法验证的DNA标本的PCR产物各20例,与Sanger测序法进行比较,评价方法的准确度;对3种(野生、杂合和突变型)基因型标本重复检测4次,评价方法的重复性。结果焦磷酸测序法检测ALDH2*2和MTHFR 677多态性的检出限为2ng/μL基因组DNA;焦磷酸测序法的分型结果与Sanger测序法一致,准确度为100%;批内重复4次检测结果完全一致。结论焦磷酸测序法检测ALDH2*2和MTHFR 677基因多态性稳定可靠,满足江苏省临床检验中心的要求,可用于临床检测。     

飞行时间质谱多基因检测系统检测心血管用药11个基因的性能验证研究

目的对飞行时间质谱多基因检测平台的检测性能进行验证,建立基于飞行时间质谱多基因检测平台的性能验证研究方案。方法选择2017年9月至2018年10月来自中国医学科学院阜外医院已测部分心血管用药相关基因位点的DNA标本998例和全血标本20例,其中男性512例,女性506例。18~30岁280例,31~64岁442例,≥65岁296例。用飞行时间质谱法对998份DNA标本心血管用药相关11个基因进行检测,检测结果与已知结果进行比对,评价998例已测标本符合率;选择20例全血标本,对心血管用药相关11个基因分别进行飞行时间质谱检测和Sanger测序,对比两次结果,以Sanger测序为金标准进行准确度评价。从998例DNA标本中选择部分样本进行以下研究,选择10份包含所有位点为野生型的基因组DNA,用飞行时间质谱检测,进行特异性评价;选择4份包含所有位点杂合基因型标本,梯度稀释后检测,评价位点的测定下限;选择14份包含中国人群所有常见位点基因型标本,进行批间和批内精密度评价;选择2份包含代表性峰形的野生和纯合突变标本各1份,进行抗干扰研究。结果该方法单次检测的符合率高于99.5%,飞行时间质谱平台与Sanger测序法检测完全一致,测定下限为0.4 ngDNA,批间和批内精密度均为100%,UNG酶的降解能力为10^5拷贝/μl的气溶胶,反应体系对基因组和PCR各中间产物气溶胶有很强的抗干扰能力,点样及检测过程中芯片不同基质间无交叉污染。结论飞行时间质谱多基因检测系统检测性能良好,可应用于临床检测,并且本文建立了基于飞行时间质谱平台多基因检测系统的性能验证研究方案,为广大科研和检验工作者研究该平台打下基础。     

运用高灵敏度COLD-PCR法检测胰腺癌和结直肠癌患者KRAS基因突变

目的 评价COLD-PCR法检测胰腺癌和结直肠癌患者KRAS基因突变的价值.方法 采用COLD-PCR/Sanger测序法与普通PCR/Sanger测序法检测KRAS基因野生型结直肠癌细胞系SW116中混有的KRAS基因突变型和结直肠癌细胞系SW480中的KR4S基因突变,确定两种方法 的灵敏度,并采用两种方法 分别检测20例胰腺癌和39例结直肠癌患者石蜡包埋组织的KRAS基因突变,并评价两种方法 的符合率.结果 细胞系检测结果 显示,普通PCR/Sanger测序法和COLD-PCR/Sanger测序法检测KRAS基因突变的灵敏度分别为1∶20和1∶100(突变型:野生型).COLD-PCR/Sanger法检测20例胰腺癌患者KRAS基因突变率[75%(15/20)]高于普通PCR/Sanger测序法[40%(8/20),x2=5.013,P<0.05];COLD-PCR/Sanger测序法检测39例结直肠癌患者的KRAS基因突变率[44%(17/39)]高于普通PCR/Sanger测序法[31%(12/39),x2=1. 372,P=0.174)].两种方法 检测胰腺癌标本的符合率为65%,但一致性较差(Kappa=0.364,P<0.05);而两种方法 检测结直肠癌标本的符合率为87%,且一致性较好(Kappa=0.730,P<0.05).结论 COLD-PCR/Sanger测序法是一种高灵敏性检测胰腺癌和结直肠癌患者KRAS基因突变的方法 .     

CYP3 A5基因检测质控品制备及其应用研究

目的通过构建体外质粒DNA作为质控样品开展他克莫司代谢基因——细胞色素P450 3A5(CYP3A5)基因检测室间质量评价计划(简称室间质评),评估参评实验室检测能力及存在的问题,提高临床实验室CYP3A5基因的检测质量。方法利用基因工程技术体外构建含CYP3A5*3(rs776746)位点上、下游序列的重组质粒,筛选CYP3A5*3 AA和GG基因型分别作为野生型和突变型样品,两者等比例混合后作为杂合突变型样品,并制备质控样品盘开展室间质量评价。依据回报结果计算各实验室成绩,汇总不同样品的总体符合率,并分析不同检测方法的符合率和检测错误类型。结果体外构建的重组质粒经Sanger测序验证分别含CYP3A5*3位点野生型和突变型序列。2017年两次室间质评中成绩满分的实验室分别为93.33%(14/15)和100%(17/17)。两次室间质评中,样品检测的总体符合率分别为96%(72/75)和100%(85/85)。荧光分子杂交法检测的样品符合率均为100%; Sanger测序法检测样品符合率为90%(27/30)和100%(40/40)。结论制备的质控样品能够有效监测试剂检测性能,具有良好的适用性。各实验室在CYP3A5*3基因位点检测总体准确率较高,但个别实验室检测能力有待提高。室间质评计划能帮助实验室发现检测中存在的问题,提高检测质量。     

阿尔茨海默病、血管性痴呆及轻度认知损害患者载脂蛋白E基因多态性分析

目的探讨载脂蛋白E（ApoE）基因多态性与阿尔茨海默病（AD）、血管性痴呆（VD）和轻度认知损害（MCI）的关系。方法收集AD、VD及MCI患者外周血检测ApoE基因型,进行χ²检验。结果所有患者中ε3/ε3基因型所占比例最大,未检测到ε2/ε2及ε4/ε4基因型。AD组ε3/ε4基因型（P=0.001）及ε4基因（P=0.013）高于MCI组。VD组ε4基因高于MCI组（P=0.044）。结论ApoE ε4基因与AD的关系最为密切,是AD的危险因素。但其与VD和MCI的关系尚需进一步研究。     

Interleukin-33 gene polymorphisms and chronic obstructive pulmonary disease in the Chinese Han population

ObjectiveTo investigate the relationship between interleukin (IL)-33 gene polymorphisms rs928413 and rs7044343 with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in the Chinese Han population.MethodWe assessed IL-33 rs928413 and rs7044343 polymorphisms by Sanger sequencing of PCR products amplified from the genomic DNA of 160 COPD patients and 123 healthy controls.ResultsThere was no significant difference in the distribution of rs928413 AA, AG, or AA genotypes or rs7044343 CC, CT, or TT genotypes between the two groups. However, COPD patients had a significantly higher frequency of the rs928413 G allele G (14.1% vs 7.3%, respectively). This allele was significantly associated with susceptibility to COPD (odds ratio [OR]: 2.04, 95% confidence interval [CI]: 1.12–3.57). The rs928413 dominant inheritance model was associated with COPD susceptibility (OR: 2.08, 95%CI: 1.09–4.04).ConclusionThe G allele of rs928413 and the rs928413 dominant inheritance model were associated with susceptibility to COPD in the Chinese Han population.     

Polymorphisms in the apolipoprotein E gene regulatory region in relation to coronary heart disease and their effect on plasma apolipoprotein E.

In a previous study which examined the distribution of apolipoprotein E genotypes and plasma levels in a sample of male coronary heart disease (CHD) patients and controls, we found a significant excess of the genotypes carrying APOE*4 allele in CHD men (18.2%) vs. controls (9.6%) and an association between the APOE*4 allele and the lowest concentrations of apoE. In the present investigation, we re-examined in the same samples two recently identified polymorphisms in the promoter region of APOE, -491A/T and -427T/C, which may alter the level of apoE expression. No differences in the distributions of the -491A/T genotypes and alleles were observed between cases and controls (-491*A = 0.760 and 0.757 respectively). Polymorphism -427T/C showed in CHD patients an excess of -427*C allele (patients vs. controls = 0.123 vs. 0.074) and corresponding genotypes that was marginally significant. Stratification of the samples according to the presence/absence of APOE*4 showed that the excess of the -427*C allele concerned only CHD patients not carrying APOE*4 allele (patients vs. controls = 0.133 vs. 0.061; p=0.017). This result suggests that the presence of -427*C allele could represent a risk for developing CHD in subjects with E2/E2, E3/E2, and E3/E3 genotypes. Studies carried out on patients with Alzheimer's disease demonstrated that -491A/T and -427T/C polymorphisms affect the level of plasma apoE. In the present study, carried out on CHD patients and controls, the genetic variation at -427 and -491 sites of the APOE regulatory region had no apparent effect on apoE plasma concentration.