离子交换层析法对人血管性血友病因子中人纤维连接蛋白去除效果的研究

目的 通过层析工艺处理人凝血因子Ⅷ层析洗涤制品,采用离子交换层析法对人血管性血友病因子(vWF)中人纤维连接蛋白(Fn)去除效果进行研究,以期在不改变活性收率条件下,选择1种能够有效降低Fn的方法。方法 在多批次的工艺开发实验中,采用德国默克公司生产的Fractogel^?EMD TMAE(M)强阴离子填料进行层析,考察了vWF瑞斯托霉素效价(vWF:RCof)、vWF回收率、蛋白质含量和Fn含量。结果 在vWF小试纯化工艺开发过程中,经过离子交换层析工艺能有效降低样品中Fn含量,去除率达到87%以上,vWF效价回收率达到80%以上,其他质量指标未发生明显变化。结论 使用离子交换层析纯化vWF,能够有效降低Fn含量,对于开发新产品工艺和提高血液制品生产企业产品质量具有积极意义。     

人凝血因子V的纯化

目的 分离纯化人血浆中凝血因子V(FV),为研制FV单克隆抗体提供抗原.方法 在1 L新鲜冰冻血浆中加入酶抑制剂Benzamidine hydrochloride、二异丙基氟磷酸(DFP)和胰蛋白酶抑制剂,使其终浓度分别达到2mmol/L、1 mmol/L和50 mg/L;采用柠檬酸钡吸附、聚乙二醇6000分级沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析和Sephacryl-S300凝胶过滤层析,对血浆中FV进行分离纯化;采用凝血测定一期法检测FV活性;采用紫外分光光度法测定纯化FV的蛋白含量;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察FV的纯化情况.结果 经过对血浆前处理和两步层析后,FV活性回收率为(11.21±3.54)%,比活性为(30.46±0.31)U/mg,浓缩倍数为(2 538.33±25.83)倍(n=3);SDS-PAGE图谱显示:原料血浆添加DFP的离子交换层析样品较之未加DFP的样品在330 kD处有更粗更清晰的蛋白条带,最终纯化的FV样品仅在330 kD附近有1条较深的蛋白条带.结论 本FV纯化方法能够较有效地浓缩血浆中的FV.     

从Cohn法组份Ⅳ中分离纯化人血浆蛋白C

目的探索建立1种串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化蛋白C的方法 ,降低纯化蛋白C的成本,并实现血浆的综合利用。方法 4℃条件下,将Cohn法组份Ⅳ用PBS缓冲液抽提5h,离心(6500g)40min,上清液依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤后,超滤透析;再通过串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析,对蛋白C进行纯化。通过SDS-PAGE鉴定蛋白C的纯度;用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;通过WHO指定的发色底物法和凝固法(一期法)测定蛋白C活性。结果纯化的蛋白C在SDS-PAGE图谱上呈现1条62kD左右的蛋白带;经过离子交换层析,蛋白C的活性回收率为(48.19±9.22)%,纯化倍数为(3.75±0.56)倍;固相化金属螯合亲和层析后,蛋白C活性回收率为(59.61±5.59)%,纯化倍数为(36.79±3.72)倍;蛋白C总活性回收率为(28.77±9.45)%,纯化倍数为(136.64±6.82)倍,比活性为(11.70±0.89)IU/mg。结论串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析可以从Cohn法组份Ⅳ中获得比活性较高的蛋白C浓缩物。     

凝血酶原复合物制备过程吸附条件的研究

目的探讨凝血酶原复合物制备过程凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的吸附条件,提高活性收率。方法选择DEAE-SephadexA-50凝胶平衡体系中柠檬酸钠、氯化钠、pH 3种可变因素,每因素取3水平,根据L9(33)正交表设计试验,配制平衡液,分别对DEAE-SephadexA-50凝胶进行平衡处理后,按1.67g/L加入等量健康人混合去冷沉淀血浆,4℃搅拌,吸附凝血因子;吸附后凝胶洗涤、洗脱,检测洗脱液中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性并进行活性回收率正交试验直观分析,获得较优吸附条件并进行验证。此外,分析吸附平衡体系电导率与4种因子活性收率间关系。结果柠檬酸钠、氯化钠、pH对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ吸附影响不同;在所考察范围内,pH对4种凝血因子吸附影响效应趋势一致,pH越低,吸附效果越佳;柠檬酸钠及氯化钠浓度对4种凝血因子吸附影响效应趋势不一致,柠檬酸钠浓度越高,凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ吸附越佳,而凝血因子Ⅸ在(0.012～0.02)mol/L水平较佳;氯化钠浓度越低,凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ吸附越佳,而凝血因子Ⅹ在(0.1～0.14)mol/L水平较佳;平衡体系电导率与4种因子活性收率间不存在线性关系。结论吸附条件中pH及柠檬酸钠浓度对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ吸附效果影响较大。柠檬酸钠(0.02～0.028)mol/L,氯化钠(0.02～0.06)mol/L,pH6.6～6.9条件,4种凝血因子吸附效果相对较佳。电导率对4种因子吸附效果影响不明显。     

新型树脂扩张床吸附分离PCC的工艺及其放大研究

目的优化新型离子交换树脂CG-6从人血浆吸附分离凝血酶原复合物的工艺并作放大研究。方法采用两因素两水平正交试验,优化筛选大孔阴离子交换树脂CG-6从人血浆中吸附分离PCC的保护剂;比较2种规模扩张床流体力学性能,研究吸附柱放大规律;考察该工艺生产PCC的回收率并分析成分。结果优化保护剂0.12 mol/L甘露醇+100 IU/L肝素条件下,FⅨ一次性洗脱回收率为(90.7±7.8)%,回收率提高41%。扩张床吸附柱放大效应小。ф25 mm柱洗脱液中杂蛋白少,FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ回收率分别为(72.6±4.9)%、(72.9±10.6)%、(70.4±6.16)%、(77.8±11.8)%。结论工艺优化后制备的PCC比活及均衡度均优于传统工艺制得的产品。     

人凝血因子Ⅸ-R338A高活性突变体在毕赤酵母中的表达及活性测定

目的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)在人类内源性凝血过程中起着非常重要的作用。hFⅨ表达量绝对或相对不足会导致B型血友病。本研究用毕赤酵母生产重组高活性突变体hFⅨ-R338A。方法首先构建pPICZaA-hFⅨ-R338A酵母分泌表达载体,其次将其用电转化入毕赤酵母SMD1168中,再次利用G418抗药性的能力筛选表达量高的单克隆重组菌株,培养并将表达产物纯化,稀释后检测其凝血活性。结果通本研究获得的重组SMD1168-hFⅨ-R338A表达量达到(90-120)mg/L;比活力约为人血中野生型hFⅨ凝血活性的(38.93±5.1)%,比野生型的酵母重组hFⅨ高6.85倍。结论人凝血因子Ⅸ高活性突变体R338A是潜在的天然凝血因子替代品。     

人成釉蛋白C端肽的大量表达及纯化

目的:获得高纯度的重组人成釉蛋白C端肽。方法:实验于2001-01/2004-06在解放军第四军医大学口腔内科实验室解放军第四军医大学基础部生物化学与分子生物学实验室完成。①转化pRSET-A/成釉蛋白原核表达质粒入BL21(DE3)细菌进行大量培养,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L,32℃继续振荡诱导培养5h,收集细菌,诱导菌体的裂解上清经金属螯合亲和层析,洗脱Ni-NTA结合蛋白,收集洗脱蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定。②离子交换层析缓冲液(pH 7.4,50 mmol/L Tris·Cl)平衡Q SapharoseHP层析柱,将初步纯化的蛋白样品加在Q Sapharose HP凝胶介质上,梯度洗脱结合的蛋白,收集洗脱峰,制样,聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定洗脱蛋白。结果:①表达重组人成釉蛋白C端肽的金属螯合亲和层析结果:诱导菌体的裂解上清经金属螯合亲和层析,洗脱下Ni-NTA结合蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳法电泳证实获得初步纯化的重组人成釉蛋白C端肽,其中仍含一些杂蛋白。②重组人成釉蛋白C端肽的离子交换层析结果:获得多个蛋白洗脱峰,聚丙烯酰胺凝胶电泳法证实获得纯化的重组人成釉蛋白C端肽。结论:获得了纯化的人成釉蛋白重组蛋白。     

人凝血因子Ⅸ-V107A-R338A高活性突变体在毕赤酵母中的表达及活性测定

目的人凝血因子Ⅸ(h FⅨ)在人类内源性凝血过程中起着非常重要的作用。h FⅨ表达量绝对或相对不足会导致B型血友病。本研究用毕赤酵母生产重组高活性突变体h FⅨ-V107A-R338A。方法首先构建p PICZa A-h FⅨ-V107A-R338A酵母分泌表达载体,其次将其用电转化入毕赤酵母SMD1168中,再次利用G418抗药性的能力筛选表达量高的单克隆重组菌株,培养并将表达产物纯化,稀释后检测其凝血活性。结果通过本研究获得的重组SMD1168-hFⅨ-V107A-R338A表达量达到80-120 mg/L;活力约为人血中野生型hFⅨ凝血活性的(44.06±2.3)%,比野生型的酵母重组hFⅨ高7.75倍,比单突变R338A高13.17%。结论人凝血因子Ⅸ高活性突变体V107A-R338A是潜在的天然凝血因子替代品。     

病毒灭活血浆制备流程的建立及其对血浆质量的影响

目的探讨病毒灭活过程对血浆质量的影响;建立病毒灭活血浆的工艺流程。方法分5次共制备200 ml病毒灭活血浆34袋,血浆容量和外观检测34袋,凝血因子效价检测15对样本,并对病毒灭活柜性能进行了控制和监测。结果经病毒灭活处理后血浆回收率为(91.8±1.4)%,与灭活前相比差异有统计学意义(P<0.01,t=4.85);凝血因子回收率为(78.84±6.04)%,有9份样本凝血因子效价低于0.7 IU/ml;病毒灭活柜性能稳定。结论建立了优化的工艺流程,临床应用效果安全可靠。     

人凝血酶原复合物(PCC)效价测定中几种影响因素的探讨

<正> 作为PCC活性检测,国际上通常直接测定其所含Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ四种因子的活性,但目前国内尚不具备分别缺Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子的基质血浆,所以难以实现。1990年版《中国生物制品规程》收载了冻干人凝血酶原复合物效价测定法,即血浆当量法(PE法)。该方法是限量法,其测定结果只能表示PCC中所含凝血因子的总活性,大体上能纠正基质血浆的凝血缺陷,使之恢复至与标准血浆的凝血活性“相当”而已。因此,PE法测PCC效价存在着一些问题。为此,我们比较了含肝素样品的中和法和稀释法、不同来源的凝血活酶和不同样品稀释液对效价测定的影响,现报告如下。     

重组人血小板第4因子在大肠杆菌中的表达及其性质分析(英文)

利用PCR和重组DNA技术,在大肠杆菌中得到高效表达的人血小板第4因子(rhPF4)。rhPF4的分离纯化经肝素亲和层析和高效液相层析二步法实现。纯化产物进行了免疫学鉴定、蛋白质银染测定、N-末端氨基酸序列分析和活性分析,结果得到纯度高且具有与天然PF4一样的抑制巨核细胞生成活性的rhPF4。此方法为开发新药和深入研究PF4的作用机制奠定了基础。     

普通层析法制备的高纯度FⅨ浓缩制剂的性能

本文报道应用普通层析技术,通过DEAE-SephadexA-50、DEAF-Sepharose CL-6B和肝素-Sepharose CL-6B三步凝胶层析,由混合人血浆制备出高纯度FⅨ浓缩制剂(HP).HP特性:1.FIX:C达119±10IU/mg,接近免疫纯制品;2.纯化倍数为9000倍;3.基本除尽其它维生素K依赖蛋白如:FⅢ、FⅦ、FⅩ、蛋白C和蛋白S;4.倘存少量C4和间-α-胰胰蛋白酶抑制剂(分别为0.8和1.2mg/1000IU FⅨ:C);5.经TNBP-Tween80处理,病毒灭活程度达到纽约血液中心FⅧ浓缩制剂(经TNBP-胆酸钠处理)同样水平,因而临床使用安全.目前市面上的凝血酶原复合物(PCC),其FⅨ:C仅0.7-1.5IU/mg,纯化部数50-100倍,且不     

人体肝脏核糖核酸酶的纯化、特征及放射免疫测定

多种疾病能导致血清核糖核酸酶(RNase)活性升高。目前血清核糖核酸酶浓度的测定采用酶学方法。但该法不能区分核糖核酸酶的来源。本文用肝素亲和层析等一系列技术来纯化人肝核糖核酸酶,并用此制剂首次建立了一种敏感、特异而且重复性好的人肝RNase放射免疫测定法。人肝RNase的纯化及其特征通过缓冲液抽提、酸分离、磷酸纤维素柱层析、Sephadex G-150和Sephadex G-100凝胶层析、聚鸟嘌岭核苷酸亲和层析和肝素亲和层析等步骤,从人肝脏组织中提取并纯化了核糖核酸酶。纯化后的人肝核糖核酸酶在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈单一的狭窄区带;在pH4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈单一的,但略为扩散的区带。酶活性和蛋白区带相吻合。该酶由SDS聚丙烯酰胺电泳测     

从Cohn氏法组分Ⅲ沉淀纯化人凝血因子Ⅶ

目的探索从Cohn氏法组分Ⅲ(组分Ⅲ)沉淀中纯化人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的方法并对纯化产物进行鉴定。方法将组分Ⅲ沉淀溶解,经柠檬酸钡吸附、洗脱、硫酸铵沉淀、2次DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤纯化人FⅦ。结果从400g组分Ⅲ沉淀中最终得到10.1mg纯化的FⅦ,活性为1775.8U/mg,FⅦ被浓缩了近6000倍,总活性回收率为17.6%,SDS-PAGE电泳鉴定只有1条主条带。结论组分Ⅲ沉淀中有很高FⅧ活性;建立了从组分Ⅲ沉淀中纯化人FⅦ的方法。     

中国市场人凝血因子Ⅷ质量分析

目的考察了5种、11个批次的中国市场人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品,分析相关制品的成份。研究对国内制品的有效性和安全性做出评估,为建立新的制品质量标准提供理论依据。方法选用S公司人FⅧ、CSL Alevi-ate、+公司人FⅧ、L公司人FⅧ和Bayer KogenateFS,通过FⅧ测定进行制品活性评估,通过FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ分析杂质蛋白含量,用3种不同蛋白测定方法测定制品总蛋白含量;初步评价von Willebrand Factor(vWF)活性,并用非还原和还原SDS-PAGE电泳分析纯度。结果不同制品在活性检测、蛋白含量测定和电泳纯度评估中均有不同的表现差异。结论不同的工艺制备流程导致不同的制品质量;凝血因子类制品测定不同的方法、设备和检测试剂盒都对数值造成不确定性;甘氨酸影响Bradford法总蛋白含量测定,目前考察的几种FⅧ的关键性质量参数-比活性均大于WHO高纯度(10 IU/mg)和2010版中国药典(1IU/mg)的要求。     

用离子交换分离组分B中的凝血酶

目的　建立从Nitschmann组中分离人凝血酶的新方法。方法　用磷脂激活 ,上CMsephrosefastflow离子交换柱进行分离纯化。结果　对分离条件进行了优化 ,上样盐浓度为 2 % ,洗脱盐浓度为 1 6 %～ 1 8% ,上样速度8ml/min ,分离后凝血酶比活 1 95IU/mg,回收率 77 9%。结论　经此方法分离得到的凝血酶活性单位较高 ,并进行线形放大 ,可用于规模化生产 ,5L填料能处理 1 0 0L以上的样品     

重组人凝血因子Ⅶ的纯化与鉴定

目的建立重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ)的纯化方法。方法首先将制备并纯化的单克隆抗体与CNBr-Sepharose 6B Fast Flow介质偶联,制备单克隆抗体亲和层析柱,并用rhFⅦ标准品验证层析柱的层析效果;采用DE-AE-Sephadex A-50吸附细胞表达的上清,对吸附产物用Sephadex G-25脱盐柱做脱盐处理;然后用单克隆抗体亲和层析柱做亲和层析;通过SDS-PAGE、Western Blot等试验测定纯化产物的纯度;通过凝血酶原时间(PT)测定纯化产物的促凝活性。结果制备出rhFⅦ单克隆抗体亲和层析介质;细胞表达产物经DEAE-Sephadex A-50、Sephadex G-25脱盐和亲和层析纯化后,经SDS-PAGE鉴定获得了分子量为50kD的单一蛋白洗脱峰;纯化所获得的重组蛋白具有促凝活性,促凝时间(DT)为52s。结论建立了纯化rhⅦ的亲和层析方法 ,为rhFⅦ的研制奠定了基础。     

用离子交换分离组分B中的凝血酶

目的建立从Nitschmann组中分离人凝血酶的新方法.方法用磷脂激活,上CM sephrose fast flow离子交换柱进行分离纯化.结果对分离条件进行了优化,上样盐浓度为2%,洗脱盐浓度为16%～18%,上样速度8ml/min,分离后凝血酶比活195IU/mg,回收率77.9%.结论经此方法分离得到的凝血酶活性单位较高,并进行线形放大,可用于规模化生产,5L填料能处00L以上的样品.     

一种全自动血凝仪在人凝血因子Ⅷ浓缩剂效价检测中的应用

目的对STAGO全自动血凝仪检测人凝血因子Ⅷ浓缩剂(FⅧ)效价进行检测方法(一期法)确认。方法使用不同稀释液(样品稀释液(来自2015版中国药典)、Owren-Koller稀释液(来自法国DIAGNOSTICA STAGO公司))检测FⅧ效价,比较二者结果的差异。根据2015版中国药典要求进行检测方法确认,包括准确度、线性和范围、精密度及选择性。结果在(0.125-1)IU/mL范围内,人凝血因子Ⅷ国家标准品(GB)和FⅧ的效价[LOG(IU/mL)]和凝固时间[LOG(S)]均呈线性,相关系数均>0.990,各浓度回算值的回收率为96%-104%;准确度确认中GB回收率100%,各测定值CV≤5.4%;批内和批间精密度结果均CV<10.0%;选择性确认中GB回收率96%,且各效价结果均CV≤5.9%。2种稀释液检测效价结果差值在5%以内。结论 STAGO全自动血凝仪可满足FⅧ效价检测要求;2种稀释液对检测结果无明显差异。     

亲和凝胶分离纯化人α1-抗胰蛋白酶的研究

目的 探索通过免疫亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化人α1-抗胰蛋白酶浓缩物的方法.方法 24℃下,将Cohn氏法组份Ⅳ用Tris缓冲液抽提0.5h后,离心4 750 g×15 min,上清液加入亲水型气相二氧化硅脱脂后,离心6 000 g×15 min,再用1.2 μm的滤膜过滤;通过GE公司新型的Alpha-1 Antitrypsin Select免疫亲和凝胶层析柱,对α1-抗胰蛋白酶进行纯化.用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;用SDS-PAGE鉴定α1-抗胰蛋白酶的纯度,并用Western Blot和串联质谱分析鉴定纯化的蛋白;通过发色底物法测定α1-抗胰蛋白酶活性.结果 纯化的α1-抗胰蛋白酶在非还原性SDS-PAGE图谱上呈现1条54 kD左右的蛋白带和1条约140 kD的多聚体蛋白带,经过还原性SDS-PAGE多聚体条带解聚,Western Blot也可以反应相关变化;在经过前处理和亲和层析后,α1-抗胰蛋白酶活性回收率为(60.35±1.39)％,α1-抗胰蛋白酶总活性回收率为(41.88±6.98)％,纯化倍数为(71.68±1.32)倍,比活性大约(1.00～1.05)PU/mg.结论 GE公司Alpha-1 Antitrypsin Select免疫亲和层析亲和层析可以从Cohn氏法组份Ⅳ中特异性捕获α1-抗胰蛋白酶浓缩物.