移植神经元与受者神经系统功能整合研究进展

神经干细胞（neural stem cell，NSC）具有自我增殖和分化的生物学特性，为神经损伤和退行性疾病的治疗带来了新的曙光。尽管成年脑内依然存在NSC，但在损伤后完全依靠其自身的增殖分化尚不足以修复损伤的神经系统。通过移植NSC替代因疾病或损伤而丢失的神经细胞，进而修复神经系统的功能引起了神经科学家的极大兴趣。     

神经干细胞的研究进展及应用前景

传统观点认为哺乳动物中枢神经系统的再生仅限于胚胎时期和出生后早期，这意味着成年动物脑和脊髓内的神经细胞只能逐渐减少而不能被更新或替代。然而，中枢神经系统再生现象及具有增殖能力的神经干细胞（Naural stem cell,NSC)的发现向这一理论提出了挑战。神经干细胞具有较强的增殖能力，并能分化为神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞，因此可用来修复损伤的神经系统。近几年来，移植神经干细胞治疗帕金森病、亨廷顿病、脊髓损伤、缺血性中风、老年性痴呆等神经系统疾病成为医学界的研究热点之一，并取得了一定进展。     

神经干细胞治疗脑创伤的研究进展

内源性神经干细胞通过迁移,激活的方式分化为神经元及胶质细胞,并改善神经功能,但创伤导致的复杂的微环境使内源性神经干细胞的增殖和分化受到限制。外源性神经干细胞可在宿主内存活并通过旁分泌功能改善局部微环境,促进内源性神经干细胞的增殖和分化,恢复神经元之间的连接功能,从而促进神经组织再生和功能修复。     

神经干细胞定向分化的信号调控

研究证实成年哺乳动物的神经组织中可以分离出神经干细胞。干细胞能不断分裂增殖 ,并可进一步分化成神经元和胶质细胞。对神经干细胞的最新研究提示了神经系统疾病未来的治疗方向 ,即通过神经干细胞移植替代死亡的神经细胞而达到功能修复。目前在神经干细胞移植中要解决的关键问题是如何诱导干细胞向一定方向分化 ,从而实现“移植”真正所需要的细胞的目的。本文就神经干细胞定向分化的信号调控和其应用前景进行综述     

骨髓基质细胞移植治疗缺血性脑损伤的机制研究进展

骨髓基质细胞具有高度的增殖能力和神经分化潜能,可用于治疗缺血性脑损伤,其作用机制可能是通过增殖、分化替代受损神经细胞并整合到原有的神经网络当中,分泌生长因子和神经营养因子促进内源性神经干细胞的增殖与分化、促进血管发生、增强轴突可塑性、减少神经细胞凋亡等,以促进神经功能恢复.     

内源性NSCs在神经损伤中的激活及迁移机制

神经干细胞是一种具有自我更新能力的多潜能分化细胞,在神经损伤后,脑室下区和海马齿回颗粒下层的神经干细胞能够增殖,在细胞因子和其他蛋白质的作用下,增殖的干细胞可能会靶向性迁移到损伤区,分化成神经元或神经胶质细胞修复和替代坏死或凋亡的神经元。在迁移过程中,炎症因子、生长因子、趋化因子等通过一系列信号转导途径引导干细胞的迁移,但迁移的因子之间、因子与细胞之间关系网络复杂,受多种因子综合作用的影响,因此目前对内源性神经干细胞的靶向性迁移机制尚不清楚。     

重组腺相关病毒对大鼠神经干细胞的体外转染及其对细胞生长的影响

目的 研究重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体对原代培养的神经干细胞（neural stemcells，Nsc）的体外转染及其对细胞增殖、分化和迁移能力的影响。方法 取新生24h内的Wistar大鼠的海马进行神经干细胞原代培养，用不同滴度的rAAV为载体，以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因作为报告基因进行体外转染NSC，通过观察有绿色荧光的NSC的数量，测定rAAV对NSC的体外转染情况；用MTT法测定不同病毒滴度下rAAV对NSC增殖能力的影响，用免疫组化法鉴定NSC、神经元及神经胶质细胞，并在倒置荧光显微镜下直接测定细胞的迁移距离。结果 rAAV对NSC的体外转染效率随着病毒滴度的增加而提高，在转染后的第11天表达水平最高，用MOI为10^4、10^5、10^6的rAAV转染后第11天的转导率分别是9．81％、56．30％、64．67％；不同滴度rAAV转染NSC后不同时间点的MTT测定A值随着病毒滴度的增加而明显减小，差异均有统计学意义；但不同滴度rAAV转染NSC，其分化为神经元和神经胶质细胞的比率以及迁移的距离未见差异。结论 较高滴度（MOI为10^5和10^6）的rAAV可以在体外有效地转染神经干细胞，且不影响神经干细胞的分化和迁移能力，但对其增殖能力有明显抑制，并表现为病毒滴度依赖性。     

神经干细胞移植修复大鼠脊髓半切伤的研究

目的：观察神经干细胞移植修复脊髓半切伤的疗效并探讨移植最佳时机。方法：制备大鼠T13-L1脊髓半切伤模型，取胎龄13、5d胎鼠大脑组织，体外分离、培养、诱导神经干细胞，并采用免疫细胞化学技术分别检测NSC（neural stemcell）特征性标志Nestin（巢蛋白）表达和用血清诱导分化为大量神经元NSE（neuron specific enolas）和神经胶质细胞GFAP（glial fibrillary acidic protein）表达。用明胶海绵吸附BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶）标记好的神经干细胞悬液移植到脊髓半横断处，移植时间选择损伤后立即移植、损伤后第9、14d。观察移植后的大鼠行为的变化，通过CBS（combine behavioral score）评分和爬网格实验评价大鼠的运动功能恢复情况，并进行免疫组化鉴定，光学显微镜观察移植神经干细胞的存活和迁移。结果：在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈Nestin阳性的神经球；用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。与对照组相比，神经干细胞移植组明显修复了损伤结构，改善了下肢的功能，尤其是第9d移植组。结论：神经干细胞移植促进了脊髓损伤后神经结构和功能的恢复，是治疗脊髓半切伤一种有效方案，考虑综合因素移植干细胞的最佳时机应选损伤后9d左右。     

神经干细胞增殖分化的影响因素、调控机制与应用

神经干细胞可持续增殖并具有分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,为治疗中枢神经系统退行性疾病和损伤打下基础,综述了NSC增殖分化的影响因素、调控机制及其临床应用前景。     

内源性成体神经干细胞神经发生机制的研究进展

内源性成体神经干细胞的神经发生与大脑正常生理功能以及很多神经退行性疾病息息相关。神经发生受细胞外微环境和胞内信号等因素影响。近几年,已逐步发现了一些具体的影响成体神经干细胞神经发生,包括增殖、分化、成熟、迁移以及与宿主功能整合等方面的信号通路。本文将从细胞外和细胞内两方面总结影响神经分化的信号及其分子机制,包括相关信号通路、神经营养因子、神经递质以及胞内转录因子和表观遗传调控等,为通过内源性神经干细胞途径治疗中枢神经系统疾病提供基础理论支持。     

ERK信号转导通路对新生大鼠海马神经干细胞增殖的影响

目的 探讨细胞外信号调解激酶(ERK)信号转导通路在新生大鼠海马神经干细胞增殖中的作用.方法 体外培养新生大鼠海马神经干细胞,传至第4代后进行单细胞克降培养并传代.将培养细胞分为2组,对照组采用神经干细胞培养液进行培养,实验组中在神经干细胞培养液的基础上添加不同浓度的ERK通路抑制剂U0126,Western Blot...     

小鼠胚胎皮质、海马来源的神经干细胞在体外增殖特性的比较研究

目的探讨皮质、海马来源的神经干细胞增殖特性的异同,为神经干细胞基础和临床研究在取材部位上提供参考资料。方法无菌条件下分别分离E11-15天小鼠胚脑皮质和海马,经胰酶消化及机械吹打制成单细胞悬液后,在含B27和bFGF的DMEM/F1224孔板中培养扩增,倒置显微镜观察比较生长状况,免疫细胞化学染色技术鉴定神经干细胞,采用BrdU掺入法检测不同部位来源NSCs的增殖情况。结果小鼠胚胎脑皮质与海马均存在神经干细胞,皮质部位神经干细胞比海马部位神经干细胞更易培养,也更易成球,前者神经球数目、BrdU阳性细胞率也明显高于后者。结论同样条件下皮质神经干细胞比海马神经干细胞更易培养和增殖。     

新生ROSA β geo26小鼠海马神经干细胞移植入成年大鼠脑内的存活与分化

目的评价转染报告基因LacZ的ROSA β geo26小鼠能否作为神经干细胞(NSCs)移植的细胞来源。方法应用X-Gal结合免疫组化双标染色研究该品系小鼠NSCs植入成年大鼠纹状体内β-gal的表达。结果移植2周后在大鼠纹状体内可见表达β-gal阳性细胞,部分移植细胞向嘴侧迁移至宿主基底前脑,并分化为成熟神经元,但未观察到表达β-gal的星形胶质细胞。结论LacZ的ROSA β geo26小鼠海马的NSCs移植后能稳定表达β-gal,可作为神经干细胞移植的细胞来源。     

促红细胞生成素促进体外鼠胚脑皮质神经干细胞增殖

目的检测体外培养SD大鼠胚脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的生物学特性,为NSCs研究提供适宜的细胞模型;探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对NSCs增殖的影响,为NSCs的相关研究提供实验依据。方法本研究对孕14d(E14)SD大鼠取鼠胚脑皮质悬浮培养、贴壁诱导分化。采用光电镜观察,以nestin免疫荧光染色鉴定NSCs,微管相关蛋白2(microtubule associated protein2,MAP2)和神经胶质原纤维酸性蛋白(glia fibrillary acid protein,GFAP)检测NSCs分化。取第三代(P3)NSCs向悬浮培养基中添加不同剂量的EPO,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测法检测NSCs的增殖情况。结果分离E14dSD大鼠胚脑皮质,在添加B27、bFGF、EGF的无血清培养基中培养,可形成大量悬浮的神经球并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈Nestin阳性、BrdU阳性。在添加10%胎牛血清的培养基中,神经干细胞可自然分化为神经元和神经胶质细胞。与对照组对比,加入≥5U/mlEPO后MTT检测NSCsOD值明显增高。结论 SD大鼠胚脑皮质体外培养可得到大量增殖的神经干细胞并能分化为神经元和神经胶质细胞,EPO可促进体外NSCs的增殖。     

MPP+诱导的PC12细胞和星形胶质细胞共育对神经干细胞突触素和生长相关蛋白-43表达的影响

目的探讨星形胶质细胞和1-甲基-4苯基-吡啶离子(MPP+)诱导的PC12细胞共育对神经干细胞(NSC)突触素和生长相关蛋白-43表达的影响。方法 PC12细胞分别经MPP+诱导不同时间点(0h、24h、48h、72h、96h)后分为两部分,一部分应用流式细胞技术检测PC12细胞凋亡率;另一部分与星形胶质细胞共育2d,然后收集各组细胞条件培养液,对神经干细胞进行诱导分化,免疫荧光检测神经干细胞突触素(SYN)和生长相关蛋白-43(GAP-43)表达。结果在MPP+作用48h时间点,PC12细胞凋亡率达高峰(P0.05)。MPP+与PC12细胞和星形胶质细胞条件培养液共育48h可上调神经干细胞中突触素(A值=34.09±2.69)和GAP-43(A值=49.36±5.98)表达水平(P0.05)。结论星形胶质细胞与MPP+诱导凋亡的PC12细胞共育后,促进神经干细胞突触素和GAP-43表达。     

Transplantation of neural stem cells: cellular & gene therapy for hypoxic-ischemic brain injury

We have tracked the response of host and transplanted neural progenitors or stem cells to hypoxic-ischemic (HI) brain injury, and explored the therapeutic potential of neural stem cells (NSCs) injected into mice brains subjected to focal HI injury. Such cells may integrace appropriately into the degenerating central nervous system (CNS), and showed robust engraftment and foreign gene expression within the region of HI inury. They appeared to have migrated preferentially to the site of ischemia, experienced limited proliferation, and differentiated into neural cells lost to injury, trying to repopulate the damaged brain area. The transplantation of exogenous NSCs may, in fact, augment a natural self-repair process in which the damaged CNS "attempts" to mobilize its own pool of stem cells. Providing additional NSCs and trophic factors may optimize this response. Therefore, NSCs may provide a novel approach to reconstituting brains damaged by HI brain injury. Preliminary data in animal models of stroke lends support to these hypotheses.     

Treatment of a mouse model of spinal cord injury by transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived long-term self-renewing neuroepithelial-like stem cells

Because of their ability to self-renew, to differentiate into multiple lineages, and to migrate toward a damaged site, neural stem cells (NSCs), which can be derived from various sources such as fetal tissues and embryonic stem cells, are currently considered to be promising components of cell replacement strategies aimed at treating injuries of the central nervous system, including the spinal cord. Despite their efficiency in promoting functional recovery, these NSCs are not homogeneous and possess variable characteristics depending on their derivation protocols. The advent of induced pluripotent stem (iPS) cells has provided new prospects for regenerative medicine. We used a recently developed robust and stable protocol for the generation of long-term, self-renewing, neuroepithelial-like stem cells from human iPS cells (hiPS-lt-NES cells), which can provide a homogeneous and well-defined population of NSCs for standardized analysis. Here, we show that transplanted hiPS-lt-NES cells differentiate into neural lineages in the mouse model of spinal cord injury (SCI) and promote functional recovery of hind limb motor function. Furthermore, using two different neuronal tracers and ablation of the transplanted cells, we revealed that transplanted hiPS-lt-NES cell-derived neurons, together with the surviving endogenous neurons, contributed to restored motor function. Both types of neurons reconstructed the corticospinal tract by forming synaptic connections and integrating neuronal circuits. Our findings indicate that hiPS-lt-NES transplantation represents a promising avenue for effective cell-based treatment of SCI.     

Highly efficient neural differentiation of human somatic stem cells, isolated by minimally invasive periodontal surgery

Neural stem cells (NSCs) are potential sources for cell therapy of neurodegenerative diseases and for drug screening. Despite their potential benefits, ethical and practical considerations limit the application of NSCs derived from human embryonic stem cells (ES) or adult brain tissue. Thus, alternative sources are required to satisfy the criteria of ready accessibility, rapid expansion in chemically defined media and reliable induction to a neuronal fate. We isolated somatic stem cells from the human periodontium that were collected during minimally invasive periodontal access flap surgery as part of guided tissue regeneration therapy. These cells could be propagated as neurospheres in serum-free medium, which underscores their cranial neural crest cell origin. Culture in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2) under serum-free conditions resulted in large numbers of nestin-positive/Sox-2-positive NSCs. These periodontium-derived (pd) NSCs are highly proliferative and migrate in response to chemokines that have been described as inducing NSC migration. We used immunocytochemical techniques and RT-PCR analysis to assess neural differentiation after treatment of the expanded cells with a novel induction medium. Adherence to substrate, growth factor deprivation, and retinoic acid treatment led to the acquisition of neuronal morphology and stable expression of markers of neuronal differentiation by more than 90% of the cells. Thus, our novel method might provide nearly limitless numbers of neuronal precursors from a readily accessible autologous adult human source, which could be used as a platform for further experimental studies and has potential therapeutic implications.     

无血清培养新生Wistar大鼠神经干细胞及免疫荧光鉴定

目的在无血清条件下,分离培养新生1d的Wistar大鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况,并对其生物学特性进行鉴定。方法取新生1d的大鼠海马组织,机械分离法分离神经干细胞,加入含有表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清培养基中培养、增殖。倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化情况,采用免疫荧光染色鉴定其生物特性。结果从新生大鼠海马组织分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断增殖,免疫荧光染色显示巢蛋白呈阳性表达。诱导分化后,免疫荧光染色可见高分子量神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白和髓鞘碱性蛋白阳性表达细胞。结论无血清条件分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。