ERK和Smad通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的： 探讨ERK通路是否参与TGF-β/Smad 通路诱导的血管平滑肌细胞增殖及可能的分子机制。方法: 原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,细胞分4组：(1)对照组;(2)TGF-β1组;(3)ERK阻断剂(PD98059)组;(4)TGF-β1+ ERK阻断剂(PD98059)组。MTT法测细胞的增殖活性,Western blotting法检测VSMCs中细胞内核增殖抗原(PCNA)、Smad2/3、ERK1/2、Smad7蛋白表达及相关磷酸化蛋白含量,RT-PCR方法测VSMCs中Smad2、3、7mRNA的表达。结果: (1)各组PCNA蛋白表达和MTT法测得A值均低于对照组 (P＜0.05),TGF-β1+ ERK阻断剂组与TGF-β1组相比无显著差异。（2）与对照组相比,TGF-β1组p-Smad2/3、p-ERK1/2蛋白含量和Smad7蛋白表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组则明显降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组降低 (P<0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无显著差异。(3)与对照组相比,TGF-β1组Smad7 mRNA表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组表达降低(P<0.05)。各组内VSMCs 的Smad2、Smad3 mRNA表达无显著差异。结论: (1)TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但对TGF-β1的抑制平滑肌细胞增殖的作用无影响,可能有其它信号通路参与此过程。(2)ERK通路可通过蛋白和mRNA水平促进Smad7表达,反过来其又可促进ERK通路激活。(3)ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA水平无影响。     

CTGF反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖、胶原合成的抑制效应

目的：研究结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖、胶原合成及CTGF表达的抑制作用。 方法： 差速贴壁法分离新生SD大鼠心肌成纤维细胞(CFs)。反义、正义、错义CTGF寡核苷酸分别经阳离子脂质体介导转染CFs，并与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)10-6mol/L共培养48 h，采用MTT法测CFs生长数目，羟脯氨酸法测胶原蛋白含量，RT-PCR法及Western blotting法分别测CTGF mRNA及蛋白水平的表达。 结果： AngⅡ可以在mRNA及蛋白水平明显促进CFs CTGF的表达(P<0.01)，且呈浓度-时间依赖性。CTGF反义链组的MTT反应A值、胶原蛋白含量、CTGF mRNA及蛋白水平的表达量均明显低于AngⅡ组（P<0.01），而CTGF正义链组和错义链组与AngⅡ组无显著差异(P>0.05)。 结论： AngⅡ刺激下产生的CFs CTGF mRNA和蛋白水平的表达上调，可能是心肌纤维化传导通路中的关键环节，CTGF反义寡核苷酸可以序列特异性地阻断CTGF的介导，从而抑制AngⅡ对心肌成纤维细胞增殖、胶原合成及CTGF表达的诱导作用，进一步证实CTGF可能是拮抗心肌纤维化的特异性靶位。     

促红细胞生成素抑制Ang Ⅱ诱导的大鼠心肌细胞肥大及其可能的信号通路

目的观察促红细胞生成素(EPO)对新生大鼠心肌细胞肥大中信号通路蛋白表达的影响。方法用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ,10-6mol/L)诱导心肌细胞肥大,分别以EPO(2×104U/L)或/和P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB203580(15μmol/L)进行干预,检测心肌细胞表面积、蛋白合成、胚胎基因ANF及β-MHC表达,Real-timeQ-PCR检测转化生长因子β(TGF-β)1及P38MAPK mRNA表达;Western blot法检测TGF-β1、TGF-β激活性激酶1(TAK1)、phospho-TAK1、P38MAPK和phospho-P38MAPK蛋白的表达。结果 EPO能有效抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大(P0.05),抑制TGF-β1、TAK1、phospho-TAK1、P38MAPK和phospho-P38MAPK表达(P0.05);SB203580能增强EPO抑制心肌细胞肥大的作用。结论 EPO能减轻AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,其可能与TGF-β1-TAK1-P38 MAPK信号通路有关。     

TGF-β1/Smad通路在血管紧张素Ⅱ下调缝隙连接蛋白43表达中的作用

目的:分析心肌梗死(MI)后心脏组织中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、缝隙连接蛋白43(Cx43)和转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad通路相关因子的变化情况,以探讨AngⅡ能否经由TGF-β1/Smad调节Cx43的表达。方法:采用左前降支冠状动脉(LAD)结扎建立大鼠心肌梗死模型后,20只SD雄性大鼠随机分为氯沙坦(20 mg·kg~(-1)·d~(-1))治疗组与MI组,分别于结扎后及治疗2周后检测心功能情况,并检测治疗2周后左室心肌组织不同区域AngⅡ、AngⅡ1型受体(AT1)、Cx43以及TGF-β1/Smad通路相关分子的变化情况。结果:氯沙坦组左室舒张末期内径(LVIDd)和左室收缩末期内径(LVIDs)明显缩小(P0.01),室间隔厚度(IVSd)及左室后壁厚度(LVPWd)明显减小(P0.05),左室射血分数(LVEF)显著增加(P0.01);梗死区和边缘区的AngⅡ水平明显降低;梗死区AT1表达显著降低;Cx43在心肌组织不同区域表达增高,TGF-β1、Smad 2、Smad 3在心肌组织不同区域表达均降低,而Smad 7表达增高。结论:心肌梗死后AngⅡ激活可能通过作用于TGF-β1/Smad通路导致Cx43表达下调。     

MG132抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞活化

目的探讨泛素-蛋白酶体抑制剂MG132对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺成纤维细胞活化的影响及机制。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),随机分为对照组、TGF-β1组(10μg/L)和MG132(0.5μmol/L)处理组。Western blot法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α1(COL1A1)的表达;RT-PCR和Western blot法分别检测细胞Smad7、核转录共抑制因子SnoN、TGF-βI型受体(TβRI)、Smad2和Smad3 mRNA及蛋白的表达。结果与对照组比较,TGF-β1促进了α-SMA和COL1A1蛋白表达(P0.05),MG132抑制了TGF-β1的上述作用(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN mRNA表达较对照组增加(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN蛋白表达较对照组减少(P0.05),而MG132组Smad7和SnoN蛋白水平较TGF-β1组增加(P0.05)。结论 MG132可能通过阻止Smad7和SnoN蛋白泛素化降解,抑制TGF-β1诱导人肺成纤维细胞活化。     

福辛普利和缬沙坦抑制Ang Ⅱ诱导的大鼠肾小管上皮细胞klotho基因表达下调

目的探讨福辛普利(Fos)和缬沙坦(Val)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)抑制NRK-52E细胞klotho基因表达的干预作用及klotho与转化生长因子-β1(TGF-β1)的关系。方法将大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)分为对照组、AngⅡ(10-7mol/L)组、AngⅡ分别再加Fos(10-5mol/L)组、Val(10-5mol/L)组和Fos+Val组,培养24 h后,用反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测klotho和TGF-β1mRNA表达;用免疫组织化学法和Western blot检测klotho和TGF-β1蛋白表达。对klotho和TGF-β1蛋白表达进行直线相关分析。结果 (1)AngⅡ诱导NRK-52E中TGF-β1mRNA表达上调,同时使klothomRNA表达下调,经Fos或Val或Fos+Val干预后,TGF-β1mRNA表达明显受抑制,而klothomRNA显著上调表达(P<0.05)。(2)Fos、Val和Fos+Val均明显上调AngⅡ诱导的klotho蛋白低表达(P<0.05),同时抑制TGF-β1蛋白高表达(P<0.05)。(3)klotho和TGF-β1蛋白表达呈...     

PAX6抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心脏成纤维细胞转分化

目的:探讨配对盒因子6(PAX6)在血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的心脏成纤维细胞(CFs)转分化中的作用及其机制。方法:培养原代成年小鼠CFs,用Ang Ⅱ(10-6mol/L)建立CFs转分化模型,利用小鼠PAX6腺病毒载体感染小鼠CFs;实验分为Ad-GFP+Ctrl组(感染对照腺病毒)、Ad-GFP+Ang Ⅱ组(感染对照腺病毒再给予Ang Ⅱ处理)、Ad-PAX6+Ctrl组(感染过表达PAX6腺病毒)和Ad-PAX6+Ang Ⅱ组(感染过表达PAX6腺病毒再给予Ang Ⅱ处理)。倒置荧光显微镜下观察CFs感染后荧光表达情况;采用Western blot检测CFs中PAX6、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(Col I)、纤连蛋白(FN)和转化生长因子β1(TGFβ1)的表达;固定细胞免疫荧光技术检测α-SMA、Col I和FN的表达与分布;qPCR检测PAX6和TGFβ1的mRNA表达。结果:(1)倒置荧光显微镜下观察腺病毒载体感染CFs成功,qPCR和Western blot证明CFs中PAX6过表达成功(P<0.01);(2)在Ang Ⅱ作用下,CFs中肌成纤维细胞标志物α-SMA显著升高,而过表达PAX6显著抑制Ang Ⅱ诱导的α-SMA表达(P<0.01);(3)过表达PAX6显著抑制CFs中Ang Ⅱ诱导的细胞外基质蛋白Col I和FN的表达与分泌(P<0.05);(4)在Ang Ⅱ处理后,TGFβ1的mRNA和蛋白表达显著升高,而过表达PAX6显著抑制Ang Ⅱ诱导的CFs中TGFβ1的mRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论:PAX6通过抑制TGFβ1的表达从而抑制Ang Ⅱ诱导的CFs转分化及细胞外基质蛋白的表达与分泌。     

PPAR-α参与血管紧张素Ⅳ诱导大鼠心肌细胞肥大

目的研究过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)在血管紧张素Ⅳ(AngⅣ)诱导大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法用乳鼠心肌细胞,以细胞表面积、蛋白含量和心房利钠因子mRNA表达为心肌肥大指标,观察不同浓度AngⅣ对心肌细胞的作用,并观察PPAR-α激动剂非诺贝特(FF)和阻断剂MK886对AngⅣ作用的影响;用Real-time PCR和Western blot方法检测mRNA及蛋白水平的表达。结果 AngⅣ浓度依赖地(0.01、0.1及1 nmol/L)诱导心肌细胞肥大;使PPAR-αmRNA和蛋白表达明显降低,分别为55.7±9.6和3.3±0.3(P<0.01);FF明显抑制AngⅣ1 nmol/L诱导的心肌细胞肥大(P<0.01),上调PPAR-αmRNA和蛋白表达,分别增加至151.7±10.5和6.7±0.7(P<0.01)。MK886可完全取消FF的上述作用(P<0.05)。结论 AngⅣ所致心肌肥大与PPAR-α信号通路受损有关。     

丹参素对肝星状细胞TGF-β信号转导的影响

目的： 观察丹参素对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导活化的大鼠肝星状细胞(HSCs)Smad信号转导通路的影响。方法：体外分离、培养大鼠肝HSCs,用不同浓度丹参素作用于HSCs,检测丹参素对HSCs增殖和TGF-β1刺激后HSCs增殖的影响;观察丹参素对TGF-β1刺激HSCs表达α-SMA的影响;观察HSCs转化生长因子受体(TβRⅠ、Ⅱ)的表达;观察丹参素和TGF-β1作用HSCs后,其Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达的变化。结果：(1)丹参素在0.0625 mmol/L-1 mmol/L时,对HSCs的生长增殖具有抑制作用 (P<0.05);丹参素对TGF-β1诱导的HSCs增殖也具有明显的抑制作用 (P<0.05)。(2)丹参素0.25 mmol/ L作用HSCs能下调α-SMA的表达(P<0.05),也能下调TGF-β1诱导的HSCs的α-SMA表达(P<0.05)。（3）HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达定位于细胞膜上,丹参素能下调活化HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达（P<0.05或P<0.01）。 (4) TGF-β1促进HSCs中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达（P<0.01）;丹参素能下调TGF-β1诱导的HSCs内Smad2、Smad3 mRNA的表达(P<0.05),并能上调Smad7 mRNA表达(P<0.05)。 结论：体外细胞实验表明,丹参素能通过下调活化HSCs细胞膜上TβRⅠ、Ⅱ蛋白的表达来抑制HSCs的活化增殖。丹参素能上调HSCs内Smad7 mRNA表达,并下调Smad2、Smad3 mRNA表达,抑制HSCs活化,并抑制TGF-β1诱导的HSCs活化。     

PLGF参与Ang II诱导的心脏成纤维细胞激活

 目的：探讨胎盘生长因子（PLGF）在血管紧张素II（Ang II）激活心脏成纤维细胞(CFs)中的表达及其作用。方法：原代分离培养并鉴定新生SD大鼠CFs。蛋白免疫印迹检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、PLGF和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2),免疫荧光观察α-SMA的表达,WST-1法检测细胞增殖,RT-PCR检测PLGF、I型和III型胶原蛋白的mRNA表达水平。结果：(1)Ang II组PLGF mRNA 表达明显高于对照组（P<0．01),联用替米沙坦后,PLGF mRNA表达水平下降;Ang  II组PLGF蛋白表达水平高于对照组（P<0.05); (2)PLGF诱导CFs增殖及α-SMA蛋白表达增加（P<0.05）;PLGF干预CFs 60 min后,p-ERK1/2蛋白水平表达明显高于对照组（P<0.01);(3)Ang II+anti-PLGF组与Ang II组比较,细胞增殖和α-SMA蛋白表达水平下降（P<0.05）,I型和III型胶原蛋白mRNA表达水平亦下调（P<0.05）。结论：PLGF可能参与Ang II诱导的CFs增殖和纤维化过程。     

sTβRⅡ拮抗新生大鼠心肌成纤维细胞内TGF-β1诱导的Smad信号和肌成纤维细胞分化

目的研究可溶性转化生长因子-β1Ⅱ型受体(sTβRⅡ)对新生大鼠心肌成纤维细胞内TGF-β1诱导的Smad信号和肌成纤维细胞分化的抑制效应。方法培养新生大鼠的心肌成纤维细胞,随机分为4组:PBS对照组、TGF-β1(5ng/ml)组、sTβRⅡ(50ng/ml)组和TGF-β1+sTβRⅡ组。30min、1h和2h后,免疫细胞化学染色检测P-Smad2和Smad3的表达;24h后,免疫细胞化学染色检测α-SMA的表达。结果与PBS对照组相比,TGF-β1组P-Smad2、Smad3(核阳性率)和α-SMA的表达显著性升高(P0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+sTβRⅡ组P-Smad2、Smad3(核阳性率)和α-SMA的表达明显降低(P0.05)。结论sTβRⅡ可拮抗新生大鼠心肌成纤维细胞内TGF-β1诱导的Smad2/Smad3蛋白的磷酸化与核转位,阻断Smad信号转导通路,抑制肌成纤维细胞分化。     

烟草烟雾通过TGF-β1/Smad2通路诱导RLE-6TN发生上皮间质转化

目的:探讨烟草烟雾提取物(Cigarette smoke extract,CSE)在诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞RLE-6TN发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用及机制。方法:以不同浓度(0.25%,0.5%及1%)CSE刺激RLE-6TN细胞株;TGF-β1受体抑制子(SB431542)预处理后,加入1%CSE共培养。实时定量PCR(RT-PCR)检测E-cadherin和Vimentin RNA表达;印迹法(Western blot)检测TGF-β1、Smad2、磷酸化的Smad2(p-Smad2)、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达量。结果:经不同浓度的CSE作用,E-cadherin无论是在RNA还是在蛋白水平表达均下调,而Vimentin表达均上调;同时,TGF-β1、p-Smad2和N-cadherin蛋白表达量增加;TGF-β1受体抑制子(SB431542)干预后,p-Smad2表达量明显降低(P0.05),E-cadherin蛋白表达量较对照组明显增加(P0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白表达量较对照组明显降低(P0.05)。结论:CSE可能通过激活TGF-β1/Smad2信号通路,参与调节E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,从而诱导RLE-6TN发生EMT。     

PPAR-α参与血管紧张素Ⅳ诱导的心肌细胞肥大

 摘要：目的 研究过氧化物酶体增殖物激活受体-α（peroxisome proliferator-activated receptor-α,PPAR-α）在血管紧张素Ⅳ（angiotensin Ⅳ,Ang Ⅳ）诱导心肌细胞肥大中的作用。方法 利用乳鼠心肌细胞培养,以细胞表面积、蛋白含量和心房利钠因子mRNA表达为心肌肥大指标,观察不同浓度的Ang Ⅳ对心肌细胞的作用,并观察PPAR-α激动剂非诺贝特（fenofibrate,FF）和阻断剂MK886对Ang Ⅳ作用的影响;利用Real-time PCR和Western blot方法检测mRNA及蛋白水平的表达。结果 Ang Ⅳ浓度依赖地（0.01、0.1、1 nmol/L）诱导心肌细胞肥大;同时PPAR-α mRNA和蛋白表达明显降低（P <0.01）;FF明显地抑制Ang Ⅳ 1 nmol/L诱导的心肌细胞肥大（P <0.01）,并上调PPAR-α mRNA和蛋白表达（P <0.01）。MK886可完全取消FF的上述作用（P <0.05）。结论 Ang Ⅳ所致心肌肥大与PPAR-α信号通路受损有关。     

柚皮素通过抑制TGF-β1/smad信号传导通路缓解糖尿病肾病大鼠肾损伤

目的探讨柚皮素对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其对TGF-β1/smad信号传导通路的影响。方法将糖尿病肾病模型大鼠随机分为糖尿病肾病组和糖尿病肾病+柚皮素组,用药治疗6周。检测大鼠24 h尿蛋白定量、肌酐清除率和肾脏指数;HE染色观察肾组织形态和检测肾小球面积;实时荧光定量PCR检测Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA的表达;Western blot检测Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、TGF-β1、smad7、总smad2和磷酸化smad2蛋白。结果糖尿病肾病组大鼠24 h尿蛋白(P0.01)和肾脏指数(P0.01)显著升高,肌酐清除率明显下降(P0.01),肾小球明显肥大(P0.05),Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的mRNA水平和蛋白表达量均升高,TGF-β1和磷酸化smad2蛋白的表达量均升高,smad7蛋白表达量降低;经柚皮素50 mg/kg治疗后能明显降低糖尿病肾病大鼠的24 h尿蛋白(P0.01)和肾脏指数(P0.05),提高肌酐清除率(P0.05),减轻肾小球肥大(P0.05),Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的mRNA水平和蛋白表达量降低,TGF-β1和磷酸化smad2蛋白的表达量均降低,smad7蛋白表达量升高。结论柚皮素可能通过调控糖尿病肾病肾组织TGF-β1/smad信号通路表达,减轻肾脏病理损害。     

Caveolin-1在TGF-β1诱导人支气管上皮细胞间质化中的作用

目的:探究小窝蛋白1(caveolin-1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人支气管上皮细胞(16HBE细胞)上皮-间充质转化(EMT)中的作用。方法:以16HBE细胞株为研究对象,免疫荧光、RT-q PCR和Western blot实验检测16HBE细胞EMT过程中caveolin-1的mRNA和蛋白表达;Western blot检测siRNA干扰caveolin-1对16HBE细胞EMT的影响。结果:Caveolin-1广泛存在于16HBE细胞膜上,TGF-β1刺激后,caveolin-1的mRNA和蛋白表达减少(P0.05)。与TGF-β1组比较,caveolin-1 siRNA和TGF-β1共同作用促进了细胞形态的转化,抑制了E-钙黏蛋白的蛋白表达而促进了α-SMA的蛋白表达(P0.05)。TGF-β1刺激16HBE细胞后,AKT和Smad3在30 min磷酸化水平最高,与0 min对照组比较显著增加(P0.05);用siRNA干扰caveolin-1基因后再用TGF-β1刺激16HBE细胞30 min,下游信号蛋白分子AKT和Smad3的磷酸化水平增高,与TGF-β1组比较显著增加(P0.05)。结论:TGF-β1能下调16HBE细胞的caveolin-1表达水平;caveolin-1可能参与了TGF-β1诱导的16HBE细胞EMT过程中TGF-β1/Smad通路和PI3K-AKT通路的活化。     

PI3K/CTGF信号通路在TGF-β1诱导A549细胞表达collagen Ⅰ过程中的作用

目的:研究磷脂酰肌醇3-激酶/结缔组织生长因子(PI3K/CTGF)信号通路在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺腺癌A549细胞表达I型胶原蛋白(collagen I)过程中的分子机制。方法:体外培养A549细胞,予TGF-β1刺激,观察CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表达及PI3K信号通路的活化;PI3K抑制剂LY294002预先处理A549细胞后,观察TGF-β1刺激下CTGF和collagen I mRNA和蛋白表达的变化;CTGF特异性si RNA干扰A549细胞中CTGF的表达后,观察TGF-β1刺激下collagen I mRNA和蛋白表达的变化和PI3K信号通路的活化。结果:TGF-β1可以诱导A549细胞中CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表达以及PI3K信号通路的活化;PI3K特异性抑制剂LY294002可以部分逆转TGF-β1诱导的A549细胞中CTGF和Collagen I mRNA和蛋白表达的升高。干扰CTGF可以降低TGF-β1诱导的A549细胞collagen I mRNA和蛋白表达,而不影响PI3K信号通路的活化。结论:CTGF是TGF-β1/PI3K信号通路调控的即刻早期反应效应蛋白,参与了TGF-β1诱导的A549细胞中collagen I表达。     

视黄醇X受体激动剂通过调控Smad2通路抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞胶原合成

目的:探讨视黄醇X受体(RXR)激动剂9-顺式视黄酸(9-cis-RA)干预对缺氧条件下转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠心肌成纤维细胞(CFs)胶原合成的影响和分子机制。方法:心肌组织块干涸法培养大鼠CFs,持续通氮气法建立细胞缺氧环境,评价9-cis-RA和TGF-β1对CFs胶原合成的影响;ELISA法测CFs上清液Ⅰ、Ⅲ型胶原水平,Western blot法检测胞浆、胞核和细胞的Smad2及p-Smad2水平,细胞免疫化学法观察p-Smad2的亚细胞定位。结果:TGF-β1(0.01~10μg/L)在缺氧条件下呈浓度依赖性地诱导CFs合成Ⅰ型和Ⅲ胶原,当浓度达到5μg/L时,Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成水平显著增高(P0.01)。9-cis-RA(10-9~10-6mol/L)则呈浓度依赖性抑制TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs胶原合成,当浓度为10-7mol/L时,Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成水平显著降低(P0.01)。Smad2抑制剂(20 nmol/L)亦可显著抑制TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成。免疫杂交和细胞免疫化学结果显示,与TGF-β1干预相比,TGF-β1和9-cis-RA联合干预组的CFs其胞浆内p-Smad2的水平显著增加,但胞核内p-Smad2的水平明显降低(P0.05)。结论:RXR激动剂9-cis-RA显著下调TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成,其机制与其抑制TGF-β1诱导的p-Smad2细胞核转位有关。     

激活法尼酯X受体上调核心蛋白聚糖表达对肾小管上皮细胞转分化的作用

目的研究激活法尼酯X受体(FXR)对核心蛋白聚糖(decorin)表达的变化及其对肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响。方法 (1)采用不同浓度的FXR特异性激动剂CDCA及拮抗剂Guggulsterones处理肾小管上皮细胞(HK-2),观察decorin的mRNA和蛋白表达的变化;(2)将HK-2细胞分为对照组,TGF-β1诱导组(20 ng/ml),TGF-β1诱导加CDCA组(100μmol/L)和TGF-β1诱导加CDCA、Guggulsterones共处理组,48 h后观察各组细胞的形态变化,检测各组decorin、E-cadherin和α-SMA的mRNA和蛋白表达的情况。结果 (1)CDCA激活HK-2细胞FXR,decorin的mRNA和蛋白表达升高,且呈剂量依赖。在100μmol/L CDCA和不同浓度Guggulsterones共处理HK-2细胞,随着Guggulsterones浓度升高,decorin的mRNA和蛋白表达逐渐减低;(2)RT-PCR和Western blot显示,decorin在对照组、TGF-β1组无表达,在TGF-β1+CDCA组明显上调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著下降;E-cadherin在对照组高表达,在TGF-β1组显著下调,在TGF-β1+CDCA组显著上调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著下降;α-SMA在对照组无表达,在TGF-β1组显著上调,在TGF-β1+CDCA组显著下调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著上调。结论 CDCA激活肾小管上皮细胞FXR能够通过上调decorin的表达,从而抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化。     

丹皮酚通过抑制miR-21表达减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化

目的研究丹皮酚(PAE)通过抑制微小RNA-21(miR-21)减轻博莱霉素(BLM)诱导肺纤维化的相关机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、BLM组、阳性对照(PC)组、PAE组,比较各组大鼠的肺纤维化相关指标,miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平,及Smad7、TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平;将制备好的纤维细胞分为对照组,TGF-β1组,PAE-L组,PAE-M组,PAE-H组,miR-21抑制剂组,检测各组细胞中miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平及Smad7、COLIA1、α-SMA蛋白水平,并验证miR-21与Smad7的靶向关系。结果与对照组相比,BLM组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度,miR-21mRNA表达水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白表达水平显著升高均显著升高(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P0.01),与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度均显著降低(P0.01);与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠肺组织中miR-21 mRNA水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低,Smad7的mRNA及蛋白水平显著升高(P0.01);与对照组相比,TGF-β1组成纤维细胞中miR-21的mRNA及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著升高(P0.01),Smad7的m RNA及蛋白水平显著降低(P0.01);与TGF-β1组相比,PAE-L组、PAE-M组、PAE-H组、miR-21 inhibitor组成纤维细胞中miR-21的mRNA水平及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著升高(P0.01);靶基因数据库预测及双荧光素酶报告实验表明,miR-21靶向抑制Smad7。结论 PAE可能通过抑制miR-21表达靶向促进Smad7表达,并抑制TGF-β1表达来减轻BLM诱导的肺纤维化。     

CXXC5 对心房颤动大鼠心肌纤维化的影响及机制

目的:探讨锌指蛋白5(CXXC5)在心房颤动大鼠心肌纤维化中的表达及其对心肌纤维化的影响及可能机制。方法:将40只大鼠分为对照组(正常大鼠组)、空白对照组(心房颤动模型大鼠组)、阴性对照组(心房颤动大鼠尾静脉注射阴性对照病毒组)和过表达CXXC5组(心房颤动大鼠尾静脉注射过表达CXXC5病毒),每组10只。空白对照组、阴性对照组和过表达CXXC5组大鼠建立心房颤动心肌纤维化模型(腹部皮下注射异丙肾上腺素建立心房颤动心肌纤维化模型)。伊红-苏木素(HE)染色和Masson染色观察心肌组织形态学变化,并测定胶原容积分数(CVF);采用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)测定心肌组织中Ⅰ型胶原、CXXC5、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad7 mRNA水平;采用Western blot法测定大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平。结果:HE染色和Masson染色显示:对照组大鼠心肌组织形态学正常;空白对照组和阴性对照组大鼠心肌细胞排列紊乱,间质胶原纤维增多,心肌纤维化严重;过表达CXXC5组大鼠心肌细胞排列稍紊乱,心肌纤维化较轻;模型组大鼠CVF明显高于对照组(P0.05)。与对照组相比,其他3组大鼠CVF升高(P0.05),CXXC5、Smad7 mRNA和蛋白水平升高(P0.05),Ⅰ型胶原、TGF-β1 mRNA和蛋白水平降低(P0.05);与空白对照组和阴性对照组相比,过表达CXXC5组大鼠CVF降低(P0.05),心肌组织中CXXC5、Smad7 mRNA和蛋白水平升高(P0.05),Ⅰ型胶原、TGF-β1 mRNA和蛋白水平降低(P0.05);空白对照组和阴性对照组大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P0.05)。结论:心房颤动心肌纤维化大鼠心肌组织CXXC5水平降低,TGF-β1/Smad7信号通路激活;过表达CXXC5可通过抑制TGF-β1/Smad7信号通路抑制心房颤动大鼠心肌纤维化。