血清学指定HLA-B座位纯合型误差分析及HLA-B座位表达变异检测的意义

目的 :用DNA分型法对HLA B座位抗原纯合型进行分型 ,探明是否存在HLA B基因发生变异引起结果差异。方法 :经血清学鉴定HLA B座位纯合型样本 75例 ,用PCR SSP法进行DNA分型和表达变异筛查。结果 :75例血清学鉴定为纯合型后经DNA分型证实有 12例存在第二基因 ,经PCR SSP法进行变异筛查发现有 1例存在第四外显子额外胞嘧啶插入 ,经DNA分型发现的第二基因实为沉默基因。结论 :用PCR SSP法进行HLA B基因分型可弥补血清学方法的不足 ,同时筛查表达变异使分型结果更加准确 ,能有效地指导临床应用。     

应用顺序特异性引物聚合酶链反应检测华南人群HLA-B座位第4外显子变异

目的：为探明中国华南人群中因HLA-B座位发生基因突变而引起表达变异存在的可能性。方法：用顺序特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）对75例经血清血分型为纯合型样本再次分型，对有差异的结果使用PCR-SSP方法检测第四外显子突变情况。结果：75例血清学指定为纯合型标本经DNA分型证实有12例为杂合型。12例结果有差异的样本经PCR-SSP法表达变异的筛查发现有1例存在第四外显子额外胞嘧啶插入，经DNA分型发现的第二基因为沉默基因。结论：应用PCR-SSP方法可检测HLA-B等位基因突变，该突变导致HLA-B基因表达无效，进行HLA基因表达变异的检测可提高HLA分型的准确性，更加有效的指导临床进行器官和骨髓的选配。     

顺序特异性引物聚合酶链反应技术对HLA-DR DNA的分型

目的：应用顺序特异性引物聚合酶链反应技术(PCR—SSP)进行临床肾移植供受者HLA—DR位点DNA的分型。方法：设计并合成HLA—DR位点16对特异性引物和1对阳性对照引物，建立PCR—SSP法，对52份临床肾移植供受者的外周血淋巴细胞样本进行DR位点基因的分型。结果与微量PCR—SSP基因分型试剂盒分型方法比较。结果：所有临床样本的PCR—SSP基因分型均获得成功，结果与微量PCR—SSP基因分型试剂盒分型方法完全相同，分型时间3h，特异性和重复性100％。结论：应用合成引物为临床肾移植供受者进行HLA—DR位点PCR—SSP基因分型简便快捷，重复性好，适合于临床应用。     

用顺序特异引物聚合酶链反应技术对HLA-B基因分型

目的采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＰ）建立汉族人群ＨＬＡ－Ｂ基因分型方法。方法肾移植供受者临床样本ＤＮＡ３１９份，Ｂ基因标准系列ＤＮＡ６２份。设计合成Ｂ座位５２个特异性引物和１对阳性对照引物，组成４１个ＰＣＲ反应，建立ＰＣＲ－ＳＳＰ方法。一步法完成对Ｂ座位的基因分型。结果经双盲验证，并与血清学方法比较。结果所有临床样本和标准ＤＮＡ，ＰＣＲ－ＳＳＰ基因分型均获得成功。可准确分辨ＨＬＡ－Ｂ座位等位基因４１个，实际检出汉族人群Ｂ抗原特异性３２个。无假阳性和假阴性，４０份样本的重复率１００％，总耗时５小时。分型结果经双盲验证完全符合。与血清学分型结果比较显示：７８份血清学空白中１７例存在第二个基因，２６份血清学分型结果错误。总误差率１３．５％。结论用ＰＣＲ－ＳＳＰ技术行ＨＬＡ－Ｂ基因分型，分辨率高、特异性强、重复性好、相对简捷快速，分型结果较血清学方法更加精确可靠，适合于临床应用。     

中国南方汉族人群HLA-Cw座位基因多态性分析

目的 分析中国南方汉族人群HLA－Cw座位基因多态性。方法 采用ARMS／PCR技术对60名随机选择的南方汉族健康个体作HLA－Cw基因分型。结果 共检出12种HLA－Cw等位基因或等位基因组（allele group)，其中HLA－Cw*07、＊01、＊03为该人群最常见HLA－Cw基因，频率之和为0．6932；证实该群体中HLA－Cw＊08频率为0．1056，检出率明显高于血清学分型；检出HLA－Cw*1202、＊1203、＊14、＊15等4种经典血清学分型不能鉴定的HLA－Cw基因，频率之和为0．0673。结论 提供了中国南方汉族人群HLA－Cw座位基因频率正常值，证实ARMS／PCR作HLA－Cw分型具有准确、快捷的优点。     

人类白细胞抗原HLA-B/DR座位间基因重组一家系

目的 了解一家系人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)复合体HLA-B/DR座位间的基因重组.方法 采集拟进行造血干细胞移植的1例急性淋巴细胞白血病患者(男,16岁)及其父母和3个姐姐的外周血标本,首先对其HLA Ⅰ、Ⅱ类A、B、DRB13个位点采用聚合酶链反应-序列特异寡核苷酸探针技术(polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide,PCR-SSO)和聚合酶链反应-序列特异性引物技术(polymerase chain reaction sequence specific primer,PCR-SSP)进行低分辨基因分型,然后用基于测序的分型方法(sequencing-based typing,SBT)进行高分辨基因分型,再进行遗传家系分析研究,确定HLA基因重组相关位点.结果 HLA高分辨基因分型的结果证实患者的2条单倍型分别为A*3101-B*1301-DRB1*0701和A*3303-B*4403-DRB1*1302;其父亲的2条单倍型为A*3001-B*1302-DRB1*0701和A*3101-B*1301-DRB1*1501.从遗传家系分析显示,患者所携有的父源A*3101-B*1301单倍体是源自父亲的1条染色单体,而DRB1*0701则源自父亲的另1条染色单体,这表明父亲的2条染色单体在减数分裂时HLA-B和-DRB1基因座位间发生了交换,重组后的单倍型又完整地遗传给了患者.结论 发现了1个中国汉族人群HLA-B/DR基因座位间的基因重组家系.     

用PCR—SSP作HAL—B位点分型及B22亚型分析

目的：用ＤＮＡ分型弥补血清学ＨＬＡ－Ｂ位点分型的欠缺并了解南方汉族Ｂ２２亚型分布情况。方法；采用标准细胞作参照，建立Ｂ位点的ＰＣＲ－ＳＳＰ分型方法地血清学Ｂ２２阳性标本进行Ｂ２２亚型分析。结果：１０４株标准细胞ＰＣＲ－ＳＳＰ分型结果与已知结果完全一致，１７例白血病人及同胞分型与血清学一致，１例不符；Ｂ２２亚型以３＾＊５４０１最多，Ｂ＾＊５６０１较少，１例分型格局异常，可能为新Ｂ２２等位基因或错配的     

格林—巴利综合征HLA—A、—B基因关联的研究

目的：研究急性运动性轴索型神经病（AMAN）的易感性与HLA－A、－B等位基因分型的关系,探讨AMAN患者免疫遗传的特点。方法：用改良快速盐析法自研究对象静脉血中抽提基因组DNA,采用聚合酶链反应－顺序特异性引物法（PCR－SSP）对33例AMAN患者和132例健康人进行HLA－A、－B位点等位基因分型。结果：发现AMAN组HLA－B15、－B35频率升高,RR（relative risk）值分别为4．09和7．08。Pc分别为0．015和0．0008。结论：HLA－B15、－B35与AMAN的易感性可能有关联。     

中国彝族人群HLA-Cw位点基因多态性研究

目的　应用DNA分型技术 ,分析中国彝族人群在HLA Cw位点的等位基因分布频率 ,为进一步研究HLA Cw与HIV感染及其发病进程的关联提供背景资料。方法　设计合成 2 6条特异性分型引物和 1对内对照引物 ,组成 2 4个PCR反应 ,建立PCR SSP分型方法 ,对 10 2例随机选取的无亲缘关系的中国彝族健康人作HLA Cw基因分型。结果　在彝族健康人群中共检测到HLA Cw位点的12种等位基因 ,其中HLA Cw 0 1、Cw 0 7和Cw 0 8为主要分布型别 ,基因频率分别为 0 .3 3 3 3、0 .2 5 0 0和 0 .1765 ,检出了HLA Cw 12、Cw 13 0 1、Cw 14和Cw 15等血清学方法不能鉴定的HLA Cw基因 ;统计分析表明HLA Cw位点的基因型分布符合Hardy Weinburg平衡 (χ2 =65 .983 1,df=66,P >0 .0 5 )。结论　证实了PCR SSP法用于HLA Cw基因分型的可靠性和适用性 ,在DNA水平上提供了中国彝族群体的HLA Cw基因分布频率资料     

HLA—A,B血清学分型与DNA分型的比较

目的：比较１３６例样本ＨＬＡ－Ａ，Ｂ血清学分型与ＤＮＡ分型结果。方法：应用聚合酶链反应－序列特异性引物（ＰＣＲＳＳＰ）技术，设计３８对引物，检测常见的ＨＬＡ－Ａ，Ｂ基因。结果：１３６例样本中有６０例血清学分型与ＤＮＡ分型结构不符合（４４．１％）；ＨＬＡ－Ａ特异性血清学分型错误率在纯合子中分别占２３．３％与９．４％（共１１．２％），在ＨＬＡ－Ｂ中分别占４７．４％与１８．４％（共２０．６％）；ＨＬＡ－Ａ特异性血清学分型假阴性６．６％，假阳性２．５％，错误指认特异性２．１％，ＨＬＡ－Ｂ错异性则分别为６．７％，３．６％，１０．３％。结论：ＩＬＡ－Ａ纯合子血清学分型错误率明显高于杂合子（Ｐ〈０．０５）；ＨＬＡ－Ｂ纯合子血清学分型错误率也明显高于杂合子（Ｐ〈０．００５）；ＨＬＡ－Ｂ特异性血清学分型错误率显著高于ＨＬＡ－Ａ特     

p表型个体的血清学特点和分子机制研究1例

目的分析1例p表型个体的血清学特征和分子机制。方法选取2021年5月在嘉兴市中心血站进行血型鉴定的1例p表型个体为研究对象。用血型血清学方法鉴定其ABO、RhD、P1PK血型和意外抗体。采用PCR-直接测序法(PCR-SBT)对编码P1和PK抗原的α1, 4-半乳糖基转移酶基因(A4GALT)的编码区进行测序分析。结果该个体的血型为A型、RhD阳性、P1PK系统为罕见的p表型, 血清中存在抗-PP1Pk。测序结果显示其A4GALT基因编码区存在c.343A>T纯合变异。结论 A4GALT基因c.343A>T纯合变异很可能导致了p表型个体。     

HLA-DR位点的基因芯片分型与临床应用

目的：建立一种新型的HLA－DR位点的基因分型方法，为HLA－DR的基因分型提供一个较新的思路。方法：利用基因芯片技术HLA不同基因亚型的独特序列设计探讨，制成分型芯片；待检测样品经PCR反应标记上荧光之后，与芯片进行杂交，根据杂交产生的荧光信号值分析确定样品DR位点的基因亚型，将这一方法应用于70份标准DNA和200份医院移植供受者的HLA－DR基因分型并将部分样品进行基因测序。结果：检测结果表明HLA－DR基因分型芯片可准确分辨出DR位点等位基因30大类，耗时3h 。结论：基因芯片用HLA－DR的基因分型，分辨率高，特异性强，重复性好，操作简便，对比常规的PCR－SSP和PCR－SSO方法，HLA－DR基因芯片方法更为直观，并具有集成化优势。可以在一张芯片上同时检测HLAⅠ类的A、B位点，并实现一张芯片多人份，适合于临床应用和骨髓库，脐血库的建立。     

HLA—DR位点的PCR—SSP基因分型

目的：探讨适用于肾移植供体HLA-DR的快速基因分型方法。方法：自行设计合成引物建立顺序特异性引物聚合酶链反应技术,并对110例肾移植供体作HLA-DR基因分型。结果：DNA提取方法可以满足PCR-SSP分型方法对DNA模板的要求。全部操作耗时120min,110例标本均分型成功。基因频率范畴在0.0045-0.1227之间,以DR4、DR15和DR9占多数。结论：PCR-SSP法作HLA-DR分型具有准确,简便,快速等优点。适合在临床进行推广应用。     

基因芯片技术在乙型肝炎病毒基因分型检测中的应用探讨

目的：探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性。方法：查阅国际上主要的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型诊断标准和现行技术，通过将基因芯片技术与目前用于HBV基因分型的技术方法进行对比，探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性。结果：HBV的基因分型，既可通过全基因序列比对，也可通过片段基因序列比对，片段基因序列比对是实际工作中HBV基因分型的主要方法，现有报道的技术主要为型特异引物(SSP)PCR扩增法和PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法。基因芯片技术具有高敏感、高通量和能够平行检测DNA类型等特点，技术类型属于PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法。尚未见有应用基因芯片技术进行HBV基因分型检测的报道。结论：借鉴现有的PCR扩增型特异探针（SSO)杂交法，如微板核酸杂交一ELISA显色技术，理论上利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断的方法是完全可能的，并且具有高效、快速和廉价等特点。     

广州地区小儿无症状乙肝病毒携带者的基因型研究

目的：扩增HBV DNA S基因，建立HBV DNA的分型方法，研究广州地区小儿无症状乙肝病毒携带者（AsC）的基因型。方法：利用PCR－RFLP基因分型方法，扩增HBV DNA S基因，以限制性内切酶AvaⅡ、MboI酶切分型。结果：60份AsC血清样本，B型37份（62．7％），C型20份（33．3％），B、C混合型2份（3．3％），未分型1份（1．7％），经序列分析证明为C型，C型共35％。结论：PCR－RELP分型方法经济实用，分型率达98．3％，广州地区小儿乙肝病毒的基因型以B型和C型为主，其中携带者中B型占优势。     

基于α-病毒复制酶的高效小鼠P815肿瘤疫苗的构建和表达

目的：克隆小鼠肥大细胞瘤P815细胞株的肿瘤特异PIA基因于含α－病毒复制酶的真核表达载体PSMART中，以制备P815肿瘤DNA疫苗。方法：RT－PCR方法扩增P1A基因，以含α－病毒复制酶的哺乳细胞高效表质质粒PSMART为载体，构建重组肿瘤DNA疫苗，重组体经酶切和测序后，再用脂质体转化293人胚肾细胞，ECL western-blot法和免疫组化法鉴定转化细胞中PIA基因的表达。结果：正确构建了P1A／PSMART重组质粒，并且在转化此质粒的293细胞中检测出了P1A的表达。结论：成功构建了重组P1A／ pSMART肿瘤DNA疫苗，可以进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及疗效观察。     

人DOC-2氨基端PID结构域的克隆与原核表达

目的：克隆人DOC—2氨基端PID结构域(暂命名为nDOC-2)，并在原核细胞中表达。方法：用RT—PCR从正常人卵巢组织中扩增nDOC—2基因，并克隆到载体pUC—19中；经测序证实后，用Bam3HI／EcoRI双酶切，亚克隆到原核表达载体pGEx—4T—1，并转化E.coli DH5α菌株。取工程菌，用IPTG诱导表达，对表达产物进行SDS—PAGE鉴定。结果：①经RT—PCR、测序和酶切鉴定，成功地克隆了人nDOC—2基因。②经IPTG诱导的重组质粒pGEX—4T—nDOC—2表达出相对分子质量(Mt)约为5000的融合蛋白，与预期的结果相符。结论：成功克隆到人DOC—2氨基端PID结构域，并在E.coliDH5α中表达出GST-nDOC—2融合蛋白。     

一例ABO疑难血型基因分析

目的对一例血型血清学鉴定困难的患者进行相关基因分析,鉴定血型并分析引起血型鉴定困难的原因。方法采用微柱凝胶法和试管法进行血清学血型鉴定、抗球蛋白试验和抗体筛查,PCR扩增患者ABO基因第6、7外显子区及其侧翼序列并进行Sanger测序、克隆测序,寻找突变位点进行血型鉴定。结果患者血清学血型鉴定正反结果不符,其红细胞与单克隆抗A、B、H抗体反应均呈阴性(-);血清与A、B、O型红细胞均无凝集;患者直接及间接抗球蛋白试验均为阴性;血清抗体筛查为阴性。测序发现,患者ABO血型相关基因存在多个变异位点。其中第6外显子区存在c.261delG,第7外显子区存在c.467CCT、c.526CCG、c.657CT、c.703GGA、c.796CCA、c.803GG。以A101基因作为标准序列进行比较,对照Blood Group Antigen Gene Mutation Database进行ABO等位基因突变分析,判断患者血型为A102/B101。结论患者红细胞上抗原减弱是血型鉴定正反不符的主要原因,DNA基因测序第6、7外显子七个点突变导致了红细胞上抗原减弱。     

HLA—DPB131个等位基因的PCR—RFLP高分辨分型

本文报道建立了一种基于ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术的ＨＬＡ－ＤＰＲＢ１分型方法。经计算机分析而选出１０个限制性内切酶，在３１个ＤＰＢ１等位基因组成的４９６个ＤＰＢ１基因型中，可唯一性分辨４８４个。用于确定ＤＰＢ１基因型的３３个多态性酶切片段有２９个在８种纯合／杂合子分型细胞ＤＮＡ的ＤＰＢ１分型中得到验证。     

我国D2—43株PrM—E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性研究

目的 通过观察含我国登革2型病毒株（D2－43）的PrM-E基因的复制型SFV重组质粒DNA的免疫原性,为登革新型疫苗的研制提供依据。方法 将PrM-E基因自T载体上切下,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中。将此重组质粒DNA以电穿孔法导入BHK21细胞,表达产物的特异性用间接免疫荧光法进行鉴定。采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA,然后以不同剂量通过肌肉注射途径免疫Balb/c鼠,鼠血清中的抗体用间接免疫荧光法进行检测。结果 含PrM-E基因的重组SFV质粒DNA在BHK21细胞中可表达登革2型病毒的特异蛋白;经免疫Balb/c鼠后,鼠血清可与登革D2－43感染的C6／36抗原片起特异的抗原抗体反应。结论 含登革2型病毒PrM-E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb/c鼠中可诱导登革2型病毒特异抗体的产生,但抗体水平较低。