表达人乳头瘤病毒6b和11型E6/E7基因的小鼠肿瘤细胞株的建立

目的 构建含有人乳头瘤病毒(HPV)6b和11型E6/E7基因的表达质粒和建立这些基因的转染细胞株。方法 分别将HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7克隆于含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1,经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性克隆,荧光显微镜观察,RT-PCR鉴定mRNA转录。结果 通过酶切鉴定和基因测序证实,构建质粒中目的基因片段序列完全正确。转染后荧光显微镜下可观测到B16细胞发出绿色荧光。以G418筛选的抗性细胞克隆提取RNA并经RT-PCR扩增出与目的基因大小一致的基因片段。结论 建立的小鼠肿瘤细胞B16表达HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7基因。提示转染的细胞株可移植于小鼠,利于体内研究这些基因的生物学作用和免疫学机制。     

人乳头瘤病毒11型DNA疫苗协同CD80基因诱导小鼠特异性免疫反应

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)11E7、L1-E7DNA疫苗质粒协同共刺激分子CD80诱导的特异性免疫反应.方法 将所构建的pcDNA3.1(+)/HPV11E7、E7-CD80、L1-E7DNA疫苗质粒分别经肌内注射免疫小鼠,并设L1-E7质粒与CD80质粒共同注射组,PCR和RT-PCR检测质粒DNA的组织分布和目的基因RNA转录,MTT法测脾淋巴细胞增殖活性,ELISA检测脾淋巴细胞培养上清细胞因子的表达水平及血清抗体的水平.结果 免疫小鼠后,质粒主要分布在注射部位.DNA疫苗诱导机体产生特异性脾淋巴细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ增加,产生HPV11E7 IgG/L1 IgG抗体;与CD80基因嵌合后,脾淋巴细胞增殖和分泌活性显著增强;与CD80联合免疫组所诱导的细胞免疫反应和体液免疫均显著强于L1-E7单独免疫组.结论 HPV11DNA疫苗能诱导小鼠产生特异性免疫反应,CD80可加强其免疫效果.     

含HPV16 E7的病毒样颗粒诱导小鼠产生特异性CTL反应

目的 探讨含BPVL1/HPV16E7嵌合型乳头瘤病毒样颗粒(VLPs)在动物小鼠体内的免疫学特性。方法 将HPV16E7基因分为(a)、(b)、(c)3段,与BPVL1连接后表达的BPVL1/HPV16E7(a)、(b)、(c)嵌合型VLP分别免疫小鼠C57BL/6J,对其淋巴结淋巴细胞进行细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)分析。结果 接受嵌合型VLPBPVL1/HPV16E7(b)免疫的小鼠淋巴结淋巴细胞可以引发很强的对C-2细胞(HPV16E7aa47-59转染的EL-4细胞)的特异性CTL反应,但不能对EL-4细胞产生细胞毒性作用。结论 含BPVL1/HPV16E7嵌合型VLP作为抗原输送系统致敏小鼠T淋巴细胞并引发抗原特异性CTL反应,可能为HPV疫苗的设计提供一个新手段。     

人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞中的瞬时表达

目的 利用含有人类乳头瘤病毒(HPV)16全基因的质粒转染正常人角质形成细胞,观察HPV16 mRNA在转染细胞的表达。方法 用FuGENE^TM6转染试剂,将携带HPV16全基因的质粒pSV2-neo/16转染体外培养的正常人角质形成细胞,在转染后24h提取细胞总RNA和DNA,进行RT-PCR和Southern印迹分析。结果 24h后,RT-PCR成功地扩增出110bp的片段,转染细胞中已出现HPV16 mRNA的表达,Southern印迹证实转染细胞中含有HPV16全基因7.9kb。结论 pSV2-neo/16转染正常人表皮角质形成细胞,24h内即可检测到HPV16mRNA表达。     

含人类乳头瘤病毒16E7-L1的嵌合型病毒样颗粒的构建、表达和纯化鉴定

目的 研究人类乳头瘤病毒(HPV)16型的早期基因E7,构建、表达并纯化鉴定了HPV16E7与BPVL1重组的嵌合型病毒样颗粒VLPs.方法HPV16E7基因分3段经PCR扩增后分别克隆入连有BPVL1的质粒PUC形成BPVL1HPV16E7;以质粒PVL1393为载体将BPVL1HPV16E7基因转染杆状病毒并在昆虫细胞中进行表达;用超声粉碎和蔗糖超离、氯化铯梯度离心等方法纯化以及免疫印迹、ECL、透射电镜等方法鉴定表达产物.结果 和结论成功地获得表达BPVL1HPV16E7重组体,形态和结构与野生型HPV几乎一致的嵌合型病毒样颗粒VLPs.将为进一步的HPV16E7的疫苗研究等奠定基础.     

HPV16 E6E7疫苗的构建及其免疫学活性实验研究

目的:评价从宫颈癌组织感染的人乳头瘤病毒中构建的HPV16 E6E7疫苗的免疫活性.方法:以宫颈癌组织DNA为模板,运用 PCR方法扩增HPV16 E6E7 DNA片段,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA-E6E7基因疫苗株.酶切电泳验证重组质粒.将重组pcDNA-E6E7质粒肌注免疫BaLB/c小鼠后IFA法检测其体液免疫反应,ELISA法检测其细胞免疫功能.结果:pcDNA-E6E7疫苗经肌注方式免疫BaLB/c小鼠,可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应.结论:构建的pcDNA-E6E7基因疫苗株能诱导小鼠的免疫反应.     

聚合酶链反应诱导HPV16E7C端基因突变和突变蛋白在真核细胞表达

目的 聚合酶链反应(PCR)诱导人乳头瘤病毒(HPV16)早期基因E7C端锌指结合基序基因突变,评价突变对抗原稳定性的影响。方法 采用PCR技术对HPV16E7第58、91位氨基酸进行突变,构建野生型(pcDNA3.1/16E7)和突变型(pcDNA3.1/16ME7)重组体,对其蛋白表达进行比较。结果 HPV16E7C端第58、91位氨基酸突变后真核细胞表达成功,免疫荧光检测在质粒转染COS-7细胞24h后两种重组体均有阳性细胞出现,但在48h时突变型重组体阳性细胞消失。免疫印迹技术在24h和48h时,突变型重组体均未见阳性条带。结论 HPV16E7C端锌指结构对维持蛋白稳定性起重要作用,突变后蛋白稳定性下降。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

人乳头瘤病毒6b亚型L1重组质粒的构建及免疫原性分析

目的：构建人乳头瘤病毒(HPV)6b亚型L1的重组质粒．并了解其对小鼠的免疫原性。方法：将HPV6b的L1基因插入真核表达载体pcDNA3.1中，构建L1的重组质粒；答定后转染COS-7细胞，并用免疫印迹法进行表达分析；18只BALB/巾雌性小鼠用作重组质粒的免疫原性检测。结果：重组质粒可被内切酶EcoRI和BamHI切开，测序发现插入片段与L1基因一致；转染24h后十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹出现了阳性条带；经PcDNA3.1-HPV6b L1免疫的小鼠可测到L1抗体(滴度为1：100)，IL-4水平明显升高。结论：HPV6b L1的重组质粒构建成功，能在真核细胞内表达，并能有效激发小鼠产生体液免疫和细胞免疫。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的 建立稳定表达人乳头瘤病毒（HPV）16E7蛋白的HaCaT细胞株。方法 利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1（+）中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（+）-HPV16E7。将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定。结果 经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1（+）-HPV16E7成功。RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达。结论 成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株。     

人乳头状瘤病毒16 E6/E7基因稳定表达的永生化角质形成细胞的建立及鉴定

【摘要】 目的 构建人乳头状瘤病毒（HPV）16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞（KC），为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法 两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞（HFK），利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因，连续培养30代以上，筛选出永生化KC，分为3组：①空白对照组：传代2次的原代HFK；②实验组：传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7，感染细胞记录为A0代，感染后以传代次数记录（A1、A2……）；③阳性对照组：HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达，CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果 成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后，空白对照组细胞无荧光表达，连续传代后出现衰老表现，实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化，且荧光表达率为100%。与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高（t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66；P值分别 < 0.001、 < 0.001、 = 0.001、 = 0.005）；与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高（t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22；P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014）。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达，而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示，实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组（t值分别为6.49、7.55、9.43；P值分别为0.003、0.002、0.001），而A1的增殖水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（t = 2.40，P = 0.074）。Transwell Insert侵袭实验显示，A30不能穿过基底膜，SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤，组织学亦显示无肿瘤形成，裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。结论 通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞，可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。     

人乳头瘤病毒6bL1双顺反子载体的构建及其在哺乳动物细胞内的表达

目的 构建尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6b型晚期基因（HPV6b L1）的双顺反子表达载体,并使其在哺乳动物细胞内表达,以期建立含有HPV6b L1的细胞模型。方法 表达质粒pEGFP-HPV6bL1经双酶切纯化后与经过相同双酶切的真核表达质粒pIRES2-EGFP连接,酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序。重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP转染进小鼠成纤维细胞（NIH3T3）,荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达,RT-PCR检测HPV6b L1 mRNA的生成。结果 成功构建含HPV6b L1的重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP。重组体成功转染进NIH3T3细胞,并用G418筛选。同时荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白的表达。进一步进行RT-PCR,检测到HPV6b L1 mRNA的生成。结论 成功构建携带HPV6b L1的重组体pIRES2-HPV6bL1-EGFP并转染入NIH3T3细胞。经荧光倒置显微镜观察及RT-PCR方法检测证明HPV6b L1在NIH3T3细胞内成功表达。     

人乳头瘤病毒6bL1双顺反子载体的构建及其在哺乳动物细胞内的表达

目的构建尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6b型晚期基因(HPV6b L1)的双顺反子表达载体,并使其在哺乳动物细胞内表达,以期建立含有HPV6b L1的细胞模型.方法表达质粒pEGFP-HPV6bL1经双酶切纯化后与经过相同双酶切的真核表达质粒pIRES2-EGFP连接,酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序.重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP转染进小鼠成纤维细胞(NIH3T3),荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达.RT-PCR检测HPV6b L1 mRNA的生成.结果成功构建含HPV6b L1的重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP.重组体成功转染进NIH3T3细胞,并用G418筛选.同时荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白的表达.进一步进行RT-PCR,检测到HPV6b L1 mRNA的生成.结论成功构建携带HPV6b L1的重组体pIRES2-HPV6bL1-EGFP并转染入NIH3T3细胞.经荧光倒置显微镜观察及RT-PCR方法检测证明HPV6b L1在NIH3T3细胞内成功表达.     

人乳头瘤病毒6bL1双顺反子载体的构建及其在哺乳动物细胞内的表达

目的构建尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6b型晚期基因(HPV6b L1)的双顺反子表达载体,并使其在哺乳动物细胞内表达,以期建立含有HPV6b L1的细胞模型.方法表达质粒pEGFP-HPV6bL1经双酶切纯化后与经过相同双酶切的真核表达质粒pIRES2-EGFP连接,酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序.重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP转染进小鼠成纤维细胞(NIH3T3),荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达.RT-PCR检测HPV6b L1 mRNA的生成.结果成功构建含HPV6b L1的重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP.重组体成功转染进NIH3T3细胞,并用G418筛选.同时荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白的表达.进一步进行RT-PCR,检测到HPV6b L1 mRNA的生成.结论成功构建携带HPV6b L1的重组体pIRES2-HPV6bL1-EGFP并转染入NIH3T3细胞.经荧光倒置显微镜观察及RT-PCR方法检测证明HPV6b L1在NIH3T3细胞内成功表达.     

人乳头瘤病毒6bL1双顺反子载体的构建及其在哺乳动物细胞内的表达

目的构建尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6b型晚期基因(HPV6b L1)的双顺反子表达载体,并使其在哺乳动物细胞内表达,以期建立含有HPV6b L1的细胞模型.方法表达质粒pEGFP-HPV6bL1经双酶切纯化后与经过相同双酶切的真核表达质粒pIRES2-EGFP连接,酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序.重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP转染进小鼠成纤维细胞(NIH3T3),荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达.RT-PCR检测HPV6b L1 mRNA的生成.结果成功构建含HPV6b L1的重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP.重组体成功转染进NIH3T3细胞,并用G418筛选.同时荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白的表达.进一步进行RT-PCR,检测到HPV6b L1 mRNA的生成.结论成功构建携带HPV6b L1的重组体pIRES2-HPV6bL1-EGFP并转染入NIH3T3细胞.经荧光倒置显微镜观察及RT-PCR方法检测证明HPV6b L1在NIH3T3细胞内成功表达.