机械牵拉刺激对真皮成纤维细胞胶原合成影响的初步研究

目的:探讨机械牵拉刺激对真皮成纤维细胞胶原合成的直接影响。方法 :自人包皮组织建立原代真皮成纤维细胞培养;将培养的成纤维细胞接种至Falcon细胞培养小室(美国BD公司,货号353092),培养小室底部聚乙烯对苯二甲酸酯(polyethylene terephthalate,PET)膜含有直径3μm的小孔,待成纤维细胞生长至融合,通过重力加压致使PET膜变形,借以机械牵拉PET膜表面附着生长的成纤维细胞。用倒置显微镜观察机械牵拉后成纤维细胞形态学改变;用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白印迹技术检测机械牵拉对成纤维细胞的Ⅰ型胶原蛋白(COL1A),基质金属蛋白酶-1(MMP1),组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP1),α2整合素(ITGA2)和α平滑肌肌动蛋白(ACTA2)5种基因m RNA及其蛋白表达的影响。结果:机械牵拉组细胞被拉长呈细长梭形,细胞长轴沿应力方向排列,而未牵拉对照组细胞呈梭形,排列无序散乱;qPCR结果显示机械牵拉组细胞COL1A,TIMP1,ITGA2和ACTA2基因mRNA表达增加,分别为未牵拉对照组的1.43、1.83、1.62、2.18倍(P0.05),而MMP1基因表达无明显变化(P0.05);蛋白印迹结果显示5种蛋白表达改变与其基因m RNA表达一致。结论 :机械牵拉刺激能改变真皮胶原蛋白合成-降解平衡,增加Ⅰ型胶原蛋白的从头合成。     

沙利度胺对人真皮成纤维细胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

目的：研究沙利度胺对健康人真皮成纤维细胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA和Ⅰ型胶原蛋白α1表达的影响,初步探讨沙利度胺抗真皮纤维化的潜在作用。方法原代培养人正常真皮成纤维细胞,选用第4代成纤维细胞用于后续试验。细胞分为3组,分别用10?3、10?4、10?5 mol/L沙利度胺处理,同时设空白对照组（仅用DMEM培养基处理）。24 h后,采用CCK?8法检测细胞增殖活性,荧光定量PCR法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA表达,Western印迹法测定Ⅰ型胶原蛋白α1表达。结果10?3、10?4 mol/L沙利度胺组细胞存活率为77.40%±4.25%、88.56%±6.43%,均显著低于空白对照组（100.00%±6.74%,均P<0.05）,但10?5 mol/L沙利度胺组（96.66%±1.098%）与空白对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。10?3、10?4、10?5 mol/L沙利度胺组Ⅰ型胶原蛋白α1 mRNA相对表达水平分别为0.279±0.025、0.427±0.040、0.658±0.032,均显著低于空白对照组（1.016±0.003,均P<0.05）,Ⅰ型胶原蛋白α1表达水平亦显著低于空白对照组（均P<0.05）。Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA表达水平在10?3、10?4、10?5 mol/L沙利度胺组分别为0.551±0.039、0.756±0.025、0.826±0.018,与空白对照组（0.988±0.012）比较显著降低（均P<0.05）。结论沙利度胺在一定浓度范围内可抑制健康人真皮成纤维细胞增殖,并抑制Ⅰ型胶原蛋白α1 mRNA和蛋白表达及Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA表达。     

周期性机械拉伸对人真皮成纤维细胞增殖及胶原蛋白代谢的影响

目的体外研究周期性机械应力刺激对成纤维细胞生物学行为的影响,进一步了解皮肤创面愈合的生物学机制。方法原代提取人真皮成纤维细胞(human skin fibroblasts,HFB)。采用FX-4000柔性基底应变加载系统对HFB施加周期性机械拉伸,流式细胞仪检测细胞周期,实时荧光定量PCR检测各组成纤维细胞内Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达,ELISA方法检测各组上清液中Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白的浓度。结果与静态对照组比较,10%拉伸幅度加载培养24h后,细胞增殖明显;10%拉伸幅度作用24h,48h可以促进成纤维细胞Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达;20%拉伸幅度作用24h,48h可以促进上清液中Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白的合成。结论力学刺激可以改变HFB的细胞周期,促进HFB的增殖;也能够影响细胞外基质中Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白的代谢,且与力学刺激的幅度和时间有关。     

成纤维细胞与纤连蛋白粘附及其诱导的酪氨酸磷酸化蛋白在硬皮病原胶原基因表达中的作用

目的研究硬皮病成纤维细胞与纤连蛋白粘附 ,以及粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白在成纤维细胞表达原胶原mRNA中的作用。方法将硬皮病成纤维细胞置于纤连蛋白包被的培养体系中粘附培养 ,运用RT PCR、免疫印迹法分别检测原胶原mRNA表达的变化及粘附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白 ;并观察阻断酪氨酸磷酸化后 ,原胶原mRNA和酪氨酸磷酸化蛋白的变化。结果硬皮病成纤维细胞与纤连蛋白粘附 ,可诱导相对分子质量为98000、65000酪氨酸磷酸化蛋白生成 ,且原胶原 proα1(Ⅰ)mRNA的表达显著增加 ;经酪氨酸激酶抑制剂作用后 ,伴随着相对分子质量为98000、65000酪氨酸磷酸化蛋白的减少 ,原胶原proα1(Ⅰ)mRNA显著降低。结论成纤维细胞与纤连蛋白粘附 ,在硬皮病原胶原表达增加中具有重要作用 ,由粘附诱导的酪氨酸磷酸化是其中的一个重要环节。     

4-HPR对瘢痕疙瘩成纤维细胞Procollagen Ⅰ、MMP-1及信号通路PI3K/Akt的影响

目的探讨4-羟苯基维胺(4-hydroxyphenyl-retinamide,4-HPR)对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用及PI3K/Akt信号转导通路的影响。方法通过免疫印迹方法检测人瘢痕疙瘩成纤维细胞中,4-HPR对Ⅰ型前胶原(type I pro-collagen,ProcollagenⅠ)和基质金属蛋白酶-1(matrix metallo-protein-1,MMP-1)蛋白表达水平,观察4-HPR联合TGF-β1、PD98059、SP600125、SB203580及LY294002对瘢痕疙瘩成纤维细胞中相关蛋白表达的影响。结果瘢痕疙瘩成纤维细胞中,4-HPR使ProcollagenⅠ蛋白表达水平明显减少,MMP-1蛋白表达水平明显增加,并且具有4-HPR浓度依赖性(P0.01)。在瘢痕疙瘩成纤维细胞中,4-HPR+TGF-β1组中ProcollagenⅠ蛋白表达水平较TGF-β1组明显降低(P0.01),但P-Smad2和P-Smad3蛋白表达均无显著改变(P0.05)。LY294002组中ProcollagenⅠ蛋白水平与对照组相比显著降低,MMP-1显著升高(P0.01)。但PD98059、SB203580及SP600125组中ProcollagenⅠ和MMP-1蛋白水平与对照组相比未发生明显变化(P0.05),且4-HPR可有效抑制P-Akt蛋白表达水平(P0.01)。结论人瘢痕疙瘩成纤维细胞中,4-HPR可以抑制Ⅰ型前胶原蛋白的表达、上调MMP-1的表达,而这种调控作用可能与PI3K/Akt信号传导通路被削弱有关。     

SSc患者外周血外泌体通过microRNA-21介导成纤维细胞活化北大核心CSCD

目的比较系统性硬皮病患者(systemic sclerosis,SSc)与正常人外周血外泌体(exosome)中microRNA-21-5p(miR-21-5p)的表达差异,评估外周血中外泌体对人皮肤成纤维细胞功能状态的影响。方法提取SSc患者及正常人外周血外泌体,荧光定量PCR法检测miR-21-5p表达情况;外泌体刺激人皮肤成纤维细胞,CCK-8法检测细胞增殖能力,免疫印迹检测CollagenⅠ,Ⅲ及平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平。结果 SSc患者外周血外泌体中miR-21-5p显著高于正常人。与正常人相比,患者外泌体可明显增强人皮肤成纤维细胞的增殖能力及上调CollagenⅠ,Ⅲ,α-SMA的水平,上述作用可被转染miR-21-5p抑制剂阻断。结论 SSc患者循环外泌体通过转运miR-21-5p介导人皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。miR-21-5p可能是SSc潜在的生物标记物。     

SSc患者外周血外泌体通过microRNA-21介导成纤维细胞活化

目的比较系统性硬皮病患者(systemic sclerosis,SSc)与正常人外周血外泌体(exosome)中microRNA-21-5p(miR-21-5p)的表达差异,评估外周血中外泌体对人皮肤成纤维细胞功能状态的影响。方法提取SSc患者及正常人外周血外泌体,荧光定量PCR法检测miR-21-5p表达情况;外泌体刺激人皮肤成纤维细胞,CCK-8法检测细胞增殖能力,免疫印迹检测CollagenⅠ,Ⅲ及平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平。结果 SSc患者外周血外泌体中miR-21-5p显著高于正常人。与正常人相比,患者外泌体可明显增强人皮肤成纤维细胞的增殖能力及上调CollagenⅠ,Ⅲ,α-SMA的水平,上述作用可被转染miR-21-5p抑制剂阻断。结论 SSc患者循环外泌体通过转运miR-21-5p介导人皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。miR-21-5p可能是SSc潜在的生物标记物。     

瘦素调节HaCaT细胞角蛋白17的表达

目的 探讨瘦素对HaCaT细胞角蛋白17（K17）表达的影响。 方法 体外培养HaCaT细胞,给予100 ng/ml的瘦素作用24 h,应用实时PCR检测K17 mRNA表达水平、Western印迹及免疫荧光染色法检测K17蛋白表达水平变化。 结果 与阴性对照组（1.000 0 ± 0.000 0）相比较,瘦素组（3.086 7 ± 0.186 1）K17 mRNA表达显著升高,差异有统计学意义（P < 0.01）。Western印迹结果表明,瘦素组K17蛋白较阴性对照组显著上调,细胞免疫荧光染色结果与RT-PCR、Western印迹结果相符。与单纯使用瘦素组（2.242 7±0.188 7）相比较,STAT3抑制剂组和Erk1/2抑制剂组K17 mRNA分别为0.674 1 ± 0.060 0、0.855 0 ± 0.390 3,Western印迹和细胞免疫荧光染色显示,两个抑制剂组的K17蛋白较瘦素组均显著下调,差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 瘦素可以诱导HaCaT细胞表达K17,其机制可能与激活STAT3、Erk1/2信号转导途径有关。     

NHERF1及β联蛋白在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义

【摘要】 目的 探讨钠氢交换子调节因子-1（NHERF1）及β联蛋白在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义。方法 使用免疫细胞化学法、实时荧光定量-PCR法、免疫印迹法对黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞中NHERF1及β联蛋白的表达情况进行观察。使用MTT法对黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞的增殖情况进行检测。结果 NHERF1及β联蛋白在黑素细胞中同时表现为细胞膜阳性表达,而在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中均出现膜表达的缺失,同时呈现不同程度的胞质和（或）胞核阳性表达。在3株黑素瘤细胞系中,MV3细胞中的NHERF1免疫细胞化学染色仅呈少部分胞质弱阳性表达,实时荧光定量PCR检测NHERF1的mRNA表达水平最低,免疫印迹法中未见NHERF1蛋白表达条带,而其在MTT法中检测到的增殖速度最快,明显高于另外两株细胞。A375细胞中的NHERF1免疫细胞化学染色呈胞质及胞核的强阳性表达,实时荧光定量PCR检测NHERF1的mRNA表达水平最高,免疫印迹法中可见NHERF1蛋白最强阳性表达,而其增殖速度却慢于MV3细胞。β联蛋白在MV3细胞中免疫细胞化学染色呈细胞质及细胞核的强阳性表达,实时荧光定量PCR检测的mRNA表达水平最高,免疫印迹法检测到蛋白最强阳性表达;而A375细胞及M14细胞中,β联蛋白在免疫细胞化学染色呈相对弱的细胞质阳性表达,实时荧光定量PCR检测的mRNA表达水平明显较低;免疫印迹法中的蛋白表达较MV3中的表达低。结论 黑素瘤细胞胞质中NHERF1表达量可能与细胞的增殖速度相关,NHERF1在黑素瘤细胞中表达程度越低细胞增殖越快。黑素瘤细胞中的NHERF1与β联蛋白存在着差异性表达。 【关键词】 黑色素瘤; 钠氢交换子调节因子-1; β连环蛋白     

NHERF1及β联蛋白在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义北大核心CSCD

目的探讨钠氢交换子调节因子-1（NHERF1）及B联蛋白在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义。方法使用免疫细胞化学法、实时荧光定量-PCR法、免疫印迹法对黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞中NHERF1及13联蛋白的表达情况进行观察。使用MTr法对黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞的增殖情况进行检测。结果NHERF1及β联蛋白在黑素细胞中同时表现为细胞膜阳性表达,而在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中均出现膜表达的缺失,同时呈现不同程度的胞质和（或）胞核阳性表达。在3株黑素瘤细胞系中,MV3细胞中的NHERF1免疫细胞化学染色仅呈少部分胞质弱阳性表达,实时荧光定量PCR检测NHERF1的mRNA表达水平最低,免疫印迹法中未见NHERF1蛋白表达条带,而其在MTT法中检钡4到的增殖速度最快,明显高于另外两株细胞。A375细胞中的NHERF1免疫细胞化学染色呈胞质及胞核的强阳性表达,实时荧光定量PCR检测NHERF1的mRNA表达水平最高,免疫印迹法中可见NHERF1蛋白最强阳性表达,而其增殖速度却慢于MV3细胞。β联蛋白在MV3细胞中免疫细胞化学染色呈细胞质及细胞核的强阳性表达,实时荧光定量PCR检测的mRNA表达水平最高,免疫印迹法检测到蛋白最强阳性表达;而A375细胞及M14细胞中,β联蛋白在免疫细胞化学染色呈相对弱的细胞质阳性表达,实时荧光定量PCR检测的mRNA表达水平明显较低;免疫印迹法中的蛋白表达较MV3中的表达低。结论黑素瘤细胞胞质中NHERF1表达量可能与细胞的增殖速度相关,NHERF1在黑素瘤细胞中表达程度越低细胞增殖越快。黑素瘤细胞中的NHERF1与β联蛋白存在着差异性表达。     

成纤维细胞与纤连蛋白粘附及其诱导的酷氨酸磷酸化蛋白在硬皮 …

目的 研究硬皮病成纤维细胞与纤连蛋白粘附,以中附诱导的酷氨酸磷酸化蛋白在成纤维细胞表达原胶原ＭＲＮＡ中的作用。方法 将硬皮病成纤维细胞置于纤连蛋白包被的培养体系中粘附培养运用ＲＴ－ＰＣＲ、免疫印迹法分别检测原胶原ＭＲＮＡ表达的变化及粘附诱导的酷氨酸磷酸化蛋白：并观察阻断酷氨酸磷酸化后,原胶原ＭＲＮＡ和酷氨酸磷酸化蛋白生成。且原胶原ｐｒｏα１（１）ＭＲＮＡ的表达显著增加,经酷氨酸激酶抑制剂作用后,伴     

跨膜蛋白45A对瘢痕疙瘩成纤维细胞合成细胞外基质的影响

目的研究跨膜蛋白45A(TMEM45A)在瘢痕疙瘩组织及成纤维细胞中的表达, 探讨其对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)细胞外基质(ECM)的影响。方法收集2019年1月至2020年12月期间在延边大学附属医院皮肤科及泌尿外科手术切除的瘢痕疙瘩和正常包皮组织标本, 采用Western印迹法检测瘢痕疙瘩组织及KF中TMEM45A蛋白表达情况。将KF分成两组, 分别通过特异性TMEM45A小干扰RNA(siRNA)和对照siRNA转染, 进而采用Western印迹法检测TMEM45A基因的下调对肌成纤维细胞标志性蛋白(α平滑肌肌动蛋白)及ECM相关蛋白表达的影响。结果与正常皮肤组织(1.00 ± 0.11)及成纤维细胞(1.00 ± 0.20)相比, TMEM45A在瘢痕疙瘩(0.26 ± 0.05)及KF(0.41 ± 0.09)中的表达显著降低(t值分别为10.76、4.75, P值分别<0.001, = 0.009)。TMEM45A特异性siRNA组中α-平滑肌肌动蛋白(t = -5.98, P = 0.004)及ECM蛋白Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白(t值分别为-4.57、-4.90, P值分...     

浅层X射线照射的间隔时间对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原分泌的影响

 目的 探讨不同间隔周期浅层X射线照射对人瘢痕疙瘩成纤维细胞及细胞外基质胶原蛋白表达的影响，确认最适辐照间隔时间。方法 收集切除的瘢痕疙瘩组织分离培养原代瘢痕疙瘩成纤维细胞，实验组进行不同时间间隔（1、2、3、4、5、6、7 d）浅层 X射线照射，总剂量均为15 Gy。采用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）与Western blot检测细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的相对表达，ELISA检测细胞外上清Ⅰ型胶原蛋白改变，初步验证浅层 X射线治疗瘢痕疙瘩的最适辐照时间间隔。对照组与不同间隔周期浅层X射线照射组Ⅰ型、Ⅲ 型胶原蛋白含量的比较采用单因素方差分析；各组间Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白mRNA下降量比值行独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果 与对照组相比，不同时间间隔浅层 X射线处理后瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达水平在间隔3 d（t=12.09，P<0.01）出现低峰值，Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达水平与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。间隔3 d mRNA水平检测成纤维细胞内Ⅰ型胶原蛋白与Ⅲ型胶原蛋白的比值下降最明显，差异有统计学意义（t=6.67，P<0.01）。除间隔7 d外,各实验组HKF细胞中Ⅰ型胶原蛋白表达水平与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.01），在间隔1 d（t=9.97，P<0.01）出现低峰值；而HKF细胞中Ⅲ型胶原蛋白水平与对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.01）。Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白比值在间隔前3 d逐渐升高，而间隔5 d（t=0.21，P＞0.05）和间隔7 d（t=0.66，P＞0.05）差异无统计学意义。所有实验组ELISA检测细胞外上清Ⅰ型胶原蛋白表达均下降（P<0.05）。间隔7 d照射组细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及细胞外上清Ⅰ型胶原蛋白表达均出现胶原分泌回升趋势。结论 照射间隔控制在3 d内能显著降低胶原蛋白的表达，对临床制定放射治疗方案具有重要意义。     

低氧对系统性硬化病患者皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响

目的 研究低氧对系统性硬化病(SSc)患者和正常人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成及胶原基因表达的影响。方法 分别以5例SSc患者和5例正常人皮肤成纤维细胞系作为实验对象。将成纤维细胞分别放入20%正常氧和2%低氧分压环境中培养,用分光光度仪测定细胞培养基上清液中羟脯氨酸含量,并折算成胶原蛋白含量。用Trizol提取细胞总RNA,用RT-PCR方法测定其中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结果 培养至第6天,低氧分压条件下,SSc患者皮肤成纤维细胞培养基中胶原蛋白含量比正常氧分压条件下显著增加(t=3.97,P=0.0041);正常人皮肤成纤维细胞培养基中胶原蛋白含量此时也显著增加(t=2.63,P=0.0302)。培养至第3天,低氧分压条件下,SSc成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达量比正常氧分压条件下均有显著增加(Ⅰ型:t=5.81,P=0.0004;Ⅲ型:t=6.44,P=0.0002);正常人皮肤成纤维细胞此时的Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达量与SSc患者相似,低氧分压条件下比正常氧分压条件下均有显著增加(Ⅰ型:t=4.40,P=0.0023;Ⅲ型:t=2.24,P=0.0453)。结论 低氧状态下,SSc患者和正常人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成均有增加,Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达也均增加.低氧可能是皮肤硬化的一个相关因素。     

SIRT6对老年人皮肤成纤维细胞迁移能力和增殖能力的影响及机制研究

目的 探讨沉默信息调节因子2同源类似物6（SIRT6）对老年人皮肤成纤维细胞迁移能力和增殖能力的影响及机制。方法 在山西医科大学第二附属医院泌尿外科取不同年龄患者包皮环切术切取的包皮组织，其中老年组8例，青年组8例。用胶原酶消化法提取人皮肤成纤维细胞，Western印迹法检测不同年龄组人皮肤成纤维细胞中SIRT6和磷酸化p65蛋白（p-p65）的表达，划痕实验检测细胞迁移活性，CCK8法检测细胞增殖活性。将老年组皮肤成纤维细胞分成两组，一组用SIRT6慢病毒感染使其SIRT6表达增高作为SIRT6组，另一组以空病毒感染作为对照组，用上述方法分别检测SIRT6组和对照组细胞迁移活性、增殖活性和p-p65蛋白表达水平，实时PCR检测两组Ⅰ型和Ⅲ胶原蛋白、整合素亚基α3、α5和β1 mRNA的表达。采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，t检验分析两组之间数据的差异。结果 老年组皮肤成纤维细胞SIRT6表达水平（0.434 ± 0.179）显著低于青年组（1.000 ± 0.067，t = 3.040，P = 0.012），p-p65表达水平（1.694 ± 0.148）显著高于青年组（1.000 ± 0.093， t = 2.949，P = 0.015），迁移率（43.81% ± 18.84%）显著低于青年组（94.63% ± 12.32%，t = 5.903，P = 0.003），24、48 h增殖活性也较青年组显著下降（P < 0.05）。老年组成纤维细胞过表达SIRT6后，与对照组相比，p-p65表达显著下降（P < 0.05），迁移能力和增殖能力显著提高（P < 0.05），同时Ⅲ胶原蛋白和整合素亚基α3、α5和β1的mRNA表达水平显著升高（P < 0.05）。结论 SIRT6可提高老年人成纤维细胞的迁移能力和增殖能力，其机制可能与抑制NF-κB通路有关。     

神经鞘氨醇磷酸胆碱对人成纤维细胞差异表达基因的筛选

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC）对人真皮成纤维细胞的差异表达cDNA消减杂交文库，从中克隆出差异表达基因。方法原代培养人皮肤成纤维细胞；提取经SPC处理和未处理的成纤维细胞总RNA，合成cDNA，进行2次消减杂交及2次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接．构建SPC作用于人真皮成纤维细胞的差异表达cDNA消减杂交文库，用RNA印迹验证阳性克隆，测序并登陆基因库寻找同源性基因。结果成功构建了SPC作用于人真皮成纤维细胞的差异表达cDNA文库：从实验组筛查的28个差异表达克隆中确定了6个差异表达基因，其中已知基因5个、新基因1个，分别为基质金属蛋白酶2，血小板反应蛋白1，催产素受体，锌指转录因子，铁传递蛋白受体等。结论神经鞘氨醇磷酸胆碱可上调人真皮成纤维细胞基质金属蛋白酶、血小板反应蛋白1、催产素受体、锌指转录因子、铁传递蛋白受体等基因表达。     

PI3K和磷酸化Akt在尖锐湿疣皮损中的表达

目的:检测PI3K/Akt信号转导通路中PI3K和磷酸化Akt在尖锐湿疣皮损中的表达.方法:采用免疫组化和蛋白印迹法检测30例尖锐湿疣皮损及15例正常对照者皮肤活检组织中PI3K和磷酸化Akt的表达,并利用计算机图像采集与分析系统对免疫组化结果进行平均吸光度(A值)测定和对免疫印迹测定结果进行灰度扫描.结果:尖锐湿疣皮损中PI3K和磷酸化Akt的表达明显高于正常皮肤.蛋白印迹结果与免疫组化检测一致(两组比较,均P＜ 0.01).结论:PI3K/Akt信号通路异常激活可能参与了尖锐湿疣的发病.     

紫外线A1对真皮成纤维细胞的损伤及Tempol保护作用的研究

目的 研究紫外线Al(UVAl,340nm-400nm)对人真皮成纤维细胞氧化性损伤、对基质金属蛋白酶(MMP)和胶原蛋白表达的影响,观察氮氧化物Tempol对这些改变的保护作用。方法 体外原代培养的人真皮成纤维细胞接受UVAl照射,同时加入或不加Tempol,以生化方法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量,以半定量逆转录-聚合酶链反应及酶连免疫吸附试验测定MMP-1,MMP-3,Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA或蛋白表达水平。结果 15J/cm²UVAl照射可显著抑制细胞SOD活性,提高MDA含量,促进MMP-1,MMP-3mRNA表达,同时显著抑制Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达(P<0.05)。照射同时加入Tempol,在一定浓度范围,可显著抑制UVAl引起的上述改变(P<0.05)。结论 Tempol在体外对UVAl引起的氧化性损伤以及真皮细胞外基质成分代谢紊乱有保护作用,因而有可能成为防治光老化的一种成分。     

白藜芦醇对病理性瘢痕成纤维细胞mTOR信号通路相关分子表达的影响

目的观察白藜芦醇对病理性瘢痕成纤维细胞mTOR信号通路关键分子PI3K、Akt、mTOR表达的影响。方法应用免疫荧光检测PI3K、Akt、mTOR在病理性瘢痕及正常皮肤组织成纤维细胞中的表达;病理性瘢痕成纤维细胞经不同浓度白藜芦醇处理后,分别应用RT-PCR、Western Blot检测PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白的表达。结果免疫荧光检测结果显示,PI3K、Akt、mTOR在病理性瘢痕成纤维细胞中表达明显增强,且主要表达于细胞核,而在正常皮肤组织成纤维细胞中未见明显表达;RT-PCR及Western Blot检测结果显示,病理性瘢痕成纤维细胞经不同浓度的Res干预后,Akt和mTOR mRNA和蛋白表达量降低,并且呈剂量依赖关系,与对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05),而PI3K mRNA和蛋白表达量降低不明显,与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。结论白藜芦醇抑制病理性瘢痕成纤维细胞增殖的机制可能与其下调mTOR信号通路关键分子Akt、mTOR表达有关。     

培养硬皮病皮损成纤维细胞Smad3 DNA结合活性的研究

目的：探讨培养硬皮病成纤维细胞中磷酸化转录因子Smad3的表达和转录因子Smad3的DNA结合活性和表达量。方法：4例硬皮病患者和4例正常人对照进入本研究。采用Western Blot检测了磷酸化Smad3在培养硬皮病成纤维细胞全细胞裂解液中的表达;采用电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）检测了培养硬皮病成纤维细胞在核蛋白中Smad3的DNA结合活性,并对其进行了密度扫描和定量分析。结果：磷酸化转录因子Smad3的表达在培养硬皮病成纤维细胞全细胞裂解液中呈高表达,所有正常人对照为阴性。在培养硬皮病成纤维细胞核蛋白中,转录因子Smad3的DNA结合活性是显著增高的;经密度扫描,是正常人对照的21倍;培养正常人成纤维细胞核蛋白中转录因子Smad3的DNA结合活性仅略高于本底颜色。结论：磷酸化转录因子Smad3高表达和Smad3的DNA结合活性显著增高,提示转录因子Smad3在硬皮病纤维化的病理发生过程中具有重要作用。