体外SELEX法筛选淋病奈瑟菌适体方法的建立

目的 建立运用SELEX技术从人工体外合成的随机ssDNA文库中筛选到针对淋病奈瑟球菌适体的方法 方法 取一定量体外合成随机寡核苷酸文库结合缓冲液中95℃加热5分钟,迅速4℃冷却10分钟,再投入适量的淋病奈瑟菌,室温摇匀30分钟后更换离心管离心分离,使用洗脱液悬起冲洗,反复4次,尽量洗去结合不强的片段。最后菌体和目的片段的复合体在99℃的蒸馏水加热3分钟后中释放出所筛选的目的片段,纯化目的片段,以之为模板,经PCR大量扩增,产物纯化后做为下轮的文库。在反复筛选10轮后,利用卡它莫拉氏菌,干燥奈瑟氏菌,灰色奈瑟氏菌进行了反筛工作,最终获得所需的针对淋病奈瑟菌的适体。 结果 筛选到针对淋病奈瑟球菌的特异性适体 结论 成功运用SELEX技术从人工体外合成的随机ssDNA文库中筛选到针对淋病奈瑟球菌的特异性适体,为建立快速而简便检测淋病奈瑟菌的实验室方法奠定基础。     

FQ-PCR法与培养法检测淋病奈瑟菌的比较

淋病病原体为淋病奈瑟菌,简称淋球菌(Neisseria gonorrhea, NG).男性患者一般症状较典型,女性淋球菌感染者常无症状或症状不典型,容易成为潜在的传染源.检测淋球菌的方法有很多,目前最主要的是聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和细菌培养法两种.近几年来发展起来的FQ-PCR(fluorescent quantitative polymerase chain reaction)法,因其灵敏度和特异性好而越来越受到关注.在SARS冠状病毒的鉴定过程中发挥了重要的作用,已逐步应用于临床.本文用FQ- PCR法、培养法和革兰氏染色涂片法检测了男女疑似淋病患者,对培养法和FQ-PCR法检测淋球菌的效果进行了评价,试图寻找一种先进的、快速而敏感的淋病奈瑟氏菌定量检测方法,以提高淋球菌检测的准确性,从而减少淋球菌的漏检率.     

聚合酶链反应与淋球菌培养法检测淋病奈瑟菌的比较研究

目的比较聚合酶链反应(PCR)和淋球菌培养法检测淋病奈瑟菌的检出率.方法采用PCR法和淋球菌培养法检测192例生殖道感染的患者淋病奈瑟菌.结果两种方法检测均阳性77例,均阴性98例,PCR阳性而培养阴性12例,PCR阴性而培养阳性5例.PCR法阳性检出率为46.35%,而培养法为42.71%.结论淋球菌培养与PCR法检测淋病奈瑟菌有很好的一致性.     

Taqman MGB荧光PCR检测生殖支原体

目的 参照文献建立一种快速、灵敏、准确的生殖支原体（Mg）的检测方法,并应用该方法调查生殖支原体在广西贺州暗娼中的流行情况。方法 参考文献中以生殖支原体Pa基因为靶基因设计的引物和Taqman MGB探针进行实时定量PCR,以生殖支原体标准菌株G37制备标准品,对广西贺州暗娼人群的宫颈拭子标本进行生殖支原体的检测。结果 建立的Taqman MGB实时定量PCR方法检测的线性范围好（1 × 10 ~ 106拷贝/μl）,R2 = 0.993,重复性好,（批内变异系数 = 0.7%,批间变异系数 = 1.09%）,敏感性高,检测限（LOD）为10拷贝/μl,定量限（LOQ）为50拷贝/μl。采用该方法检测404份拭子标本,生殖支原体的检出率为12.1%。结论 针对生殖支原体Pa基因的Taqman MGB实时PCR可以快速、灵敏地对生殖支原体进行定性及定量的检测。     

荧光定量聚合酶链反应在生殖器疱疹诊断和分型中的应用

目的评价荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在生殖器疱疹(GH)诊断和分型中的应用。方法以单纯疱疹病毒(HSV)-1 DNA多聚酶基因和HSV-2糖蛋白D基因为靶基因区,设计合成正向、反向引物和探针,分别对HSV-1和HSV-2进行FQ-PCR检测,优化反应体系,进行方法学评价,并对疑似GH患者的生殖器棉拭子标本采用FQ-PCR进行检测和分型。结果建立的FQ-PCR对HSV检测和分型具有特异性;线性范围好(标准品的浓度为5×102~5×108 copies/ml,r=0.998);灵敏度达到5×102 copies/ml;重复性较好,批内CV值为2.29%,批间CV值为4.76%。186例患者HSV阳性44例,阳性率为23.7%(44/186);其中44例阳性者中HSV-1 8例(占18.2%),标本病毒载量为8.5546×106 copies/ml,HSV-2 36例(占81.8%),病毒载量为1.9 861×106 copies/ml。FQPCR与PCR法的HSV检出率与分型检测结果一致。结论建立的FQ-PCR方法具有高特异性和敏感性,分型、定量准确,方法快速、简便,可用于GH的诊断和分型。     

不孕不育患者解脲支原体、沙眼衣原体及淋病奈瑟氏菌感染状况调查

目的:探讨解脲支原体、沙眼衣原体、淋病奈瑟氏菌感染与不孕不育的相关性。方法:选取2012年8月至2015年8月于我院诊治的不孕不育症患者800例纳入不孕不育组,另选取同期于我院健康体检或产检者800例纳入健康对照组。采用荧光定量PCR仪测定两组患者解脲支原体、沙眼衣原体及淋病奈瑟氏菌DNA。结果:与健康对照组相比,不孕不育组患者解脲支原体感染、沙眼衣原体感染、解脲、沙眼衣原体同时感染、淋病奈瑟氏菌感染率明显较高(P0.05)。不孕不育组130对夫妻中丈夫和妻子的解脲支原体、沙眼支原体感染率分别为62.3%、59.2%、44.6%、39.2%,其夫妻间感染解脲支原体、沙眼支原体具有相关性(r=0.864,P0.05;r=0.773,P0.05)。结论:生殖道解脲支原体、沙眼衣原体、淋病奈瑟氏菌感染与不孕不育相关,有必要对不孕不育夫妻同时检测解脲支原体、沙眼衣原体、淋病奈瑟氏菌DNA。     

男性泌尿生殖道感染非淋病奈瑟菌的毒力相关基因检测

目的检测男性泌尿生殖道分离的非淋病奈瑟菌毒力相关基因,探讨非淋病奈瑟菌的致病机理。方法采用PCR扩增和核苷酸序列分析技术,检测从男性泌尿生殖道感染患者生殖道分离的6个菌种12株非淋病奈瑟菌的毒力相关基因orf1,nspA,PIA,PIB,opa,iga,pilE。结果 12个分离菌株中8株(检出率66.67%)检出毒力相关基因,其中orf1的阳性率为25.00%(3/12),opa为25.00%(3/12),PIB为16.67%(2/12),nspA为8.33%(1/12),各菌株均未检出PIA,pilE与iga。结论感染男性泌尿生殖道的部分非淋病奈瑟菌具有淋病奈瑟菌的毒力相关基因。但这些毒力相关基因并不是非淋病奈瑟菌引起男性生殖道感染的唯一致病因素,非淋病奈瑟菌的男性生殖道致病性可能与其黏膜寄生性等生物学特性有关。     

PCR-RLB技术同时检测淋病奈瑟菌Opa和16S rRNA基因的研究

目的建立和评价一个新的多重PCR-反向线点杂交技术(RLB)检测淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)的方法。方法选择NG Opa基因和16S rRNA基因分别设计两对PCR引物,生物素标记下游引物。构建二重PCR扩增NG DNA,然后与固定在尼龙膜上的特异性寡核苷核探针杂交。并对117例经荧光定量PCR(FQ-PCR)检测的标本进行检测。结果多重PCR两对引物均可扩增3株NG标准菌株DNA,其中Opa和16S rRNA PCR产物的片段长度分别为89bp和414bp。43份FQ-PCR NG阳性标本中31份16S rRNA PCR-RLB阳性,而Opa PCR-RLB均检测为阳性,31份二者均为阳性。74份FQ-PCR NG阴性标本中64例Opa PCR-RLB阴性,73例16S rRNA PCR-RLB阴性,64份二者同时为阴性。结论多重PCR-RLB检测NG是一种简便、快速及有效的方法,为无症状人群NG感染的初筛和准确诊断提供了一种可靠的方法。     

淋病奈瑟菌外膜Porin I蛋白基因的构建、表达和鉴定

目的：构建、克隆淋病奈瑟菌外膜PorinI(PI)蛋白基因，并进行表达、纯化和鉴定。方法：用PCR法克隆淋病奈瑟菌外膜PI蛋白基因，再与pGEX-4T-2载体连接成表达重组体pGEX-4T-2/PI；经大肠杆菌P2392表达后，用SDS-PAGE、切胶、电洗脱回收等方法纯化GST-PI融合蛋白；然后用特异性淋球菌外膜PI蛋白的单克隆抗体进行斑点免疫层析试验鉴定该蛋白。结果：成功地获取了pGEX-4T-2/PI表达重组体，经诱导表达后能获得高表达的GST-PI融合蛋白，其相对分子质量为60000；斑点免疫层析试验显示其淋病奈瑟菌外膜PI蛋白特异性的。结论：本研究将有利于进一步研究淋病奈瑟菌外膜PI蛋白的功能。     

聚合酶链反应与淋球菌培养法检测淋病奈瑟茵的比较研究

目的 比较聚合酶链反应（PCR）和淋球菌培养法检测淋病奈瑟菌的检出率。方法 采用PCR法和淋球菌培养法检测192例生殖道感染的患者淋病奈瑟菌。结果 两种方法检测均阳性77例，均阴性98例，PCR阳性而培养阴性12例，PCR阴性而培养阳性5例。PCR法阳性检出率为46．35％，而培养法为42．71％。结论 淋球菌培养与PCR法检测淋病奈瑟菌有很好的一致性。     

DNA芯片快速检测淋球菌gyrA基因突变

目的 研制一种新型DNA芯片,用于快速检测淋球菌gyrA基因突变。方法 根据淋球菌gyrA基因的序列信息设计探针并制作DNA芯片,PCR扩增并荧光标记包含gyrA基因突变的目的DNA片段,与芯片杂交,同时以测序法为对照。结果 50份泌尿生殖道拭子全部可用DNA芯片检测出来,芯片检测结果与药敏结果符合率为100%,与测序结果二者符合率为98%。结论 DNA芯片检测淋球菌gyrA基因突变具有快速、高特异性和高灵敏度,可以应用于临床耐药性检测。     

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB的克隆表达与鉴定

目的　构建表达淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法　用PCR方法从淋病奈瑟菌WHO标准株E株基因组扩增出PorB基因片段 ,插入 pUCm T载体中 ,序列测定正确后 ,将其亚克隆到表达载体 pQE3 0中 ,进一步测序正确后在大肠杆菌M 15中表达。 结果　获得淋病奈瑟菌PorB蛋白基因 ,经序列测定与GenBank公布的序列同源性高达 99% ;表达蛋白经SDS PAGE分析 ,相对分子质量与预期大小一致 ;重组蛋白经Western印迹法鉴定 ,在 3 4kD位置有特异条带 ,PorB蛋白在宿主菌中高表达。结论　基因重组表达的融合蛋白将有利于进一步研究淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB的功能 ,并有可能用于淋病预防疫苗的研制     

应用PCR技术快速检测淋球菌

自淋球菌４．２Ｋｂ质粒ｐＪＤｌ基因序列选择一对引物序列合成引物，ＰＣＲ扩增产物为２３０ｂｐ片段。经３０次循环后，最低可检出１０ＣＦＵ。特异性试验结果表明，这对引物与白念珠菌有部分同源性，ＰＣＲ扩增产物小于７５ｂｐ。与脑膜炎奈瑟菌及其他１３种常见的细菌、４种念珠菌、沙眼衣原体、解脲支原体、正常女性宫颈分泌物中的细菌均无同源性。临床标本检测结果表明，与涂片法和培养法相比较，阳性检出率可达１００％。试验表明，应用本方法可直接快速检测分泌物中的淋球菌。     

LCR技术检测男性首段尿中的淋病奈瑟菌和沙眼衣原体

目的：应用连接酶链反应（LCR）技术检测男性尿标本中的淋病奈瑟菌和沙眼衣原体,初步评价其敏感性和特异性。方法：采集受检者晨起或较长时间（2小时以上）不排尿后的首段尿（FVU）标本1131份,利用LCR技术对此尿液标本进行淋病奈瑟菌和沙眼衣原体检测,对Cut-off值在灰区以上的标本进行PCR检测。对LCR和PCR结果相异的标本,用另-LCR试剂进行复检,参照“扩大的金标准”来确定检测结果。结果：LCR技术检测淋病奈瑟菌的敏感性和特异性分别为100％和99．9％,沙眼衣原体分别为97．5％和98．4％。结论：应用LCR技术筛检男性尿液中淋病奈瑟菌和沙眼衣原体,是一种既敏感又特异的非侵入诊断方法,可避免取尿道标本给患者带来的痛苦。     

DNA芯片检测泌尿生殖道病原体及耐药的研究

目的 研制一种DNA芯片,结合多重PCR方法快速检测泌尿生殖道炎症3种病原体及其耐药类型。方法 根据泌尿生殖道病原体淋球菌、沙眼衣原体和解脲脲原体的基因保守序列设计引物和探针,分别检测3种病原体;根据淋球菌gyrA、parC和16srRNA基因序列突变位点设计引物和探针,分别检测淋球菌对喹诺酮类药物和大观霉素的耐药性;根据淋球菌和解脲脲原体的共同tetM基因序列设计引物和探针,检测对四环素的耐药性。制备芯片,对152份泌尿生殖道拭子提取DNA进行7重PCR扩增,并且Cy5荧光标记包含上述基因序列的目的DNA片段,与固定在芯片上的探针杂交,芯片信号分析系统Scanarray 4000在635nm处扫描并分析结果,并与临床检查结果比较。结果 DNA芯片敏感性是0.01fg质粒DNA。152份泌尿生殖道炎症拭子其病原体种类及其耐药类型全部可用DNA芯片检测出来,与目前临床检查结果有较好的一致性(K>0.8)。结论 研制的DNA芯片结合7重PCR方法快速检测泌尿生殖道淋球菌、沙眼衣原体和解脲脲原体3种病原体及其对喹诺酮类药物、大观霉素和四环素的耐药类型,具有快速、高特异性和高灵敏度,可以应用于临床检测。     

淋病奈瑟菌表面蛋白A真核表达载体的构建及表达

目的构建淋病奈瑟菌外膜蛋白———奈瑟菌表面蛋白A(neisseria surface protein A,NspA)的真核表达载体并使其在真核细胞中表达。方法用PCR方法扩增NspA基因,将扩增的产物连接于测序载体pUCm-T上,并构建重组体pcDNA3.1(+)/NspA。以脂质体法转染RAW264.7和COS-7细胞,用RT-PCR检测NspA mRNA的水平,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果扩增的目的基因包括了全段NspA基因,长度约525bp。以脂质体转染RAW264.7和COS-7细胞后,用RT-PCR和免疫组化染色法检测表明,细胞可转录和表达NspA。结论成功构建了重组真核表达载体pcD-NA3.1(+)/NspA,并在真核细胞中得到表达,为研究此蛋白的免疫原性以及淋病基因疫苗的研制提供了物质基础。     

Evaluation of opa-based real-time PCR for detection of Neisseria gonorrhoeae

OBJECTIVES: Detection of Neisseria gonorrhoeae by commercial and in-house-based assays has been hampered by false-positive and false-negative results. The current study describes a sensitive and specific real-time 5'-nuclease PCR assay targeting a 90-bp region of the multicopy opa gene. GOAL: To evaluate the sensitivity and specificity of this assay in detection of gonococcus. STUDY: Sensitivity and specificity were determined by testing a panel of 173 microorganisms. In addition, 135 clinical samples previously evaluated by 4 nucleic acid amplification methods were also tested. RESULTS: A sensitivity of 1 copy per reaction was achieved. Positive results were only obtained for N gonorrhoeae strains including 20 cppB-negative strains. Overall, 134 of 135 clinical sample results agreed with the consensus nucleic amplification methods. CONCLUSION: This study demonstrates opa-based target can be used as an accurate and rapid PCR assay for the detection of N gonorrhoeae in clinical specimens.     

Evaluation of real time polymerase chain reaction assays for confirmation of Neisseria gonorrhoeae in clinical samples tested positive in the Roche Cobas Amplicor assay

OBJECTIVE: Development of a rapid, sensitive, and accurate assay for confirmation of Neisseria gonorrhoeae in clinical samples. METHOD: Two real time polymerase chain reaction (PCR) assays, developed on the LightCycler for amplification of the N gonorrhoeae cppB gene, were utilised for confirmation of this bacterial pathogen in samples positive by the Roche Cobas Amplicor assay. Performance characteristics of the two assays were compared with other commercial nucleic acid amplification assays, including the Abbott LCx and Roche 16S rRNA tests. RESULTS: All related Neisseria as well as other bacterial species tested negative by both cppB gene based assays, whereas 120 N gonorrhoeae clinical isolates from various geographical regions gave in positive results. Both assays had a sensitivity of one copy per reaction. 122 clinical samples positive and another 50 samples negative for N gonorrhoeae by Roche Cobas Amplicor were selected from a specimen pool of more than 3000 women tested previously. Overall, 73 of 122 (59.8%) samples were confirmed as positive. The two real time assays had sensitivities of 99% and 100% and specificities of 98% and 100%, respectively. The 16S and LCx assays produced similar results to the real time assays, indicating a similar sensitivity to and specificity of both real time assays. CONCLUSION: The data from this study highlight the need to confirm N gonorrhoeae positive Cobas Amplicor PCR results as an important part of the testing algorithm of all diagnostic laboratories utilising this assay.     

淋病奈瑟菌分离株3种药物耐药基因检测

目的：从基因水平了解淋病奈瑟菌对青霉素类、四环素类、喹诺酮类3种抗菌药物的耐药状况。方法：采用聚合酶链反应(PCR)对常州地区的50株淋病奈瑟菌进行TEM-1基因、tetM基因检测并对gyrA基因的DNA进行测序分析。结果：50株淋病奈瑟菌中32株TEM-1基因阳性，24例tet基因阳性，经PCR扩增和DNA测序，gyrA基因全部存在突变，PPNG—TRNG—QRNG3种分子检测发现青霉素类、四环素类与喹诺酮类二重耐药分别占26％和10％，耐多种药物(MDR)菌株总数已达74％。结论：淋球菌对青霉素类、四环素类、喹诺酮类抗菌药物的耐药性已相当高，迫切需要寻找新的敏感抗菌药物。     

淋球菌rpsE基因突变与大观霉素耐药性的研究

目的 探讨淋球菌rpsE基因突变与淋球菌大观霉素耐药的相关性。 方法 对临床分离的4株大观霉素耐药的淋球菌株（MIC128 μg/ml、256 μg/ml）的rpsE基因进行PCR扩增测序分析,寻找可能的突变位点,通过DNA转化技术将含有突变基因的细菌基因组DNA转化入敏感的淋球菌株,检测转化成功的淋球菌的MIC并进行PCR扩增测序,分析发现的突变位点与淋球菌大观霉素耐药的相关性。 结果 4株大观霉素耐药的菌株均发现rpsE基因A70C（Thr24Pro）突变,而16S rRNA大观霉素耐药决定区（SRDR）未发现任何突变;大观霉素敏感菌株的16S rRNA和rpsE基因均未发现突变。转化后获得的大观霉素耐药淋球菌中亦发现了同样的rpsE基因突变。 结论 rpsE基因单点突变与淋球菌对大观霉素耐药相关。