基于图像分析的周围神经Karnovsky-Roots法染色规律的效果观察

目的　基于图像分析探讨用于鉴别周围神经功能束的乙酰胆碱酯酶（AChE）染色Karnovsky-Roots法24小时内的染色规律,为基于乙酰胆碱酯酶染色的周围神经功能束三维重建确定标准化的孵育条件。 方法　新鲜人体截肢腓总神经标本,连续横断冰冻切片,片厚10 μm,共切取56 张,随机分为7组,每组8张切片,采用Karnovsky-Roots法进行乙酰胆碱酯酶孵育,其中1～6 组分别为1、2、4、8、12和24 h,第7组切片为阴性对照组。采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件对不同时间染色组图像进行图像分析,指标为：(1) AChE 反应阳性区域的面积;(2) AChE 反应阳性区域的平均光密度;(3) 　AChE 反应阳性区域的累积光密度。组间结果采用SPSS13.0进行t-test 统计检验,以P<0.05为有统计学差异。 结果　8h 组的平均光密度值与12 h组有显著性差异,而12 h 与24 h 的平均光密度值无显著性差异;8 h、12 h 和24 h 间的染色面积、累计光密度值均存在显著性差异,但镜下可观察到24 h组存在过度染色。 结论　孵育12～24 h间的染色效果趋于一致,染色结果稳定可靠,神经束功能性质鉴别容易,神经束膜与染色的神经纤维间有清晰的分界,利于轮廓获取,可作为基于乙酰胆碱酯酶染色的周围神经功能束三维重建的标准化的育条件。     

坐骨神经局部缺血后相关神经元胞体乙酰胆碱酯酶变化的定量分析

目的:探讨周围神经局部缺血后相关神经元胞体乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase,AchE)含量的变化。方法:采用结扎髂总动脉的方法,造成一侧坐骨神经局部缺血,术后大鼠分别存活8d和14d,取腰髓第5节段和双侧第5腰背根节。Leica振荡切片机连续切片,Karnovsky-Root直接显示AchE的方法使细胞呈色,采用MiVnt图像分析系统对AchE阳性细胞数和平均灰度值进行定量分析。结果:缺血8d组实验侧背根节和脊髓前角AchE阳性细胞数显著低于对照侧、平均灰度值显著高于对照侧;缺血14d组此变化较缺血8d组更为明显。结论:周围神经局部缺血可导致相关神经元胞体AchE含量明显降低。     

特异识别人脑乙酰胆碱酯酶抗原表位的单克隆抗体1F9

目的 :为了进一步研究乙酰胆碱酯酶的功能和结构以及精确地确定抗体对位与抗原表位的关系 ,我们采用单克隆抗体对人脑AChE的肽库进行筛选 ,希望能找到一对一的表位对位关系。方法 :采用MGeyson的方法化学合成人脑乙酰胆碱酯酶的十肽肽库 ,十肽N端生物素化后用于ELISA检测。结果 :我们用鼠抗电鳐乙酰胆碱酯酶的单抗 1F9筛选人脑乙酰胆碱酯酶的十肽肽库 ,得到 1个抗原表位 111。结论 :抗原表位 111可以被兔抗人脑AChE的多抗和鼠抗电鳐乙酰胆碱酯酶的单抗 1F9识别 ,表明此表位序列在人脑AChE和电鳐AChE中是高度保守的。     

大鼠黑质的衰老变化——Ⅱ.乙酰胆碱酯酶活性药物组织化学法和图像分析系统定量研究

本研究用药物组织化学方法,对6只老年大鼠和5只成年大鼠黑质神经元的乙酰胆碱酯酶(AChE)活性进行了对比研究,并用图像分析仪对黑质 AChE 阳性神经元数目、胞体 AChE 活性及细胞面积进行了定量和比较。本文的结果表明,老年大鼠黑质 AChE 阳性细胞数量非常显著减少,细胞重新合成 AChE 的速率和量都显著减低、灰度值增高,AChE 细胞胞体的面积也随年龄缩小。本文在动物或人脑细胞衰老变化的研究中,增添了新的资料。老年时黑质神经细胞明显变性,必定使纹状体多巴胺(DA)能和胆碱(ACh)能系统之间平衡失常,致使老年的运动功能协调出现障碍。     

运用辣根过氧化物酶和乙酰胆碱酯酶双标记法对家兔腰、骶、尾髓脊髓小脑束乙酰胆碱酯酶阳性神经元的研究

本研究采用10只家兔进行腰、骶、尾髓的脊髓小脑束乙酰胆碱酯酶阳性神经元定位研究。其中8只在小脑内注射HRP后,按Mesulam组化法追踪腰、骶、尾髓各节段的HRP-AChE双标及HRP单标神经元;作为对照,2只家兔同样节段的脊髓切片则单纯显示神经元的AChE活性。实验结果表明,家兔腰、骶、尾髓的各群脊髓小脑束神经元中,大多数细胞均为乙酰胆碱酯酶阳性神经元,但它们所含AChE的量可能有所不同。各群细胞中乙酰胆碱酯酶阳性神经元所占数量的多少可能与脊髓小脑束神经元的不同功能有关。     

组织化学法对人周围神经内神经束定性和定位的研究

周围神经显微外科技术的应用,对神经束性质的鉴别提出了更高的要求。作者用Karnovsky乙酰胆碱酯酶(AChE)组织化学方法,对成人上肢主要神经干及其分支和部分下肢神经肌支和皮支、脊神经前后根及灰交通支内AChE分布,进行了全面的观察。材料均从死亡后三小时内的成人尸体上获得,按神经在体内的自然位置,以印度墨汁在神经外膜上标记方位。取材后,用6％的中性甲醛固定1h,磷酸缓冲液冲洗,明胶包埋(45°～50℃、1h)。冷凝后冰冻切片(15～20μm)。贴片后入Karnovsky标准孵育液内孵育(4℃,20h)。孵育对照:1.不加     

内毒素对红细胞乙酰胆碱酯酶（AchE）活性作用的探讨

大鼠的红细胞在体外经内毒素处理后,其膜乙酰胆碱酯酶(AchE)的活性显著降低,并发现血浆的存在可进一步加强内毒素降低AchE活性的作用。给大鼠体内注射内毒素同样可以降低AchE的活性。另外,内毒素还可降低狗红细胞膜上AchE的活性,但它对人红细胞膜上AchE影响甚微。凝胶电泳分析结果表明,不同种属的动物,其红细胞膜蛋白图谱不同,推测内毒素影响酶活性很可能与膜蛋白的差异有关。     

胆碱酯酶及乙酰胆碱的组化显示法

<正> 胆碱酯酶(Cholinesterase ChE)大致分成两类:一类为假胆碱酯酶(或丁酰胆碱酯酶BuChE);另一类为乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase AChE)。二者存在部位不完全相同,BuChE在哺乳动物含量甚微,主要分布於非神经组织、血浆等处,AChE主要位于胆碱能神经的胞体、轴突、神经末梢、骨骼肌、红细胞等处,通常可用AChE染色显示胆碱能神经。AChE染色分光镜和电镜两种,现分述如下:     

家兔坐骨神经损伤后肌肉组织乙酰胆碱酯酶的变化

目的 :探讨坐骨神经损伤后不同时间点家兔小腿肌肉组织乙酰胆碱酯酶 (AChE)的变化。方法 :建立家兔坐骨神经损伤的动物模型 ,制备特异识别神经系统AChE的单克隆抗体 ,以该抗体作为一抗 ,酶标羊抗兔IgG作为二抗建立酶联免疫检测方法 ;测定正常对照组、坐骨神经神经损伤后 0 .5h、3h、12h组 ,坐骨神经断点、胫神经及腓总神经所支配的肌肉组织AChE的含量。结果 :坐骨神经损伤 0 .5h后 ,断点处AChE含量最高 ,波长 492nm之OD值为 ( 0 .64 0± 0 .0 68) ,随时间延长逐渐降低 ;胫神经、腓总神经支配的肌肉组织中AChE含量 0 .5h时最低 ,波长 492nm之OD值分别为 ( 0 .2 13± 0 .0 72 )、( 0 .2 0 3±0 .0 60 ) ,3h最高 ,12h时降低。结论 :坐骨神经损伤后 ,断点及其远端神经支配的肌肉组织中AChE的变化呈时间依赖性 ,但变化不一。     

大鼠周围神经损伤后肌肉组织乙酰胆碱酯酶的变化

目的：探讨周围神经损伤后，在不同时间点受神经支配的肌肉组织中乙酰胆碱酯酶(AChE)的变化。方法：建立大鼠外周神经损伤的动物模型；制备特异识别神经系统AChE的单克隆抗体，以该抗体作为一抗，酶标羊抗鼠IgG作为二抗建立酶联免疫检测方法；测定正常对照组、坐骨神经神经损伤后0．5h、3h、12h组，坐骨神经断点处、胚神经及腓总神经所支配的肌肉组织AChE的含量变化。结果：坐骨神经损伤0．5h后，断点处肌肉组织中AChE含量最高，随时间延长逐渐降低；胫神经、腓总神经支配的肌肉组织中AChE含量0．5h时最低，3h最高，12h时降低。结论：坐骨神经损伤后，断点处及其远端神经支配的肌肉组织中AChE的变化呈时间依赖性，但变化不一。     

小白鼠死后脾组织RNA降解程度与死亡时间关系的研究

目的探讨小白鼠死后脾组织GAPDH mRNA和β-actin mRNA降解情况与死亡时间（PMI）的关系。方法 48只NIH小白鼠安乐死处死,分别置于10℃和25℃温控系统内,利用两步法RT-PCR技术和核酸蛋白测定仪定量cDNA方法检测小白鼠脾GAPDH mRNA和β-actin mRNA在死后即刻至72h降解情况。结果在10℃温控系统内的小白鼠死后即刻至72h脾组织均可检测到GAPDH mRNA和β-actin mRNA,且其扩增产物呈规律性下降趋势。25℃温控系统内的小白鼠死后即刻至48h脾组织均可检测到GAPDH mRNA和β-actin mRNA,且其扩增产物呈规律性下降趋势。结论小白鼠死亡后脾GAPDH mRNA和β-actin mRNA降解与PMI负相关,可为PMI推断提供一种新的观测指标。     

Inhibition of acetylcholinesterase accelerates axon terminal withdrawal at the developing rat neuromuscular junction

Summary In developing skeletal muscles, the rate at which superfluous innervation is lost from the endplates depends on the general level of neuromuscular activity. Whether it is activity of the presynaptic or postsynaptic structures (or both) that is critical is not well established. In this work, we transitorily inhibited the AChE of soleus muscle in postnatal rats, in order to increase postsynaptic activity, without directly altering activity of the nerve terminals. We then followed the time course of disappearance of axon terminals from the endplates of treated and normal muscles, using electron-microscope techniques. Three hours after inhibition of AChE, the muscle fibres exhibited local supercontracture and ultrastructural damage in the region of the endplate, consistent with local elevation of Ca²⁺ levels. At the same time, small electron-opaque vesicles, apparently of muscular origin, appeared in the synaptic cleft. The nerve terminals, however, were entirely normal in number and appearance. One day after treatment, endplates of esteraseinhibited muscles showed accelerated loss of nerve terminals, compared to endplates of normally developing muscles. No further loss of nerve terminals occurred, once AChE activity returned at the endplate. These results suggest that the rate at which superfluous nerve terminals retract from the developing neuromuscular junction is regulated by the level of activation of the muscle. It seems likely that activity of postsynaptic sites may similarly regulate changes in innervation patterns, in other developing or adapting neuro-neuronal or neuro-effector systems.     

兔不同死因死后脑组织CT影像学变化的时间规律性研究

目的研究兔不同死因死后129h内脑组织CT影像学的变化规律与死亡时间的关系。方法分别采用机械性窒息、失血性休克和空气栓塞法,建立家兔死亡模型;在不同死后间隔时间对家兔进行颅脑薄层螺旋CT扫描,结合专业的计算机图像分析技术,监测脑组织面积/颅腔面积比、脑组织平均CT值、颅腔整体平均CT值等参数变化,并作统计学分析。结果脑组织平均CT值随着死亡时间的延长,呈先升高后降低。死后27h内,脑组织面积/颅腔面积比基本无变化;死后33h,脑组织面积/颅腔面积比、颅腔整体平均CT值随着死后间隔时间延长逐渐下降。建立了体现各项参数变化趋势的二项式回归方程(p0.001),具有显著的统计学意义。结论采用现代放射CT影像技术获得的不同死因死后颅脑组织的多参数的非线性回归方程,为法医学推断死亡时间提供了客观、准确的方法和参考依据。     

利多卡因对兔骨骼肌缺血-再灌注损伤骨骼肌存活率及超微结构的影响

目的研究利多卡因全身用药对家兔骨骼肌缺血-再灌注损伤骨骼肌存活率及超微结果的影响。方法雄性新西兰兔12只,体重2.5~3kg,随机分为4组,分别记为A1、A2、B1、B2,每组3只。兔右下肢股三角区脱毛,手术显露股血管,切断股神经,无损伤血管夹阻断股动、静脉血流,右大腿中部用止血带捆扎,缺血3小时后松开血管夹和止血带,再灌注3小时。A1组和A2组兔于缺血前5分钟先经耳缘静脉分别推注利多卡因(2mg/Kg)和等体积的生理盐水,后分别持续经耳缘静脉滴注利多卡因(5ug/Kg/min)和等体积的生理盐水;B1组和B2组兔于再灌注前5分钟按照上述方法给药,在缺血0、3小时,再灌注3小时时分别取胫骨前肌、小腿三头肌,MTT法检测肌肉坏死率,取胫骨前肌透射电镜下观察不同时间的肌细胞超微结构的变化。结果与缺血前给予生理盐水组比较,缺血前给予利多卡因能够显著增加兔骨骼肌缺血3小时和再灌3小时时的存活率;与再灌注前给予生理盐水组比较,再灌注前给予利多卡因能够显著增加兔骨骼肌再灌注3小时时的存活率;缺血前给予利多卡因与再灌注前给予利多卡因均能显著增加兔骨骼肌再灌注3小时时的存活率,但是两种给药方式对骨骼肌存活率的影响无显著性差异。结论缺血前给予利多卡因能够显著改善兔的缺血和再灌注损伤,而再灌注前给予利多卡因能够显著改善兔的再灌注损伤。虽然缺血前给予利多卡因与再灌注前给予利多卡因均能改善兔的再灌注损伤,但是这两种给药放式改善骨骼肌再灌注损伤的效果无显著性差异。     

靶肌肉注射促红细胞生成素对大鼠周围神经再生的作用

目的探讨靶肌肉注射人重组促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin，rh-EP0）对大鼠坐骨神经损伤后神经再生的作用。方法选用健康雄性SD大鼠12只，制备大鼠右侧坐骨神经钳夹损伤模型。实验动物随机分为2组，每组6只，EPO组：靶肌肉注射rh-EPO2500U／kg；对照组：注射同体积的生理盐水。术后第7d、14d、21d观察坐骨神经功能指数（SFI），第21d组织学观察脊髓腰膨大（L4～L6）、夹伤远端坐骨神经、损伤侧腓肠肌组织并作图象分析测定脊髓前角运动神经元数、再生有髓神经纤维数、髓鞘厚度、轴突直径和腓肠肌肌细胞横截面积等指标。结果术后第7d两组SFI无显著性差异，术后第14d、21dEPO组SFI恢复程度明显大于对照组，差别有显著性意义（P〈0．05）；术后第21d损伤侧脊髓前角运动神经元数、再生有髓神经纤维数、髓鞘厚度、轴突直径和腓肠肌肌细胞横截面积等指标，EPO组均优于对照组（P〈0．01，P〈0．05）。结论靶肌肉注射rh-EPO能促进周围神经再生和功能恢复。     

复合肌肉动作电位与周围神经损伤程度的相关性研究

目的:分析45例腓总神经不全损伤患者复合肌肉动作电位（CMAP）的波幅、时程,探讨其与周围神经损伤程度的关系。方法 :选择2012年1月至2012年12月就诊于我院的45例不同程度腓总神经不全损伤患者,根据患者胫前肌肌力级别将45例患者分为三组（n=15）:胫前肌肌力4-5级（P₁组）、胫前肌肌力2-3级（P₂组）、胫前肌肌力1级（P₃组）。应用肌电诱发电位仪记录45例患者的CMAP波形,测量CMAP波幅与时程。采用SPSS13.0统计软件对数据进行秩和检验,分析各组间CMAP波幅与时程的差别。结果 :（1）P₁组、P₂组和P₃组腓总神经-胫前肌CMAP平均波幅分别为7.1±0.2mv、3.3±0.3mv和0.5±0.1mv;P₂组、P₃组与P₁组相比,波幅均有显著性差异（P<0.05）;P₃组与P₂组相比,波幅亦有显著性差异（P<0.05）。（2）P₁组、P₂组和P₃组腓总神经-胫前肌CMAP平均时程分别为11.4±0.4ms、16.9±0.6ms和23.3±1.2ms;P₂组、P₃组与P₁组相比,时程均有显著性差异（P<0.05）;P₃组与P₂组相比,时程亦有显著性差异（P<0.05）。结论 :（1）CMAP波幅、时程有助于评价周围神经受损的严重程度。（2）CMAP波幅降低提示有功能的周围神经轴突数量减少,时程延长反映了周围神经的脱髓鞘损害。     

2型糖尿病大鼠骨骼肌Toll样受体4的表达及辛伐他汀的干预作用

目的 探讨2型糖尿病大鼠骨骼肌组织Toll样受体4（TLR4）的表达及辛伐他汀的干预作用.方法 以高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素喂养SD大鼠制备2型糖尿病大鼠模型（26只）,随机分为糖尿病组（n=13）和辛伐他汀干预组（n=13）,正常SD大鼠（n=10）作为对照组.辛伐他汀干预组给予辛伐他汀20 mg·kg^-1·d^-1灌胃,糖尿病组和对照组均给予等体积生理盐水灌胃.8周后检测各组大鼠血糖、血脂、肌酸激酶水平;光镜观察骨骼肌组织学改变;免疫组织化学检测骨骼肌TLR4蛋白的表达;RT-PCR法检测骨骼肌TLR4 mRNA的表达.结果 糖尿病组和辛伐他汀干预组空腹血糖较对照组明显升高[（12.04±2.04） mmol/L、（11.23±2.61） mmol/L比（5.92± 1.28） mmol/L,均P＜0.05],糖尿病组和辛伐他汀干预组两组之间空腹血糖水平差异无统计学意义.3组总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平糖尿病组＞辛伐他汀干预组＞对照组（均P＜0.05）;高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平对照组＞辛伐他汀干预组＞糖尿病组（均P＜0.05）.3组肌酸激酶之间差异无统计学意义.对照组大鼠骨骼肌肌膜完整、清晰,肌纤维排列紧密;糖尿病组大鼠部分肌纤维萎缩、变性、水肿,肌纤维断裂,肌丝走行紊乱,并可见炎性细胞浸润;辛伐他汀干预组大鼠病理改变较糖尿病组减轻.糖尿病组TLR4蛋白表达水平是对照组的1.54倍[0.318±0.037比0.206±0.024,P＜0.05],辛伐他汀干预组TLR4蛋白表达水平0.256±0.035,是糖尿病组的80.50％ （P＜ 0.05）.糖尿病组TLR4 mRNA水平是对照组的1.62倍[0.625±0.074比0.385±0.088,P＜0.05],辛伐他汀干预组TLR4 mRNA水平0.501±0.105,是糖尿病组的80.16％（P＜ 0.05）.结论 糖尿病性骨骼肌病变与TLR4高表达相关,辛伐他汀可能通过降低骨骼肌TLR4的表达从而减轻骨骼肌病变.     

低压性低氧暴露后大鼠骨骼肌过氧化物酶增殖激活受体-δ基因表达上调

目的探讨低压性低氧暴露对大鼠骨骼肌过氧化物酶增殖激活受体8（PPAR-δ）基因表达的影响。方法40只SD大鼠随机均分为平原组（H0组）、缺氧1d组（H1组）和缺氧15d组（H15组）。将缺氧组大鼠置于模拟海拔5，000m低压氧舱内，每天23h。平原组大鼠在平原动物房内饲养。分别于缺氧1d和15d后取双后肢腓肠肌，观察腓肠肌毛细血管密度的变化，用同位素标记法测定脂肪酸氧化率，化学比色法测定非酯化脂肪酸（NEFA）含量，RT-PCR法检测骨骼肌中PPAR-δ以及脂肪酸易位蛋白（FAT／CD36）mRNA表达的变化，并与HO组对照。结果①缺氧暴露15d后骨骼肌毛细血管密度增加。②骨骼肌NEFA含量缺氧组显著高于平原对照组（P均〈0．05），H1显著低于H15（P〈0．05）。骨骼肌脂肪酸氧化率H15显著高于H0和H1（P均〈0．05），H0与H10之间无显著性差异。③骨骼肌H1组PPAR-δ mRNA表达水平较H0和H15组分别下调39．4％和30．0％（均P〈0．05），H0和H15组间无显著性差异。H15组CD36 mRNA表达水平较Ⅲ组上调12．2％（P〈0．05），H0和H15组间以及H0和H1组间无显著性差异。结论慢性高原暴露时骨骼肌PPAR-δ mRNA表达上调，这可能是慢性高原暴露时脂肪酸氧化利用增强及骨骼肌毛细血管密度增加原因之一。