采用抗体芯片筛选鼻咽癌放射治疗抵抗相关的炎性因子

目的：采用抗体芯片筛选鼻咽癌放射治疗（放疗）抵抗相关的炎性因子。方法：以放疗抵抗鼻咽癌CNE2一IR细胞与放疗敏感鼻咽癌CNE2细胞的细胞蛋白质及其细胞培养上清为样本,采用抗体芯片fAAH,INF．3）比较炎性因子的表达差异,采用免疫组织化学方法检测差异炎性因子IL．8在放疗抵抗与敏感鼻咽癌组织（每组30例）中的表达。结果：炎性因子IL-8、粒细胞一巨噬细胞集落刺激（granulocyte．macrophagecolonystimulatingfactor,GM—CSF）和细胞间黏附分子．1fintercellularadhesionmolecule1,ICAM-1）在CNE2-IR细胞中的表达水平高于CNE2细胞,CNE2．IR细胞分泌的IL-．8和GM．CSF水平也高于CNE2细胞,而CNE2-IR细胞分泌的基质金属蛋白酶．2（matrixmetalloproteinase2,TIMP-2）水平低于CNE2细胞;IL-8在放疗抵抗鼻咽癌组织中的表达明显高于放疗敏感鼻咽癌组织。结论：IL-8,GM-CSF,ICAM-1和TIMP-2表达或分泌异常可能在鼻咽癌放疗抵抗中具有重要作用,为进一步研究鼻咽癌放疗抵抗的分子机制提供了新线索。     

鼻咽癌转移相关的分泌蛋白质的筛选

目的：筛选鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）转移相关的分泌蛋白质，为阐明NPC转移机制以及筛选NPC转移分子标志物提供实验依据。方法：应用二维凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）技术分离一对来自同一亲本，具有不同转移潜能的NPC细胞系5-8F和6-10B细胞的分泌蛋白质，图像分析识别差异表达的蛋白质点，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾-四极杆-串联质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)对差异表达的蛋白质点进行鉴定。Western印迹法检测差异分泌蛋白质nm23-H1在两株细胞中的表达水平。结果：建立了5-8F和6-10B分泌蛋白质的2-DE图谱，质谱分析鉴定出14个非冗余的分泌蛋白质，其中Oncoprotein18等蛋白质在高转移潜能NPC细胞系5-8F中的表达水平高于无转移潜能的NPC细胞系，而nm23-H1等蛋白质在5-8F细胞系中的表达水平低于6-10B细胞系。Western印迹分析证实了nm23-H1在5-8F和6-10B细胞分泌蛋白质中的差异表达水平。结论：所鉴定的14个非冗余的差异分泌蛋白质为研究NPC转移机制以及筛选NPC转移分子标志物提供了实验依据。     

鼻咽癌组织与正常鼻咽上皮组织的差异磷酸化蛋白质组分析

目的：比较鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)组织与正常鼻咽上皮组织磷酸化蛋白质组差异，筛选差异磷酸化蛋白质，为揭示NPC的发病机制提供依据。方法：采用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离NPC组织与正常鼻咽上皮组织的总蛋白质，蛋白质转膜后与抗酪氨酸磷酸化抗体进行Western印迹分析，图像分析识别差异磷酸化蛋白质点，电喷雾-四极杆-串联质谱（ESI-Q-TOF MS/MS）鉴定差异的酪氨酸磷酸化蛋白质，采用NetPhos软件预测蛋白质的酪氨酸磷酸化位点，并采用生物信息学方法对差异磷酸化蛋白质的功能和亚细胞定位进行分析。采用Western印迹检测差异蛋白质（phosphatidylethanolamine- binding protein 1）在正常鼻咽黏膜组织和鼻咽癌组织的总蛋白质中的磷酸化水平。结果：建立了NPC组织与正常鼻咽上皮组织的酪氨酸磷酸化蛋白质表达谱，识别了25个差异酪氨酸磷酸化蛋白质，共鉴定了13个差异酪氨酸磷酸化蛋白质，其中7个蛋白质的酪氨酸磷酸化水平在NPC组织中增强，而6个蛋白质的酪氨酸磷酸化水平降低。NetPhos软件预测和生物信息学分析结果显示，13个差异蛋白质均存在酪氨酸磷酸化位点，其功能涉及物质代谢、细胞结构、细胞防御以及信号转导。与正常鼻咽黏膜组织相比较，差异蛋白phosphatidylethanolamine-binding protein 1在鼻咽癌组织中磷酸化表达水平下调。结论： 鉴定了13个可能与NPC发病相关的酪氨酸磷酸化蛋白质，为揭示NPC发病机制提供了科学论依据。     

5-aza-2-dC处理鼻咽癌细胞前后的差异蛋白质组学研究

目的：比较5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-2-dC）处理鼻咽癌细胞前后蛋白质组的差异，为筛选鼻咽癌的甲基化失活基因提供依据。方法：用去甲基化药物5-aza-2-dC处理鼻咽癌细胞系5-8F细胞，应用双向凝胶电泳（2-DE）技术分离5-aza-2-dC处理与未处理5-8F细胞的蛋白质，PDQuest图像分析软件识别药物处理与未处理5-8F细胞的差异表达蛋白质点，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定差异表达的蛋白质。Western 印迹法检测差异蛋白质nm23-H1在药物处理与未处理5-8F细胞中的表达水平。结果：建立了5-aza-2-dC处理与未处理5-8F细胞蛋白质的2-DE图谱，识别了49个差异表达的蛋白质点，鉴定了33个差异表达的蛋白质，其中15个蛋白质在5-aza-2-dC处理5-8F后表达上调。Western 印迹分析证实了nm23-H1在药物处理与未处理5-8F细胞中的差异表达水平。结论：15个5-aza-2-dC处理后表达上调蛋白质的编码基因可能是5-8F细胞的甲基化沉默基因。     

蛋白质组学技术分析5-aza-2dC处理白?∠赴鸋L-60前后的差异表达蛋白质

目的：研究甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycitydine, 5-aza-2dC)对人急性髓系白血病细胞HL-60细胞蛋白质表达谱的影响，探讨5-aza-2dC抗急性髓系白血病作用机制。方法：采用二维凝胶电泳（2-DE)技术分离5-aza-2-dC处理与未处理HL-60细胞的总蛋白质，PDquest 图像分析软件识别差异蛋白质点，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点。 然后采用Western 印迹检测差异蛋白质半乳糖凝集素1（Galectin-1） 在药物处理与未处理HL-60细胞中的表达水平。结果： 建立了5-aza-2dC 处理与未处理HL-60 细胞蛋白质的2-DE 图谱，识别了35个差异表达的蛋白质点，鉴定了27个差异表达的蛋白质，其中包括Galectin-1在内的21个蛋白质在5-aza-2dC 处理后的HL-60 细胞中表达上调，6个蛋白质表达下调或缺失。Western 印迹结果证实Galectin-1在5-aza-2dC 处理HL-60细胞中表达上调。结论：21个表达上调蛋白质的编码基因可能是HL-60细胞的甲基化失活基因，它们可能与急性髓系白血病发病以及5-aza-2-dC抗人急性髓系白血病细胞作用有关     

可视化鼻咽癌细胞模型CNE2-EGFP的建立

目的利用pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,建立稳定表达绿色荧光蛋白的鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP．为整体鼻咽癌可视化研究提供良好的试验材料。方法利用脂质体转染法,将pEGFP—N1质粒转染鼻咽癌细胞株．通过G418抗性筛选、亚克隆扩增获得GFP稳定表达的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP。结果成功获得多个稳定表达GFP的人鼻咽癌细胞CNE2-EGFP细胞株,比较CNE2和CNE2-EGFP发现,两者生长曲线、细胞周期分布、裸鼠成瘤能力等均无显著性差异。结论建立了非G418依赖、稳定表达GFP且保持母株细胞特性的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP,为鼻咽癌整体可视化研究打下了坚实的基础。     

p53沉默对人鼻咽癌细胞株CNE2放射生物学特性的影响

目的：研究p53沉默对鼻咽癌(NPC)细胞株CNE2放射敏感性的影响，探讨NPC中过表达的p53蛋白是否参与了放射诱导的细胞损伤和凋亡过程。方法：以稳定干扰p53基因表达的鼻咽癌细胞株CNE2sip53和对照细胞株CNE2/pSUPER为对象，采用集落存活分析法分析在不同放射剂量照射后的细胞存活分数(SF)并计算放射生物学参数D0, α, β和放射敏感比(SER)；采用MTT法检测放射线对细胞生长的影响；采用流式细胞术检测放射线对细胞周期及凋亡的影响。 结果：CNE2sip53细胞照射后的SF值高于CNE2/pSUPER细胞；与CNE2/pSUPER细胞相比，CNE2sip53细胞D0值和SF2值均增大，而α值, β值和SER均减小； 放射线诱导CNE2sip53细胞凋亡及对细胞增殖的抑制作用弱于其对CNE2/pSUPER细胞的作用；放射线诱导CNE2/pSUPER细胞阻滞于G1期，而诱导CNE2sip53细胞阻滞于G2期。 结论：稳定沉默鼻咽癌细胞中p53基因表达后，细胞对放射的敏感性降低，提示NPC细胞中过表达的p53蛋白参与了放疗诱导的NPC细胞损伤和凋亡过程。     

甲胺磷单克隆抗体制备及鉴定

目的：制备并鉴定甲胺磷农药单克隆抗体。方法：用500mg/mL PEG 4000作融合剂进行细胞融合，HAT（H，次黄嘌呤；A，氨基喋呤;T,鹃腺嘧啶）培养基选择性培养，自制的显微操作装置进行亚克隆。用间接ELISA（酶联免疫吸附测定）和间接竞争ELISA方法对2株细胞进行鉴定，并测定与其它农药的交叉反应率。结果：得到2株稳定分泌甲胺磷抗体的单克隆细胞株，命名为1C3和2C6；间接ELISA法表明2株细胞与载体牛血清蛋白质（Bovine serum albumin,BSA)和卵清蛋白质（Ovalbumin,OVA)反应成阴性；间接竞争ELISA法表明2株细胞上清液内的抗体可以竞争性地与甲胺磷结合；2株单克隆细胞均系IgG1亚类；1C3细胞诱导腹水纯化后的抗体与其它有机磷农药几乎没有交叉反应。结论：成功制备2株分泌抗甲胺磷抗体的单克隆细胞株，并可用于检测甲胺磷的研究。     

HCV患者外周血单个核细胞蛋白质表达质谱分析

目的:应用比较蛋白质组学的方法分析丙型肝炎患者外周血单个核细胞蛋白质表达模式的变化及寻找丙型肝炎相关生物标记分子,进一步识别鉴定其差异表达蛋白质,分析其对丙型肝炎慢性化机制的意义.方法:应用固相化pH梯度双向凝胶电泳(2-DE)分离健康者(10)及HCV患者(28)PBMC的总蛋白质,凝胶银染显色后,PDQuest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得差异蛋白点的肽质指纹图谱,通过SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质.结果:得到两张2-DE图谱,HCV患者及健康者PBMC凝胶的蛋白质点数分别为625及614;初步筛选出HCV患者与健康者存在明显差异的12个蛋白点,经质谱分析,初步鉴定了10种蛋白质.这些差异蛋白质包括病毒蛋白、蛋白质合成与分解、三大代谢相关酶类、细胞结构相关蛋白质以及信号转导相关蛋白质.结论:应用2-DE及MALDI-TOF-MS方法建立了HCV患者PBMC双向凝胶电泳图谱,分离并初步鉴定了10种与HCV感染相关的差异表达的蛋白质,为研究HCV慢性化相关机制提供新的线索.     

汉防己甲素对人鼻咽癌细胞株的放射增敏作用及其机制

 目的：探讨汉防己甲素（Tet）对人鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2的放射增敏作用及其机制。方法：MTT法检测细胞增殖抑制作用,克隆形成实验比较细胞放射敏感性,流式细胞术检测细胞周期分布。结果：Tet对CNE1和CNE2细胞的最大非细胞毒性剂量分别为1.5 μmol/L和1.8 μmol/L,该浓度的Tet联合放射线照射与单纯放射线照射相比,在培养至第4~6 d能明显抑制细胞增殖（P<0.01）。CNE1和CNE2细胞单纯放射线照射组平均致死剂量（Do）分别为(1.26±0.02) Gy和(2.27±0.04) Gy,Tet联合放射线照射组Do分别为(0.73±0.05) Gy和(1.61±0.08) Gy,放射增敏比分别为1.73和1.40（P<0.05）。单纯放射线照射组CNE1和CNE2细胞周期分布以G₂期为主,分别为(42.62±2.07)%和(34.82±2.74)%,Tet联合放射线照射组CNE1和CNE2 G₂期比例分别为(17.02±1.87)%和(19.64±4.82)%（P<0.01）。结论：Tet能增加人鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2对放射线照射的敏感性,机制可能与去除放射线照射诱导的G₂期阻滞有关。     

不同临床类型原发鼻咽癌组织差异表达蛋白

 目的 寻找上行型、下行型和混合型不同临床类型鼻咽癌原发病瘤灶组织中的差异表达蛋白。方法 采用双向凝胶电泳对不同临床类型鼻咽癌患者的鼻咽癌组织和正常人鼻咽组织总蛋白进行分离,对比找出差异表达蛋白质斑点,结合基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析技术和数据库信息检索鉴定差异蛋白点。结果 与正常组比较,混合型鼻咽癌组出现31个差异蛋白质点,其中18个表达上调,13个表达下调;从混合型鼻咽癌组选择10个差异蛋白质斑点进行质谱鉴定,成功鉴定出5个,其中表达上调的有热休克固有蛋白、α1抗胰蛋白酶和巨噬细胞帽蛋白;表达下调的有S100A9蛋白和 蛋白4.1。与下行型鼻咽癌组比较,上行型鼻咽癌组出现31个差异表达蛋白点,其中15个表达上调、16个表达下调;从上行型组选择10个差异蛋白质斑点进行质谱鉴定,成功鉴定出6个,其中表达上调的有线粒体顺乌头酸酶、乙醇脱氢酶、Rab GDP解离抑制因子β;表达下调的有NM23-H1、核氯离子通道蛋白27和乙醛脱氢酶X。结论 不同临床类型鼻咽癌患者肿瘤转移相关蛋白、能量代谢蛋白、解毒蛋白与抗肿瘤转移蛋白表达水平存在差异,这些蛋白可作为临床分型标记物。     

Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach

Proteins secreted by Mycobacterium tuberculosis are usually targets of immune responses in the infected host. Here we describe a search for secreted proteins that combined the use of bioinformatics and phoA' fusion technology. The 3,924 proteins deduced from the M. tuberculosis genome were analyzed with several computer programs. We identified 52 proteins carrying an NH(2)-terminal secretory signal peptide but lacking additional membrane-anchoring moieties. Of these 52 proteins-the TM1 subgroup-only 7 had been previously reported to be secreted proteins. Our predictions were confirmed in 9 of 10 TM1 genes that were fused to Escherichia coli phoA', a marker of subcellular localization. These findings demonstrate that the systematic computer search described in this work identified secreted proteins of M. tuberculosis with high efficiency and 90% accuracy.     

基于TMT标记定量蛋白组学分析SATB1过表达前后鼻咽癌细胞中差异蛋白质及信号富集

目的:分析富含AT序列的特异性核基质区结合蛋白1(SATB1)表达改变对人鼻咽癌(NPC)细胞中蛋白表达谱特征的影响,并采用生物信息学富集分析差异信号通路。方法:利用SATB1过表达慢病毒和阴性对照慢病毒感染CNE1细胞,获得稳定表达细胞系。提取2组细胞的总蛋白,利用TMT标记蛋白定量技术和串联质谱分析技术筛选出差异表达蛋白,采用RT-qPCR对差异蛋白编码基因在mRNA水平进行定量验证;应用GO数据库对差异表达蛋白进行注释和富集分析,应用KEGG数据库对差异蛋白涉及信号通路进行富集分析。结果:SATB1过表达慢病毒感染CNE1细胞后获得稳定表达细胞系。与对照组相比,过表达SATB1的CNE1细胞鉴别出278个差异表达蛋白,其中115个表达上调,163个表达下调;采用RT-qPCR对10个代表性差异蛋白的编码基因进行mRNA水平的验证,其结果与蛋白组学结果具有一致性。GO数据库分析差异表达蛋白主要参与了细胞过程、单有机体过程、生物调控和代谢过程,发挥生物分子结合和催化等分子功能;细胞组件主要存在于细胞部分、细胞以及细胞器上。KEGG数据库分析显示差异表达蛋白参与和肿瘤关系密切的信号通路,主要有MAPK、PI3K-Akt、AMPK、JAK-STAT、p53、PPAR、Hippo和HIF-1通路等。结论:SATB1过表达后明显改变了NPC细胞中蛋白表达谱并影响多条与肿瘤关系密切的信号通路。蛋白组学筛查也为NPC的发病分子机制、治疗和预后标靶筛查提供了可能的宏观手段。     

端粒酶RNA反义核酸降低鼻咽癌细胞p53蛋白表达水平

目的:研究端粒酶活性抑制后鼻咽癌细胞p53蛋白表达水平的变化。方法:脂质体介导端粒酶反义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞株,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫组化法检测端粒酶逆转录酶(hTRT)和p53蛋白表达水平。结果:端粒酶RNA反义寡核苷酸可抑制CNE1和CNE2Z细胞的增殖并呈剂量依赖性,流式细胞仪检测出现凋亡峰,反义寡核苷酸组hTRT和p53蛋白表达水平显著低于其它处理组及空白对照组(P＜0.01)。结论:端粒酶RNA反义寡核苷酸抑制鼻咽癌细胞端粒酶活性后可降低p53蛋白表达水平。