一个新的多功能细胞因子—趋化素样因子

细胞因子是在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质,克隆和研究新的细胞因子具有重要的理论意义和应用价值。我们利用抑制性减数杂交技术(SSH),从PHA刺激的U937细胞中成功克隆了一个新的细胞因子趋化素样因子1(CKLF1)。CKLF1全长cDNA包括530个碱基,有一个编码99个氨基酸的完整开放读码框架。CKLF1存在其他三种变异体,命名为CKLF2,3,4,分别编码152,67和120个氨基酸,其中,CKLF2是CKLF的全基因产物。亚细胞定位和Western blot分析发现,CKLF1和CKLF3主要为分泌性表达,而CKLF2和CKLF4主要以膜结合形式表达。CKLF1与已发现的其他细胞因子之间没有明显的同源性,CKLF1在PHA刺激的U937细胞中的表达可被IL-10部分抑制。重组的CKLF1在体内外对嗜中性细胞、单核细胞和淋巴细胞具有明显的趋化活性;在体内能引起肺部明显的炎性改变,与CKLF1转基因小鼠的肺部病变相;CKLF1还能刺激骨髓细胞和小鼠骨骼肌细胞增殖。CKLF2能促进小鼠肌母C2C12细胞增殖和分化,促进BALB/c3T3细胞增殖,并能拮抗撤血清引起的细胞凋亡,以上结果表明CKLF1可能在炎症和骨骼肌再生过程中发挥重要作用。在CKLF1,2的序列基础上,利用生物信息学方法克隆了小鼠CKLF2,4和大鼠CKLF1,2,它们与人CKLF1,2,4有相似的结构和功能;在人和小鼠CKLF的序列基础?     

人重组趋化素样因子1在果蝇S2细胞中的表达和功能研究

目的 在果蝇S2细胞中表达人趋化素样因子1(chemokine-like factor 1,CKLF1),并对其分泌形式进行功能研究.方法 构建pMT/V5-His-CKLF1表达质粒,转染S2细胞,筛选并鉴定阳性细胞克隆,用兔抗人CKLF1多肽抗体对其培养上清进行Western blot检测,并分析其趋化活性和促C2C12细胞增殖活性.结果 RT-PCR证明CKLF1在S2细胞中高效转录;通过Western blot在细胞培养上清中可检测到表达的重组CKLF1蛋白;其对人外周血中性粒细胞和淋巴细胞有较弱的趋化活性,对C2C12细胞具有增殖促进作用.结论 在果蝇S2细胞中成功表达了人重组CKLF1,并证实其存在分泌形式且具有趋化活性和促C2C12细胞增殖活性.     

利用抑制性减数杂交技术(SSH)研究IL-10抑制表达的新基因

目的　利用抑制性减数杂交 (SSH)技术筛选IL 10抑制表达的新基因。方法　以PHA刺激的U937细胞为tester,以PHA刺激同时IL 10抑制的U937细胞为driver,提取mRNA ,反转录构建cDNA文库 ,利用SSH技术筛选IL 10抑制表达的新基因。结果　通过SSH技术 ,发现了 15个可能的IL 10抑制表达的基因 ,其中 6个与GenBank中已公布的表达序列检签 (expressedsequencetag ,EST)片段没有明显同源性 ,为新基因 ,其中之一经EST拼接 ,得到全长cDNA ,为一种新的C C家族趋化因子 ,已被GenBank收录 ,收录号码为AF0 96 985。挑选 4个新基因进行Northernblot分析 ,发现IL 10可抑制其中 3个新基因表达。结论　SSH技术是一种高效的差异基因筛选方法 ,IL 10可抑制多种包括新细胞因子基因的表达     

小鼠可溶性CD83对树突状细胞表达共刺激分子和共刺激活性的影响

目的：研究可溶性小鼠CD83（mCD83）对树突状细胞（DC）表达共刺激分子及共刺激活性的影响。方法：克隆mCD83基因，构建mCD83胞外功能区与人IgG1αFc段融合基因的真核表达载体pmCD83-hIg，并在COS-7细胞中表达可溶性mCD83-hIg融合蛋白。采用ELISA、Western blot和RT-PCR技术检测mCD83-hIg融合基因在COS-7细胞中的表达。用mCD83-hIg处理小鼠DC细胞系（DC2．4）采用流式细胞术检测DC细胞周期、细胞凋亡和共刺激分子CD80、CD86的表达影响；采用混合白细胞培养试验，检测mCD83-hIg对DC2．4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的影响。结果：酶切和序列测定鉴定显示构建的真核表达载体完全正确；mCD83-hIg对DC2．4细胞周期和细胞凋亡无影响，但可下调DC2．4表面共刺激分子CD80和CD86的表达；mCD83-hIg处理过的DC2．4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的能力显著下降。结论：mCD83-hIg可抑制DC表达共刺激分子并下调DC共刺激活性，从而抑制同种异基因T细胞增殖和产生细胞因子。     

人趋化素样因子2对小鼠成纤维细胞BALB/c 3T3的促增殖和凋亡抑制作用

目的　探讨人趋化素样因子 2 (CKLF2 )对小鼠成纤维细胞BALB c 3T3增殖和凋亡的影响。方法　构建pcDI CKLF2真核表达载体 ;建立稳定表达人CKLF2的BALB c 3T3(3T3 CKLF2 )细胞系 ;以细胞计数和MTT法分析过表达人CKLF2后对 3T3细胞增殖的影响 ;以流式细胞术检测annexin Ⅴ阳性细胞为凋亡指标 ,分析 3T3 CKLF2细胞和 3T3 pcDI细胞对撤除血清诱导凋亡的反应情况。结果　成功地建立了稳定表达人CKLF2的BALB c 3T3细胞系 ,过量表达人CKLF2的 3T3细胞系增殖速度明显加快 ,同等接种量的细胞培养 40h以后 ,3T3 CKLF2细胞的数量 (1.0 7× 10 6 )比 3T3 pcDI细胞(2 .5 4× 10 5)及野生型 3T3细胞 (3 .0× 10 5)高 2～ 3倍 ;流式细胞术分析表明 ,撤除血清后 3T3 CKLF2的annexin Ⅴ阳性细胞数 (13.34% 48h、15 .44 % 96h)明显低于 3T3 pcDI细胞 (19.36 % 48h、39.2 % 96h)。结论　人CKLF2能够促进BALB c 3T3细胞的增殖和抵抗撤除血清诱导的细胞凋亡 ,这些研究为进一步探讨CKLF家族的生物学功能提供了实验依据。     

大鼠趋化素样因子对成肌细胞促增殖作用的研究

目的 探讨大鼠趋化素样因子1和2（rCKLF1，2）对成肌细胞的增殖促进作用。方法 构建pcDNA3.1/rCKLF1和pcDNA3.1/rCKLF2真核表达载体，并瞬时转染293T细胞，收获培养上清，分别以^3H-TdR掺入和MTT比色法，分析rCKLF1和rCKLF2对小鼠肌母细胞系C2C12和原代肌卫星细胞增殖的促进作用，结果 成功地构建了rCKLF1和rCKLF2的真核表达质粒，并在SV40转化的293T细胞中瞬时表达rCKLF1和rCKLF2，瞬时转染上清能够使C2C12细胞的^3H-TdR的掺入值增加2倍或3倍，MTT比色法分析表明，rCKLF1和rCKLF2的转染上清，对Wistar大鼠乳鼠肌卫星细胞具有增殖促进作用。结论 rCKLF1和rCKLF2能够促进骨骼肌细胞的增殖，为进一步探讨CKLF家族分子在骨骼肌细胞增殖分化中的作用提供了实验依据。     

逆转录病毒介导的小鼠IL-21基因在食管癌细胞中的表达

白细胞介素 2 1(interleukin 2 1,IL 2 1)是 2 0世纪末发现的细胞因子 ,与IL 2、IL 4及IL 15有同源性 ,但与IL 15相比 ,IL 2 1仅表达于活化的外周血CD4 T细胞上 ;IL 2 1受体也仅表达在淋巴组织 ,特别是活化的T细胞、B细胞和NK细胞。IL 2 1能诱导活化的T细胞增殖 ,促进自然杀伤细胞 (naturalkiller,NK)成熟 ,在抗肿瘤免疫应答中起重要作用 ,用鼠源IL 2 1进行的动物实验已显示出有效的抗肿瘤效果。本研究将小鼠IL 2 1基因 ,利用逆转录病毒载体转染人食管癌细胞T .Tn细胞株 ,得到阳性表达的肿瘤细胞克隆 ,用RT PCR、流式细胞…     

小鼠SLC基因真核表达载体的构建及其趋化活性鉴定

目的：克隆小鼠次级淋巴样组织趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine，SLC)基因，并构建真核表达载体。在体内外检测该表达载体表达产物的免疫趋化功能。方法：用RT—PCR从C57BL／6小鼠胸腺组织中克隆小鼠SLC基因，构建真核表达载体pcDNA3．1—msLC。在体外，用基因枪转染小鼠黑色素瘤B16F10细胞；RT—PCR检测转染细胞有SLC的表达；利用趋化小室法，检测表达产物针对淋巴细胞的趋化活性。在体内，用基因枪通过小鼠皮肤局部转染SLC基因，观察转染局部淋巴细胞的浸润。结果：克隆的基因经测序证实，为小鼠SLC基因Scya21b型。转染SLC基因的B16F10细胞体外培养48h后，RT—PCR检测到SLC的表达，同时培养基上清具有针对淋巴细胞的趋化活性。通过基因枪局部转染小鼠皮肤，24h后皮肤病理检查显示，局部皮内有明显的淋巴细胞浸润。结论：从小鼠胸腺组织中克隆到小鼠SLC基因，构建的真核表达载体pcDNA3．1—mSLC在体内外均可以表达，并具有针对淋巴细胞的趋化活性。     

PHA对CIK细胞增殖和免疫表型影响的研究

细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killers，CIK）是人外周血单个核细胞在IL-1、IL-2、抗CD3单克隆抗体（MAbCD3）和IFN-γ刺激下获得的增殖能力、细胞毒作用强的免疫效应细胞。植物血凝素（phytohemaglutinin，PHA）是T细胞的多克隆活化剂。实验采用PHA先刺激外周血单个核细胞24h．再按CIK细胞的传统培养方法继续培养至15d，观察PHA的加入，对CIK细胞增殖和免疫表型有无影响。     

慢病毒介导RNA抑制黑素瘤细胞Foxp3蛋白表达

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术在体外干扰小鼠B16黑素瘤细胞Foxp3基因表达,探讨RNA干扰用于黑素瘤治疗的可行性。方法:针对Foxp3基因设计小干扰RNA(siR-NA),构建起短发夹状RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并转染小鼠B16细胞,在体外诱导RNA干扰。分别采用Westernblot和RT-PCR检测Foxp3基因的表达情况;ELISA检测TGF-β1、TGF-β2和IL-10等细胞因子的变化;将干扰后的小鼠B16细胞与CD4+CD25-T淋巴细胞共培养,CCK8法检测CD4+CD25-T淋巴细胞增殖能力。结果:通过Foxp3 shRNA的转染,可实现对B16细胞Foxp3表达的沉默,可下调肿瘤细胞对CD4+CD25-T淋巴细胞增殖抑制的能力,并且下调TGF-β1、TGF-β2和IL-10等细胞因子的表达,尤其是TGF-β2的表达。结论:RNA干扰可抑制小鼠黑素瘤细胞靶基因Foxp3的表达及细胞增殖,并对CD4+CD25-T淋巴细胞增殖抑制的能力减弱,同时减弱抑制性细胞因子的分泌,为黑素瘤的基因治疗提供了新思路。     

人IL-31的克隆表达及对表皮角化细胞的影响

目的克隆人IL-31基因,构建真核表达载体,研究人IL-31对表皮角化细胞HaCaT的影响及其作用机制。方法PMA、PHA刺激正常人外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,采用RT-PCR克隆人IL-31基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His（-）A,进行PCR和双酶切鉴定,并进行序列测定。将重组质粒转染CHO细胞,用RT-PCR和Western blot分析rhIL-31在CHO细胞中的表达。用Ni^2＋树脂纯化his融合蛋白,用不同剂量rhIL-31刺激HaCaT细胞,利用Transwell穿孔板检测HaCaT细胞培养上清对外周血单个核细胞的趋化作用,荧光定量PCR检测rhIL-31对HaCaT表达趋化因子的影响,Western blot检测STAT3磷酸化。结果成功获得全长人IL-31基因,测序正确,经双酶切、PCR和序列测定鉴定,真核表达质粒构建正确,可在CHO细胞中表达;该目的蛋白刺激人表皮角化细胞HaCaT,细胞培养上清对外周血单个核细胞有趋化作用,HaCaT细胞表达趋化因子MDC、TARC、I-309;细胞STAT3磷酸化增加。结论IL-31作用于正常人表皮角化细胞,细胞培养上清对外周血单个核细胞有趋化作用,HaCaT细胞趋化因子表达增加,细胞STAT3磷酸化增加,提示IL-31可通过STAT3发挥作用。     

小鼠凋亡相关新基因PNAS-4真核表达载体的构建、表达及体外抗肿瘤作用

目的：对小鼠凋亡相关新基因PNAS-4（mPNAS-4）进行克隆，构建其真核表达载体，并在小鼠Lewis肺癌细胞系LL2中转染表达；探讨mPNAS-4基因转染LL2细胞过表达所诱导的体外肿瘤细胞凋亡情况。方法：用RT-PCR从小鼠肝脏组织中克隆mPNAS-4编码区cDNA，构建重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4；用脂质体将pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞；用RT—PCR检测转染细胞中mPNAS-4的过表达情况；通过MTT、流式细胞术（FCM）及DNA Ladder分别检测转染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从小鼠肝脏组织中克隆到mPNAS-4全长cDNA并成功构建其真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4，转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞可使其mRNA表达明显上调。mPNAS-4过表达能抑制LL2细胞增殖并诱导其凋亡。结论：mPNAS-4过表达对小鼠Lewis肺癌LL2细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用。     

小鼠4-1BBL cDNA的克隆和表达及其抗肝癌的免疫作用

目的 :克隆小鼠 4 1BBL基因 ,构建其真核表达载体 ,并观察其在抗肝癌免疫中的作用。方法 :取C5 7BL/6小鼠脾细胞 ,经PHA诱导后 ,以RT PCR克隆 4 1BBLcDNA ,测序 ,构建真核表达质粒 pcDNA3.1( ) m4 1BBL。以重组体转染小鼠肝癌细胞Hepa1 6 ,经G4 18筛选后 ,以RT PCR、间接免疫荧光及流式细胞仪 ,检测m4 1BBL以获得稳定高表达克隆。然后将其制成肿瘤细胞疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养 ,采用MTT比色法测定淋巴细胞的特异性杀伤活性。结果 :从小鼠脾细胞中克隆到m4 1BBLcDNA ,经测序完全正确。所构建的真核表达质粒pcDNA3.1( ) m4 1BBL ,在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中获得稳定高效表达。与野生型Hepa1 6细胞相比较 ,m4 1BBL基因转染的Hepa1 6细胞疫苗能较有效地诱导淋巴细胞产生针对野生型Hepa1 6细胞的特异性杀伤活性 (P <0 .0 1)。结论 :将m4 1BBL基因导入肝癌细胞中表达 ,能提高其免疫原性 ,诱导有效地抗肝癌免疫应答     

人类新细胞因子(CKLF-1)在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：进一步研究人类新细胞因子－－趋化素样因子1（CKLF－1）蛋白的结构与生物学活性。方法：构建了融合蛋白的原核表达质粒，并在大肠杆菌中进行诱导表达，获得了原核表达的融合蛋白，经凝血酶切割获非融合重组蛋白，并进行体外活性鉴定。结果：CKLF－1原核表达蛋白获得了高表达，纯化后获得约90％纯度以上蛋白，发现其可以与肝素结合，生物学活性检测表明其对人中性粒细胞，外周血单个核细胞和大鼠的巨噬细胞具有明显的趋化作用。结论：CKLF－1原核表达蛋白具有与真核表达蛋白类似的生物学活性。     

诱导活化的外周血单个核细胞中LIGHT基因的表达分析及其克隆

目的 分析不同刺激下外周血单个细胞（PBMC）中LIGHT基因的表达,并克隆全长的人LIGHT基因。方法 按常规方法分离正常人的外周血单个核细胞后,培养于含10?S的RPMI1640中,并以不同浓度的LPS、TNFa、IL-2、IFN-γ、PHA及PMA刺激不同的时间,再以PT-PCR法分析PMBC内LIGHT基因转录表达,并克隆相应的全长人LIGHT基因。结果 RT-PCR分析表明：当用LPS和IFN-γ刺激PMBC 24h后,可诱导LIGHT基因的明显表达,而单独应用IL-2、TNFa、PHA和PMA则不能诱导其表达。采用PCR产物克隆方法,克隆了人LIGHT基因,并经DNA序列测定证实。结论 本实验隆得到了人LIGHT基因,为进一步研究LIGHT的功能打下了基础。     

mRNA差异显示法克隆小鼠精子发生相关基因p38MAPK基因

目的：克隆1、2、3、4周龄小鼠睾丸之间差异表达的基因。方法：应用改良的mRNA差异显示技术,对1、2、3、4周龄小鼠睾丸进行基因表达的差异显示分析,并对其中1个从2周龄小鼠中高表达的cDNA片段进行了克隆和测序。结果：所克隆的cDNA片段与小鼠大脑、造血干细胞p38MAPK（p38beta mitogen-activated protein knase,p38MAPK-β）基因的同源性分别为91％和85％.Northern dot blot结果显示该基因在小鼠睾丸和脑组织 中表达最高。结论：小鼠p38MAPK基因基因可能与小鼠精子发生相关。     

AAV2-BF转染小鼠对MLD内毒素攻击的抵抗作用

目的：通过观测BPI700-Fcγ1700嵌和基因导入小鼠，对最小致死量（MLD）内毒素攻击的抵抗作用，探讨抗感染基因治疗在临床感染高苊人群中应用的可能性。方法：采用Dot blot、Western blot、免疫组化、改良ELISA方法和内毒素／细胞因子检测试剂盒，检测目的基因产物在CHO细胞和小鼠骨骼肌细胞中的表达及血清中内毒素和促炎细胞因子含量变化。结果：（1）目的基因产物在CHO细胞和小鼠骨骼肌细胞中成功表达，在AAV2-BF导入组小鼠血清中可检测到目的基因产物；（2）在最小致死量内毒素攻击后，AAV2-BF导入组小鼠血清中内毒素和促炎细胞因子含量显著低于对照组小鼠；其存活率（40％）明显高于对照组小鼠（2．5％）。结论：AAV2-BF导入组小鼠对MLD内毒素攻击具有抵抗作用，提示抗感染基因治疗对临床G-菌败血症及其引发的内毒素中毒性休克具有较好防治作用。     

人RGS1基因克隆表达及其功能分析

目的 克隆并构建人RGS1表达载体,转染U937细胞和树突细胞,进行功能分析.方法 通过RT-PCR方法克隆人RGS1基因,将其连接到peDNA 3.1/V5表达载体.然后以连接的质粒为基础通过报告基因化学发光及ELISA方法对人RGS1基因的进行初步分析.结果 经扩增及序列测定表明pcDNA-RGS1质粒构建成功,在U937细胞和树突细胞中可以表达.RGS1对U937细胞转录因子NF-kB的活性有明显的抑制作用,同时明显上涮树突细胞细胞凶子IL-6的表达.结论 在peDNA-RGS1质粒成功构建基础上,证明了人RGS1基因具有免疫调节功能,为进一步研究其免疫应答中的调节作用奠定了基础.     

关中黑猪IL-5 cDNA的克隆表达与多克隆抗体制备

目的 克隆关中黑猪IL-5 cDNA,构建该基因的不同表达质粒,获得表达的IL-5并制备其多克隆抗体.方法 提取佛波酯(PHA)刺激的关中黑猪外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR克隆猪IL-5基因(sIL-5),鉴定后将sIL-5基因分别克隆到pQE30、pET-32a和pEGFP-N1中,构建重组表达质粒pQE-sIL-5和pET-sIL-5及pEGFP-sIL-5,将pEGFP-sIL-5瞬时转染PK-15细胞,将pQE-sIL-5和pET-sIL-5分别转化JM109和BL21,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot法鉴定表达蛋白后,通过镍柱纯化目的蛋白.用纯化的BL21表达的IL-5免疫小鼠,制备其多克隆抗体,用纯化的JM109表达的IL-5通过优化的间接ELISA检测抗体效价.结果 成功获得关中黑猪的IL-5基因(登录号KC660157),大小405 bp,与GenBank中猪IL-5参考序列同源性99.75％,仅25位的T变成C,但编码的氨基酸完全相同;荧光显微镜观察发现pEGFP-sIL-5 在PK-15细胞中得到表达;SDS-PAGE结果显示JM109表达的目的蛋白的相对分子质量(M,)约15 000,而BL21表达的目的蛋白Mr约30 000,Western blot法检测结果表明,表达的目的蛋白均具有良好的反应原性;免疫小鼠后获得了IL-5的多克隆抗体,抗体效价最高可达1∶12 800.结论 克隆了关中黑猪IL-5基因片段并成功表达,获得了IL-5的多克隆抗体.     

RelB shRNA慢病毒感染小鼠骨髓树突状细胞的免疫学效应

背景：沉默树突状细胞发育成熟的关键基因核因子кB/RelB可构建新型致耐受树突状细胞？ 目的：探讨RelB shRNA转染小鼠骨髓树突细胞的生物免疫学功能的影响。 方法：利用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组白细胞介素4联合诱导小鼠骨髓树突状细胞;慢病毒载体将RelB shRNA转染致小鼠骨髓树突细胞后,分为未成熟树突状细胞、脂多糖刺激成熟、RelB基因沉默及脂多糖刺激RelB沉默的4组树突状细胞进行观察。 结果：体外培养第 6 天脂多糖刺激组细胞表面可见大量细长的类似树枝的突起,其他3组细胞形态特征相似,呈圆形、皱缩状态,这3组细胞表面MHC-II类分子、CD86和CD40分子表达水平相当,但低于脂多糖刺激组;3组混合淋巴细胞反应中刺激T细胞增殖能力差异无显著性意义(P > 0.05),但均较脂多糖刺激组显著降低(P < 0.01);RelB基因沉默的树突状细胞分泌Th1细胞因子γ-干扰素和白细胞介素2的能力较低,分泌Th2白细胞介素10和白细胞介素4的能力较高(P < 0.01),Th1/Th2细胞因子的比例与未成熟树突状细胞类似。说明RelB shRNA经慢病毒转染骨髓源性树突状细胞后,在细胞形态、表面分子表达、免疫学功能等方面均具有与未成熟树突状细胞相似的特点,且不能被脂多糖刺激成熟。