一个新的多功能细胞因子一趋化素样因子

细胞因子是在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质,克隆和研究新的细胞因子具有重要的理论意义和应用价值.我们利用抑制性减数杂交技术(SSH),从PHA刺激的U937细胞中成功克隆了一个新的细胞因子趋化素样因子1(CKLF1).CKLF1全长cDNA包括530个碱基,有一个编码99个氨基酸的完整开放读码框架.CKLF1存在其他三种变异体,命名为CKLF2,3,4,分别编码152,67和120个氨基酸,其中,CKLF2是CKIF的全基因产物.亚细胞定位和Western blot分析发现,CKLF1和CKLF3主要为分泌性表达,而CKLF2和CKLF4主要以膜结合形式表达.CKLF1与已发现的其他细胞因子之间没有明显的同源性,CKLF1在PHA刺激的U937细胞中的表达可被IL-10部分抑制.重组的CKLF1在体内外对嗜中性细胞、单核细胞和淋巴细胞具有明显的趋化活性;在体内能引起肺部明显的炎性改变,与CKLF1转基因小鼠的肺部病变相;CKLF1还能刺激骨髓细胞和小鼠骨骼肌细胞增殖.CKLF2能促进小鼠肌母C2C12细胞增殖和分化,促进BALB/c 3T3细胞增殖,并能拮抗撤血清引起的细胞凋亡,以上结果表明CKLF1可能在炎症和骨骼肌再生过程中发挥重要作用.在CKLF1,2的序列基础上,利用生物信息学方法克隆了小鼠CKLF2,4和大鼠CKLF1,2,它们与人CKLF1,2,4有相似的结构和功能;在人和小鼠CKLF的序列基础上,我们成功克隆了其他4个与CKLF有同源性的新基因,命名为趋化素样因子相关蛋白1-4(CKLF-RP1-4),它们与CKLF2有相似的结构,在16号染色体上成基因簇形式存在,因此,CKLF代表一个有重要功能的新基因超家族.     

一个新的多功能细胞因子—趋化素样因子

细胞因子是在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质,克隆和研究新的细胞因子具有重要的理论意义和应用价值。我们利用抑制性减数杂交技术(SSH),从PHA刺激的U937细胞中成功克隆了一个新的细胞因子趋化素样因子1(CKLF1)。CKLF1全长cDNA包括530个碱基,有一个编码99个氨基酸的完整开放读码框架。CKLF1存在其他三种变异体,命名为CKLF2,3,4,分别编码152,67和120个氨基酸,其中,CKLF2是CKLF的全基因产物。亚细胞定位和Western blot分析发现,CKLF1和CKLF3主要为分泌性表达,而CKLF2和CKLF4主要以膜结合形式表达。CKLF1与已发现的其他细胞因子之间没有明显的同源性,CKLF1在PHA刺激的U937细胞中的表达可被IL-10部分抑制。重组的CKLF1在体内外对嗜中性细胞、单核细胞和淋巴细胞具有明显的趋化活性;在体内能引起肺部明显的炎性改变,与CKLF1转基因小鼠的肺部病变相;CKLF1还能刺激骨髓细胞和小鼠骨骼肌细胞增殖。CKLF2能促进小鼠肌母C2C12细胞增殖和分化,促进BALB/c3T3细胞增殖,并能拮抗撤血清引起的细胞凋亡,以上结果表明CKLF1可能在炎症和骨骼肌再生过程中发挥重要作用。在CKLF1,2的序列基础上,利用生物信息学方法克隆了小鼠CKLF2,4和大鼠CKLF1,2,它们与人CKLF1,2,4有相似的结构和功能;在人和小鼠CKLF的序列基础?     

大鼠趋化素样因子对成肌细胞促增殖作用的研究

目的 探讨大鼠趋化素样因子1和2（rCKLF1，2）对成肌细胞的增殖促进作用。方法 构建pcDNA3.1/rCKLF1和pcDNA3.1/rCKLF2真核表达载体，并瞬时转染293T细胞，收获培养上清，分别以^3H-TdR掺入和MTT比色法，分析rCKLF1和rCKLF2对小鼠肌母细胞系C2C12和原代肌卫星细胞增殖的促进作用，结果 成功地构建了rCKLF1和rCKLF2的真核表达质粒，并在SV40转化的293T细胞中瞬时表达rCKLF1和rCKLF2，瞬时转染上清能够使C2C12细胞的^3H-TdR的掺入值增加2倍或3倍，MTT比色法分析表明，rCKLF1和rCKLF2的转染上清，对Wistar大鼠乳鼠肌卫星细胞具有增殖促进作用。结论 rCKLF1和rCKLF2能够促进骨骼肌细胞的增殖，为进一步探讨CKLF家族分子在骨骼肌细胞增殖分化中的作用提供了实验依据。     

人类新细胞因子(CKLF-1)在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：进一步研究人类新细胞因子－－趋化素样因子1（CKLF－1）蛋白的结构与生物学活性。方法：构建了融合蛋白的原核表达质粒，并在大肠杆菌中进行诱导表达，获得了原核表达的融合蛋白，经凝血酶切割获非融合重组蛋白，并进行体外活性鉴定。结果：CKLF－1原核表达蛋白获得了高表达，纯化后获得约90％纯度以上蛋白，发现其可以与肝素结合，生物学活性检测表明其对人中性粒细胞，外周血单个核细胞和大鼠的巨噬细胞具有明显的趋化作用。结论：CKLF－1原核表达蛋白具有与真核表达蛋白类似的生物学活性。     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达及其功能研究

目的:实现抗人CD40的人-鼠嵌合抗体(ch-5C11)在的CHO细胞中的稳定表达并对其生物学活性进行初步的研究。方法:pIRES/hu5C11嵌合抗体重组表达质粒用脂质体法转染CHO细胞,采用RT-PCR对CHO细胞进行基因水平鉴定,以流式细胞术(FCM)和Western blot对表达上清中ch-5C11人免疫球蛋白Fc段和κ链成分进行检测,利用Protein G亲和层析和Lowry法进行纯化和定量,MTT实验检测表达ch-5C11对Daudi细胞增殖的抑制效应。结果:获得稳定分泌目的蛋白的CHO稳定株,RT-PCR结果表明目的基因成功整合在CHO稳定株中,FCM和Western blot结果表明稳定株上清中含有抗人CD40抗体,且含人免疫球蛋白Fc段和κ链;Lowry法定量ch-5C11浓度为0.535mg/L,并经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定纯度良好;ch-5C11能抑制Daudi细胞增殖。结论:获得了持续分泌ch-5C11的CHO稳定株,功能学研究显示ch-5C11能抑制B细胞淋巴瘤细胞株体外增殖。     

人sPD-1-Fc融合蛋白的构建及Cos-7细胞的表达

目的:构建重组人pSG5-Fc-hPD-1嵌合基因质粒,并在真核细胞进行表达,得到分泌性的sPD-1-Fc融合蛋白。为PD-1的生物学活性研究奠定基础。方法:从GenBank里查到人PD-1胞外区的基因序列,设计特异性引物,以人淋巴细胞cDNA为模板PCR扩增得到人PD-1胞外区片段。以pSG5-Fc真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pSG5-Fc-hPD-1。脂质体瞬时转染猴肾成纤维细胞(Cos-7),收取72 h的细胞上清。用Western blot鉴定,并与原核表达的人PD-L1蛋白免疫共沉淀检测生物学活性。结果:通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切及测序证实构建的重组质粒pSG5-Fc-hPD-1正确。重组质粒在Cos-7细胞中高效表达并分泌融合蛋白sPD-1-Fc到细胞上清,应用Western blot测定到上清中的融合蛋白,且得到的sPD-1-Fc融合蛋白具有与PD-L1结合的生物学活性。结论:通过基因重组方法在真核细胞里得到高效分泌型表达的sPD-1-Fc重组蛋白,为研究PD-1生物学活性奠定了实验基础。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体(pSUPER-XBP1S)并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

重组腺病毒Ad-IL-12感染淋巴细胞对人卵巢癌细胞SKOV3增殖和凋亡的影响

目的 探讨重组腺病毒Ad-IL-12感染人外周血淋巴细胞后对人卵巢癌细胞SKOV3周期、增殖和凋亡的影响.方法 采用重组人IL-12腺病毒(Ad-IL-12)感染人外周血淋巴细胞,感染48 h后与人卵巢癌细胞SKOV3共培养(SKOV3/Ad-IL-12),同时设未感染组(SKOV3)和Ad-GFP空载感染组(SKOV3/Ad-GFP)作为对照.RT-PCR检测IL-12双亚基P35和P40的mRNA表达,ELISA检测细胞培养上清中IL-12 P70蛋白的分泌,CCK8法检测卵巢癌细胞增殖,流式细胞术分析卵巢癌细胞周期和凋亡,RT-PCR和Western blot检测抗凋亡蛋白BCL-2、survivin 的表达.结果 重组腺病毒Ad-IL-12可成功感染人外周血淋巴细胞,分泌较高水平的IL-12 P70蛋白;淋巴细胞过表达IL-12可抑制SKOV3细胞的增殖;与未感染组和空载组相比,SKOV3/Ad-IL-12组G1期细胞显著增加,凋亡率显著升高(P＜0.05),SKOV3细胞中抗凋亡蛋白BCL-2和survivin显著下调(P＜0.05).结论 人IL-12基因重组腺病毒可以成功感染人外周血淋巴细胞,分泌IL-12 P70蛋白,并可以通过阻滞细胞周期进程和促进细胞凋亡抑制人卵巢癌细胞SKOV3的增殖.     

乙型肝炎表面抗原不同突变体对细胞免疫的影响

目的　研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)不同突变体对细胞免疫的影响。方法　将野生型和变异型HBsAg基因重组质粒NS2 Swt、NS2 S12 6、NS2 S133、NS2 S14 1、NS2 S14 5分别转染CHO细胞,72h收获细胞上清。采用ELISA法检测各组细胞上清preS2 蛋白的表达量。将这些细胞上清刺激PHA活化的人淋巴细胞,MTS法检测不同变异株抗原对淋巴细胞增殖活性以及淋巴细胞分泌IFN γ、IL 10和IL 2的影响。结果　变异和野毒株(wt)各组细胞上清preS2 蛋白的表达量基本一致。变异和wt重组HBsAg刺激T细胞后,其上清MTS显色后的A4 90 值均高于空白组和pCI neo组,说明HBsAg中的蛋白可以促进T细胞增殖;T12 6S氨基酸变异HBsAg能够刺激IFN γ分泌增加;M133T氨基酸变异刺激IL 10分泌增加。结论　这4种乙型肝炎病毒(HBV)变异株感染人体后,机体对它们的细胞免疫反应可能不会有明显的增强或减弱,但也不能忽视T12 6S和M133T变异抗原改变了某些细胞因子的表达,可能对机体细胞免疫造成的潜在影响。     

小鼠趋化因子CCL19Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

通过特异引物扩增出去掉终止密码的mCCL19编码序列,经酶切、亚克隆、拼接构建了真核表达载体pcDNA3.1-mCCL19Ig,酶切和测序鉴定插入序列;将重组质粒转染CHO细胞进行体外表达,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达,利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含mCCL19编码序列和人IgG1 Fc段序列,其序列分别与GenBank中公布序列比对一致,IgG1 Fc段读码框未发生改变;Western blot结果证实转染了pcDNA3.1-mCCL19Ig的CHO细胞培养上清中有相对分子质量为38 000的融合蛋白mCCL19Ig表达;体外趋化实验表明融合蛋白mCCL19Ig对小鼠脾细胞有趋化活性,且呈剂量依耐关系。     

Neuronal and glial responses to siRNA-coated nerve guide implants in vitro

Cerebral ischemic injury is associated with the induction of a series of pro-inflammatory mediators such as cytokines and chemokines. The chemokine-like factor 1(CKLF1), as a novel human cytokine, displays chemotactic activities in a wide spectrum of leukocytes. The present study was conducted to determine if CKLF1 was produced in the brain of rats subjected to transient middle cerebral artery occlusion (TMCAO). Therefore, RT-PCR, Western blot and immunohistochemistry were utilized to characterize the expression of CKLF1 at different times after TMCAO. The result showed that almost no expression of CKLF1 was found in the sham-operated or contralateral cerebral cortex and hippocampus. CKLF1 expression significantly increased in the ischemic cerebral cortex and hippocampus, elevating at 12 h and peaking at 2 days after reperfusion. CKLF1 positive staining was mainly present in the cerebral cortex, hippocampus, thalamus, and hypothalamus. These results demonstrate that the expression of CKLF1 increases after focal cerebral ischemia in rat brain. Thus, CKLF1 may be a potential therapeutic target for cerebral ischemia.     

PD-L1-GPI分子膜表面修饰胰岛细胞抑制反应性T细胞的攻击

目的： 构建PD-L1表达腺病毒载体,研究其对反应性T细胞的免疫抑制效应,以探讨预防1型糖尿病患者的胰岛β细胞的免疫损伤机制。方法: 用含目的基因的腺病毒载体pAd5/ PD-L1-GPI感染小鼠胰岛瘤细胞株NIT细胞, 提取膜蛋白经Western blotting证实靶细胞高效表达目的蛋白PD-L1-GPI。取小鼠外周血非贴壁的淋巴细胞, 与靶细胞混合淋巴细胞培养,进行淋巴细胞增殖和反应性T细胞功能检测,并检测细胞培养液中IL-2、TNF-α和IFN-γ水平。 结果: 与对照组NIT细胞比较,用PD-L1-GPI修饰的NIT细胞能够更有效地抑制已致敏的淋巴细胞增殖,且下调反应性T细胞分泌的IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子水平(P<0.05)。 结论: PD-L1基因在胰岛细胞中表达可有效地抑制已活化的反应性T细胞,阻断自身免疫性T细胞的胞毒作用,诱导免疫耐受,将成为治疗糖尿病的一个有价值的方向。     

Subcloning and expression of the Brucella abortus L7/L12 ribosomal gene and T-lymphocyte recognition of the recombinant protein.

The Brucella abortus L7/L12 ribosomal gene was amplified by PCR and subcloned into the prokaryotic expression vector pMAL-c2. Escherichia coli DH5 alpha was transformed with the pMAL-L7/L12 construct, and gene expression was induced by IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside). The resulting fusion protein was purified by affinity chromatography and confirmed by Western blot (immunoblot) analysis using an anti-maltose-binding protein antibody. Additionally, purified recombinant L7/L12 protein induced T-lymphocyte proliferation of B. abortus-primed bovine peripheral blood mononuclear cells. Phenotypic analysis of the proliferating cell population demonstrated an increase in the percentage of CD4+ T lymphocytes when peripheral blood mononuclear cells were cultured with recombinant L7/L12 compared with cells cultured in medium alone. Subcloning and expression of a B. abortus gene encoding a previously demonstrated immunodominant protein for bovine lymphocytes are important steps in selecting Brucella proteins that have potential as a component of a genetically engineered candidate vaccine.     

Autostimulatory factor produced by B-cell lines from patients with Sj?gren's syndrome

Sj?gren's syndrome (SS) is an autoimmune disease with a predisposition to transform into a B-cell lymphoma. Stable B-cell lines were established (without exogenous stimulation other than fetal bovine serum) from the peripheral blood of three SS patients. These cell lines secreted immunoglobulin (either IgG, IgM or both) and expressed cytoplasmic immunoglobulin. They were positive for the B-cell markers Leu 12 and Leu 16, and also for HLA-DR and the transferrin receptor. The cells lacked CD3 and the IL-2 receptor. Supernatants from these cell lines had autostimulatory activity. When 24-h culture supernatants were added to freshly cultured peripheral blood mononuclear cells, the proliferation index was 2-3 times higher as compared to cells cultured with HB101 medium alone. This autostimulatory activity can be attributed to a B-cell growth factor since these supernatants were also able (1) to support the growth of BD9 cells and (2) to augment the proliferation of PB B cells preactivated with S. aureus Cowan strain I. Furthermore, the supernatants did not contain IL-1, IL-2, or gamma-interferon. Thus, B cells that grow spontaneously from the peripheral blood of SS patients spontaneously produce a B-cell growth factor. This factor could contribute importantly to the autoantibody production, tissue lymphoid infiltration and B-cell lymphoma seen in this disease.     

利用自体血清培养人外周血内皮祖细胞

背景：传统方法培养人外周血来源内皮祖细胞操作复杂,费用大,细胞获得率较低。 目的：利用自体血清培养人外周血来源内皮祖细胞,并鉴定其功能。 方法：采用密度梯度离心法从人外周血分离得到单个核细胞,体外培养分化为内皮祖细胞。按培养基条件不同分为EGM-2MV组、添加自体血清组(M199+体积分数10%自体血清+胰岛素样生长因子)、添加胎牛血清组(M199+体积分数10%胎牛血清+血管内皮细胞生长因子+碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子+表皮生长因子)。观察内皮祖细胞增殖、迁移能力;采用细胞形态观察、双荧光染色法及流式细胞仪等技术对培养的内皮祖细胞进行鉴定。 结果与结论：培养第7天,EBM-2MV组和添加自体血清组细胞增殖能力和迁移率都优于添加胎牛血清组(P < 0.05)。每组细胞经结合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素双色荧光染色鉴定后双阳性率> 80%,免疫细胞化学检测显示每组细胞CD133,CD34和KDR的表达均为阳性。证实在M199培养液中添加自体血清是一种简单、高效的培养内皮祖细胞方法。     

GST-人可溶性成纤维细胞生长因子受体1融合蛋白在酵母细胞中的表达及活性测定

目的：表达重组人可溶性成纤维细胞生长因子受体１（ｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１，ｓＦＧＦＲ１），研究其对成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）生物学活性的拮抗作用。方法：采用逆转录－ＰＣＲ（ＰＴ－ＰＣＲ）技术自人肺成纤维细胞获得ｓＦＧＦＲ１　ｃＤＮＡ，测序确证后，将其克隆人酵母细胞表达载体ｐＹＥＸ４Ｔ－１；重组质粒转化入酵母细胞（ＤＹ１５０）中进行诱导表达，表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定。利用 ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖抑制实验检测重组人 ｓＦＧＦＲ１的生物学活性。结果：经 ＣｕＳＯ４诱导，酵母细胞表达出重组谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白，此蛋白在凝胶上表现为 １条约 ６０ｋＤ的阳性区带，在 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验中可被ＧＳＴ特异性抗体识别。重组ＧＳＴ－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白的粗提物在体外能够桔抗ＦＧＦ介导的促ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖的活性。结论：重组ＧＳＴ－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白在酵母表达系统中得到有效表达，并具有很好的生物活性。     

人胰岛素样生长因子-1的真核表达及其生物学功能研究

目的：构建人胰岛素样生长因子1（IGF-1）分泌型真核表达载体，并检测表达产物的生物活性。 方法：用RT-PCR法从人肝细胞克隆IGF-1基因，并将其连入Psec Tag/FRT/V5-His载体，用脂质体法转染CHO细胞，将转染细胞上清培养骨髓基质干细胞，用MTT法测定骨髓基质干细胞的增殖情况。 结果：成功扩增210 bp的IGF-1基因，表达产物经SDS-PAGE分析及Western blotting检测具有7.7 kD特异性条带。骨髓基质干细胞的增殖随转染细胞上清的浓度、转染细胞上清培养时间的增加而增加。 结论：成功构建分泌型IGF-1真核表达载体，其表达产物对骨髓基质干细胞具有促增殖作用。     

过表达泛素偶联酶E2C对293T细胞增殖的影响

目的:构建稳定过表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C)的293T人胚肾细胞株,初步探讨其对293T细胞增殖的影响。方法:采用脂质体法将已成功构建的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒转入293T人胚肾细胞株中,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株;用Western blot技术检测并鉴定UBE2C基因在293T细胞中的表达情况;用MTT法检测UBE2C对293T细胞增殖的影响。结果:Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的UBE2C蛋白表达水平明显高于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。MTT法检测结果显示转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的增殖速度明显快于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。结论:成功建立稳定过表达UBE2C的293T细胞株,过表达UBE2C可促进293T细胞的增殖。     

A T cell activation antigen,Ly6C,induced on CD4+ Th1 cells mediates an inhibitory signal for secretion of IL-2 and proliferation in peripheral immune responses

A T cell activation antigen, Ly6C, is considered to be involved in the autoimmunity of some autoimmune-prone mice; however, the function of Ly6C remains largely unknown. We prepared a rat anti-mouse Ly6C monoclonal antibody (mAb) (S14) that inhibits the proliferation of peripheral T cells stimulated with anti-CD3 mAb in vitro. S14 mAb, the specificity of which is confirmed by a cDNA transfectant, recognizes Ly6C antigen preferentially expressed on a part of CD8⁺ T cells in peripheral lymphoid organs. The immunohistochemical analysis demonstrates that Ly6C appears on CD8⁺ T cells in the conventional T cell-associated area of BALB/c but not of nonobese diabetic (NOD) mice, confirming the absence of Ly6C⁺ T cells in NOD mice. Addition of soluble S14 mAb to the culture does not influence the proliferation of T cells in vitro; however, the S14 mAb coated on the plate clearly inhibits the proliferation and IL-2 production of anti-CD3-stimulated peripheral T cells. The T cells are arrested at the transitional stage from G₀/G₁ to S+G₂/M phases, but they are not induced to undergo apoptotic changes in vitro. This inhibitory signal provided through the Ly6C molecule inhibited IL-2 secretion in a subpopulation of the activated CD4⁺ T cells. Ly6C is expressed on T cell clones of both Th1 and Th2 cells, but the cytokine secretion from Th1 clones is preferentially inhibited. These results suggest that Ly6C mediates an inhibitory signal for secretion of cytokines from Th1 CD4⁺ T cells, potentially causing the inhibition of immune response in peripheral lymphoid tissues.