小鼠侵袭性肺曲霉病发病过程中TLRs/NF-κB信号通路的激活

目的:研究小鼠侵袭性肺曲霉病(IPA)发生过程中TLRs/NF-κB信号通路的激活,探讨IPA的发病机理。方法:小鼠随机分为正常组(N)、正常接菌组(N+Af)和IPA模型组(IPA),经鼻吸入烟曲霉(Af)孢子后在不同时相点处死小鼠,无菌取肺组织行病理切片、Af菌落计数,RT-PCR法检测TLR2和TLR4 mRNA、蛋白印迹法检测NF-κBp65、IL-1β的表达。结果:(1)鼻吸入Af后72小时时,IPA组肺组织出现严重炎症反应,并有大量的菌丝生成,同时各时相点的菌负荷均高于N+Af组;(2)与N+Af组比较,IPA组TLR2 mRNA后期异常高表达,TLR4 mRNA持续低表达,NF-κBp65早期骤然升高后又持续下降,IL-1β一直呈低表达状态。结论:TLRs的异常激活导致宿主下游信号的低反应性,宿主不能清除Af促使了IPA的发生发展。     

侵袭性肺曲霉病发生发展过程中TLRs/NF-κB信号通路的激活和不同功能细胞因子的产生

目的 研究小鼠侵袭性肺曲霉病(IPA)发生过程中TLRs/NF-κB信号通路的激活和不同功能细胞因子的产生情况,探讨IPA的发病机制.方法 小鼠随机分为正常组、正常+接种烟曲霉菌组(正常接菌组)和免疫抑制+接种烟曲霉菌组(IPA模型组),经鼻吸入烟曲霉孢子后在不同时相点处死小鼠,无菌取肺组织分别进行病理切片,烟曲霉菌落计数,RT-PCR法、Western blot法动态检测小鼠感染烟曲霉菌过程中肺组织TLR2、TLR4 mRNA表达、NF-κB p65蛋白、促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及抗炎细胞凶子IL-10含量的变化规律.结果 (1)鼻吸入烟曲霉菌后72 h,IPA模型组肺组织出现严重炎症反应,并有大昔的菌丝生成,同时各时相点的烟曲霉菌负倚均高于正常接菌组;(2)与正常接菌组比较,IPA组TLR2 mRNA感染早期(24 h)低表达,感染后期(120 h、144 h)高表达;而TLR4mRNA则在感染过程中一直处于低表达状态;NF-κB p65感染早期(24 h)骤然升高后持续下降.(3)正常小鼠感染烟曲霉菌后,肺组织巾促炎细胞因子TNF-α、IL-1β在感染早期皆呈高表达,且最高表达量均出现在48 h或72 h,随后下降并恢复至正常水平.同时感染后期抗炎细胞因子IL-10表达水平升高;而IPA小鼠在感染甲.期抗炎症细胞因子IL-10大量释放,后期显著降低,促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β缓慢且低水平释放.结论 TLRs/NF-κB信号通路的异常激活,引起促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间失去动态平衡,可能是导致侵袭性肺曲霉病发生发展的原因之一.

Abstract：

Objective To study the activation of TLRs/NF-κB signal pathway and production of different functional cytokines during invasive pulmonary aspergillosis( IPA) , in order to probe the pathogene-sis of IPA. Methods Mouse were randomly divided into normal, normal + inoculated with Aspergillus fumigatus( normal inoculation group), and immune suppression + inoculation with Aspergillus fumigatus (IPAmodel group) , the mouse were killed at different time points after inhaling Aspergillus fumigatus spores by nose. Removing the lung tissue in a sterile manner and making pathological section respectively, counting Aspergillus fumigatus colony, dynamiclly detecting the expression of TLR2, TLR4 mRNA, variation of NF-κB p65 protein, pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and anti-inflammatory cytokines IL-10 levels in the lung tissue by RT-PCR and Western blot method during Aspergillus fumigatus infection in mouse. Results (1) When it's 72 h after inhaling Aspergillus fumigatus by nose, IPA model emerged severe lung tissue inflammation, and generated a large number of hyphae, meanwhile, burthen of Aspergillus fumigatus was higher than normal inoculation group at each time point. (2)Compared with the normal inoculation group, IPA group whose TLR2 mRNA was low expression at early stage of infection (24 h), and emerged high expression at late stage of infection (120 h, 144 h); and TLR4 mRNA has been at a state of low expression in the infection process; NF-κB p65 suddenly increased at early stage of infection(24 h) and then continued to decline. (3) After infected by Aspergillus fumigatus in normal mouse, proinflammatory cytokine TNF-α, IL-1β in lung exhibited high expression at the early stages of infection, and the highest expression levels appeared at 48 h or 72 h, then decreased and recovered to normal level. And the expression level of anti-inflammatory cytokine IL-10 rised at late stage of infection; The IP A mouse released a lot of anti-inflammatory cytokine IL-10 at early stage of infection, which significantly reduced at late stage, and released pro-inflammatory cyto-kines TNF-α, IL-1β at slow and low level. Conclusion The abnormal activation of TLRs/NF-β signaling pathway caused the loss of dynamic balance between pro-inflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines, leading to the occurrence and development of IPA.     

烟曲霉菌感染小鼠肺组织中NOD1信号通路的激活

目的研究天然免疫NOD1信号通路在烟曲霉菌感染小鼠肺组织中是否得以激活。方法小鼠分为正常对照组和感染组,感染组小鼠经鼻滴入烟曲霉菌孢子24 h、48 h、72 h后分别处死,碾碎肺组织平板培养以检测其肺组织烟曲霉菌负荷,观察肺组织病理学改变,RT-PCR检测NOD1及RIP2 mRNA表达量、Western Blot检测胞核NF-κBp65和胞浆TNF-α在小鼠肺组织中的含量。结果①感染组小鼠肺组织48 h时Af负荷达最高且可见严重的充血和出血,有大量的炎症细胞浸润,72 h时Af负荷迅速下降且未见菌丝形成,仅见轻微的充血、出血和炎症反应;正常组烟曲霉菌培养阴性且肺组织结构正常;②RT-PCR及Western Blot结果显示:感染组小鼠肺组织各时相点NOD1 mRNA、RIP2 mRNA、NF-κBp65和TNF-α的表达量均明显高于正常对照组(P<0.05),前三者均在48 h表达最高,TNF-α在72 h表达最高(P<0.05)。结论NOD1信号通路在烟曲霉菌感染的小鼠肺组织中得以活化,其介导的天然免疫对抗烟曲霉菌感染和保护小鼠肺组织起了一定的作用。     

侵袭性肺曲霉病小鼠模型构建及γ-干扰素、Toll样受体2,4的表达

背景:曲霉菌病现已成为主要的肺部真菌感染性疾病,其临床症状、体征和影像学改变缺乏特异性,并且难以获得组织和细菌学的证实,因此临床常常延误诊断和治疗。因此构建侵袭性肺曲霉病动物模型,研究其发病机制和新的治疗手段十分必要。目的:构建侵袭性肺曲霉病小鼠模型,检测γ-干扰素、Toll样受体2,4的表达,探讨其在侵袭性肺曲霉病中的作用机制。方法:75只清洁级6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分成5组,分别为空白对照组(A组)、高浓度烟曲霉菌孢子悬液免疫抑制模型组(B组)、高浓度烟曲霉菌孢子悬液正常感染组(C组)、低浓度烟曲霉菌孢子悬液免疫抑制模型组(D组)、低浓度烟曲霉菌孢子悬液正常感染组(E组),每组15只。首先对B、D组腹腔注射环磷酰胺复制免疫抑制模型。D、E组和B、C组分别用雾化器雾化108 cfu/mL、109 cfu/mL的孢子悬液12 mL,A组以灭菌PBS代替孢子悬液。感染第1,3,5天,观察各组小鼠肺组织病理形态学改变;检测肺泡灌洗液中γ-干扰素的质量浓度及肺组织中γ-干扰素mRNA的表达;检测肺组织中Toll样受体2,4 mRNA和Toll样受体2,4蛋白的表达。结果与结论:B组小鼠肺组织可见肺脓肿,可见到孢子以及较严重的出血和充血,肺泡间隔增宽,气管上皮细胞脱落坏死。与A组对比,B组支气管肺泡灌洗液中的γ-干扰素质量浓度与肺组织中γ-干扰素mRNA在第5天的表达量显著降低(P0.05)。B组Toll样受体2呈强阳性表达,C组Toll样受体2阳性表达率低于B组(P0.05);B、C组Toll样受体4均呈阳性表达,C组阳性表达率高于B组(P0.05)。B组在1,3,5 d时肺组织中Toll样受体2,4 mRNA表达均显著增加(P0.05)。提示对免疫抑制小鼠雾化高浓度烟曲霉菌孢子悬液能建立具有典型病理特征的稳定的侵袭性肺曲霉病模型。烟曲霉菌的感染可以同时激活Toll样受体2,4,其致病机制与机体的免疫防御功能密切相关。     

TLR4基因沉默下调TLR2信号通路在RAW264.7细胞中的抗烟曲霉孢子刺激作用

目的 研究单核巨噬细胞RAW264.7受烟曲霉孢子刺激时,TLR2和TLR4信号通路发挥的作用,以及沉默TLR4基因后,对TLR2信号通路的影响.方法 利用RNAi技术将TLR4-siRNA转染RAW264.7细胞24h后给予烟曲霉孢子刺激12h,将细胞随即分为正常组(N组)、正常+烟曲霉孢子刺激组(N+Af组)、正常+TLR4-siRNA组[TLR4(RNAi)组]、正常+TLR4-siRNA+烟曲霉孢子刺激组[ TLR4(RNAi) +Af组],RT-PCR和Western blot法检测细胞受烟曲霉孢子刺激后TLR2、TLR4、MyD88 mRNA及TNF-α蛋白的表达变化.结果 (1)TLR4基因沉默前:与N组比较,N+Af组TLR2、TLR4、MyD88 mRNA及TNF-α蛋白表达量均显著升高(P＜0.05).(2)TLR4-siRNA( 100nmoL/L)转染RAW264.7细胞,沉默效率达83％.(3)TLR4基因沉默后:与N组比较,TLR4( RNAi)组TLR2、MyD88 mRNA的表达量均显著降低(P＜0.05);与N+Af组比较,TLR4( RNAi)+Af组的TLR2、MyD88 mRNA和TNF-α蛋白的表达量均显著降低(P＜0.05);与TLR4( RNAi)组比较,TLR4(RNAi)+ Af组MyD88 mRNA表达量显著升高(P＜0.05),而TLR2 mRNA及TNF-α蛋白表达量却无显著变化(P＞0.05).结论 RAW264.7细胞受烟曲霉孢子刺激时,TLR2和TLR4信号通路被激活,通过释放促炎细胞因子TNF-α发挥抗烟曲霉孢子刺激作用;当沉默TLR4基因后,TLR2信号通路不能被很好地激活来抵抗烟曲霉孢子对细胞的刺激作用,沉默TLR4基因下调了TLR2信号通路在RAW264.7细胞中的抗烟曲霉孢子刺激作用,可能TLR4较TLR2在抵抗烟曲霉孢子刺激时发挥更重要的作用.     

MPO及TNF-α在小鼠侵袭性肺曲霉病中的作用

烟曲霉菌是自然界广泛存在的腐生致病菌,易导致免疫力低下患者发生严重且致死性的侵袭性肺曲霉病(IPA).通过建立小鼠侵袭IPA模型,探讨髓过氧化物酶(MPO)及TNF-α在侵袭IPA中的作用,为阐明IPA的发病机制提供资料.     

不同免疫状态小鼠烟曲霉感染后肺组织dectin-1 mRNA表达

目的 研究不同免疫状态小鼠感染烟曲霉后肺组织dectin-1 mRNA表达变化.探讨免疫抑制剂对dectin-1表达的影响与疾病发展的相互关系.方法 小鼠分4组:正常对照组、免疫抑制组、免疫抑制种菌组及免疫正常种菌组.采用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠不同时间点肺组织dectin-1 mRNA表达.同时进行肺组织真菌载量测定观察疾病发展情况.结果 小鼠感染烟曲霉后第3天,免疫抑制种菌组菌载量明显高于正常种菌组.在感染后第1天及第3天,免疫抑制组小鼠肺组织dectin-1表达较正常对照组明显降低;第3天,免疫正常种菌组表达较正常对照组及免疫抑制种菌组明显升高(P<0.05).结论 对于免疫正常宿主,dectin-1可能在防御烟曲霉感染中起重要作用.环磷酰胺可降低肺组织dectin-1 mRNA表达,可能与其促发侵袭性肺曲霉病有关.     

慢性乙型肝炎病毒感染树鼩Kupffer细胞TLR2和TLR4的表达及其意义

目的探索慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染树鼩Kupffer细胞Toll样受体(TLR)家族中的TLR2和TLR4在mRNA水平的表达情况及其对Kupffer细胞功能的影响。方法树鼩分为确定慢性感染HBV的树鼩、疑似慢性感染HBV的树鼩和未接种HBV的正常对照树鼩。全部动物定期抽血和进行肝活检手术,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析血清和肝组织的HBV DNA水平;对手术切取的树鼩肝组织进行Kupffer细胞的分离、纯化和原代培养,采用qRT-PCR检测TLR2、TLR4以及TNF-α的mRNA表达水平;采用迁移实验及溶酶体荧光探针等方法分析TLR2和TLR4对Kupffer细胞迁移能力及溶酶体数量的影响。结果确定慢性感染HBV的树鼩TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表达水平均低于疑似慢性感染HBV的树鼩和未接种HBV的正常对照树鼩(P0.05),表达水平均与动物肝组织的HBV DNA拷贝数呈负相关(P0.05),与Kupffer细胞的细胞迁移数、溶酶体密度及TNF-αmRNA表达水平呈正相关(P0.05)。结论 Kupffer细胞中的TLR2和TLR4可能通过影响Kupffer细胞功能而参与树鼩HBV感染后肝脏病变的慢性化发展过程。     

革兰氏阴性、阳性菌感染后外周血单个核细胞TLR4、TLR2的表达

目的:研究革兰氏阴性菌(G- 菌)、革兰氏阳性菌(G+ 菌)感染患者与正常人外周血单个核细胞Toll样受体4(TLR4 )mRNA、TLR2mRNA的表达情况。方法:提取经检验科体液镜检或培养阳性,证实为G- 菌、G+ 菌感染患者35例,正常对照2 4例。运用Taqman实时定量PCR方法测定G- 菌、G+ 菌感染患者外周血单个核细胞的TLR4mRNA、TLR2mRNA并测定表达水平,正常人作为对照。结果:G- 菌感染患者较正常对照和G+ 菌感染外周血单个核细胞TLR4mRNA表达显著升高(P <0 .0 1) ;G- 菌感染伴发热较不伴发热患者TLR4表达显著升高(P <0 . 0 1)。G+ 菌感染患者TLR4表达与正常对照无显著差异(P>0 .0 5 )。G+ 菌、G- 菌感染患者和正常对照之间TLR2mRNA表达无显著差异(P >0 . 0 5 )。结论:TLR4在G- 菌感染患者外周血单个核细胞中表达升高,在G- 菌感染伴发热的患者中升高尤为显著,表明TLR4是G- 菌的识别受体。在临床上当G- 菌感染尚未或不能证实时,可通过TLR4mRNA表达水平的检测,为患者是否存在G- 菌感染提供依据。     

TLR2和TLR4在原发性肝癌中的表达

目的：本研究通过检测原发性肝癌Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）的表达，分析其与临床病理生理因素的关系，探讨TLR2，TLR4在原发性肝癌疾病过程中的可能作用。方法：采用免疫组化法和实时荧光定量PCR分别在蛋白水平及mRNA水平检测原发性肝癌组织和配对癌旁组织TLR2、TLR4的表达。结果：原发性肝癌组织在蛋白水平和mRNA水平TLR2和TLR4的表达均明显低于癌旁组织（P<0.01）。但免疫组化结果显示不论是肝癌组织还是癌旁组织，TLR2和TLR4的表达均明显高于正常肝组织（P<0.01，P<0.05），有门静脉分支癌栓的患者癌组织TLR4的表达强度低于无门静脉分支癌栓的患者（P<0.05）。结论：肝癌组织TLR2和TLR4的表达与癌旁组织相比受到相对抑制，但高于正常肝组织，TLR2和TLR4信号途径可能参与了原发性肝癌的病理过程。     

Toll样受体4与肿瘤坏死因子α在脑缺血再灌注小鼠顶叶皮质神经元中的表达及意义

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)在脑缺血再灌注损伤炎症反应中的作用.方法:采用TLR4抗体封闭TLR4受体,H-E染色观察小鼠顶叶皮质组织病理学改变、免疫印迹法检测顶叶皮质TLR4蛋白表达、RT-PCR检测顶叶皮质TLR4 mRNA表达量、免疫组织化学显色法检测顶叶皮质TNF-α表达情况,TLR4 mRNA表达水平与TNF-α含量相关分析.小鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和TLR4阻断组,各组又分12、 24、 48、 72h 4个时间点组.结果:缺血再灌注组TLR4蛋白、TLR4 mRNA、 TNF-α表达水平明显高于假手术组表达水平,而TLR4阻断组TLR4蛋白、TLR4 mRNA、 TNF-α表达水平明显低于缺血再灌注组,相关分析表明,TLR4 mRNA表达水平与TNF-α含量呈显著正相关.结论:缺血再灌注可激活TLR4,TLR4在脑缺血再灌注损伤中起重要作用;炎性因子TNF-α的产生、分泌可能与TLR4 mRNA表达存在着密切联系.     

TLR4参与脑缺血再灌注小鼠海马细胞凋亡

目的探讨Toll样受体4(TLR4)在小鼠脑缺血再灌注损伤中对细胞凋亡的影响。方法昆明小鼠90只,随机分为:假手术组、缺血再灌注组、TLR4抗体阻断组,每组依据缺血后再灌注6h、12h、24h、48h、72h不同时间点再分五个小组。采用免疫组织化学方法,Western blot方法检测Caspase-3在各组海马不同再灌注时间点的表达变化,应用TUNEL法检测海马细胞凋亡情况。结果缺血再灌注组Caspase-3蛋白表达量和凋亡细胞数明显高于假手术组(p<0.01),而TLR4阻断组Caspase-3蛋白表达量和凋亡细胞数则明显少于缺血再灌注组(p<0.01)。结论阻断TLR4可减少脑缺血再灌注损伤中的细胞凋亡。     

LPS对MRL/MpJ小鼠脾T细胞表达TLR4和TNFα的影响

研究Toll样受体 4 (TLR4 )在MRL/MpJ小鼠脾细胞的表达状况和革兰阴性菌脂多糖 (LPS )刺激后TLR4的表达变化以及对TNF α产生的影响。MRL/MpJ小鼠经腹腔注射LPS后在不同时间取脾细胞 ,用三色荧光标记流式细胞仪技术检测小鼠脾T细胞TLR4的表达情况 ,并与BALB/c小鼠作对照 ;通过RT PCR观察LPS刺激前后脾T细胞TNF αmRNA的表达变化。结果表明TLR4在MRL/MpJ小鼠CD3+ CD4 + T细胞和CD3+ CD8+ T细胞中均有表达 ;但TLR4 + /CD4 + 细胞表达仅BALB/c小鼠的 33% ,在受LPS刺激后 ,MRL/MpJ鼠CD4 + T细胞TLR4升高时间较BALB/c小鼠延迟 ;CD8+ T细胞TLR4在LPS刺激前后无明显变化 ;脾细胞TNF αmRNA水平升高亦延迟。通过对干燥综合征样自身免疫病鼠模型MRL/MpJ小鼠脾T细胞TLR4的表达及功能研究 ,将有助于认识天然免疫和获得性免疫间的联系和感染在自身免疫病发病中的作用。     

卡介苗对hPBMC的TLR4表达调节及其免疫活化作用的研究

目的:了解卡介苗对人外周血单个核细胞( hPB-MC) TLR4的表达调节,以及BCG介导免疫细胞活化效应的新机制.方法:研究BCG对hPBMC的TLR4表达的调节,以及对表达TLR4的淋巴细胞的免疫活化效应,以(hPBMC+PBS)作为空白对照组,应用流式细胞仪对TLR4进行检测,ELISA方法测定BCG刺激组与对照组的IFN-γ和TNF-α的表达.结果:经过BCG刺激后,TLR4表达大大增加(P＜0.01),且随时间增加而增强,在72 h时,BCG组的TLR4表达率为(44.73±0.0066)％,而对照组的表达率仅为(1.02±0.0024)％.BCG可以促进淋巴细胞增殖,且这种增强作用也存在一定时间依赖性,在BCG与hPBMC共同孵育24h、48h和72h后,BCG组IFN-γ和TNF-α的表达量显著高于对照组(PBS组),差异有统计学意义(P＜0.05),且这种增强作用存在一定的时间依赖性.结论:BCG对hPBMC的TLR4表达有正调节作用,并加强表达TLR4的hPBMC的免疫活化作用.     

Toll-like receptor 4 (TLR4), but not TLR3 or TLR9, knock-out mice have neuroprotective effects against focal cerebral ischemia

Toll-like receptors (TLRs) are signaling receptors in the innate immune system that is a specific immunologic response to systemic bacterial infection. We investigated whether cerebral ischemia induced by the middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 2 h differed in mice that lack a functional TLR3, TLR4, or TLR9 signaling pathway. TLR4, but not TLR3 or TLR9, knock-out (KO) mice had significantly smaller infarct area and volume at 24 h after ischemia-reperfusion (I/R) compared with wild-type mice. In addition, TLR4 KO mice improved in neurological deficits after I/R compared with wild-type mice. Moreover, we investigated the expression of TLR4 in the ischemic brain with immunohistochemistry. The number of TLR4-positive cells gradually increased from 1 h after MCAO to 22 h after I/R. We also examined the localization of TLR4 in the ischemic area. TLR4 was localized with CD11b-positive microglial cells in the ischemic striatum and the number of CD11b-positive microglial cells was smaller in TLR4 KO mice than in wild-type mice. In addition, we investigated the translocation of NF-κB among TLR3, 4, and 9 KO mice after I/R injury using western blotting. NF-κB's p65 subunit was decreased in TLR4 KO mice compared to wild-type mice, but not TLR3 or 9 KO mice. These data suggest that TLR4 knockout, but not TLR3 or TLR9 knockout, may play a neuroprotective role in ischemic brain injury induced by MCAO in mice.     

ox-LDL对巨噬细胞Toll样受体和炎症反应的影响以及GW1929的干预作用

目的： 研究ox-LDL对巨噬细胞TLR2、TLR4表达和TNF-α、L-10、IL-12、NO以及MDA生成的影响并观察GW1929的干预作用。方法: ox-LDL（50 mg/L；100 mg/L）、GW1929（20 μmol/L）作用于小鼠腹腔巨噬细胞24 h后，测定培养液上清中MDA（TBA法）和NO（硝酸盐还原酶法）以及TNF-α、 IL-10和 IL-12（ELISA法）的浓度。采用流式细胞技术观察ox-LDL（50 mg/L）作用于小鼠腹腔巨噬细胞6 h、12 h及 24 h后TLR2、TLR4的表达。结果: ox-LDL（50 mg/L，100 mg/L）组MDA、NO-2/NO-3、TNF-α以及IL-10的浓度均明显高于control与GW1929组；而ox-LDL（50 mg/L，100 mg/L）+GW1929组以上指标的浓度分别明显低于ox-LDL（50 mg/L，100 mg/L）组；各组培养液中均无检测到IL-12的生成。ox-LDL(6 h、12 h、24 h)组以及ox-LDL+GW1929(6 h、12 h、24 h)组TLR-2 、TLR4的表达明显高于control与GW1929组。其中，ox-LDL+GW1929(6 h、12 h、24 h)3组TLR-2的表达分别低于ox-LDL(6 h、12 h、24 h)组；ox-LDL+GW1929(12 h)组TLR-4的表达明显低于ox-LDL(12 h)组。(P<0.05)。结论: ox-LDL上调了巨噬细胞TLR2及TLR4的表达，促进巨噬细胞活性氧、NO以及细胞因子TNFα、IL-10的生成，GW1929对抗了ox-LDL在以上过程中的作用。     

TLR4在LPS诱导的结肠炎症恢复中的作用

目的:研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR-4)在结肠炎症中的作用,探讨LPS在炎症性肠病中的治疗作用。方法:取正常肠上皮细胞进行体外脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)干预培养。采用慢病毒转染技术,构建TLR4低表达、正常表达及高表达的肠上皮细胞亚组。正常表达组(normal组)及高表达组(high组)培养基中加入LPS诱导细胞炎症,刺激时间分别为0、2、4 h。Western blot法检测TLR4的表达;收集细胞上清液,ELISA检测各亚组细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-8的水平。收集细胞,qPCR检测细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1βmRNA的表达水平。划痕试验观察对比2组细胞的迁移能力。结果:LPS干预培养细胞后,TLR4的表达量显著增加(P0.05)。ELISA和qPCR检测高表达组与正常表达组组间细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1β的蛋白和mRNA水平的差异均有统计学意义(P0.05)。划痕试验提示TLR4高表达组的细胞迁移能力明显高于正常对照组。结论:LPS影响TLR4炎症通路的活化,促进前炎症因子及辅助刺激分子的释放,起到调节炎症反应的作用。     

小檗碱和育亨宾对内毒素血症小鼠脾脏TLR4信号通路中相关基因表达的影响

目的: 观察小檗碱和α₂肾上腺素能受体拮抗剂育亨宾对内毒素血症小鼠脾脏Toll样受体4(TLR4)信号通路84种基因表达的影响,并初步探讨其作用机制。方法: 雄性BALB/c小鼠随机分为对照组、脂多糖(LPS)组、小檗碱+LPS组、小檗碱+育亨宾+LPS组、育亨宾+LPS组、小檗碱组、小檗碱+育亨宾组和育亨宾组。分别用蒸馏水、小檗碱(50 mg/kg)、小檗碱+育亨宾(50 mg/kg+2 mg/kg) 和育亨宾(2 mg/kg)灌胃,每天1次,连续3 d,第3 d灌胃1 h后,腹腔注射LPS(20 mg/kg)或生理盐水。腹腔注射1 h后,用RT² Profiler^TM PCR Array分析技术检测小鼠脾脏TLR4信号通路84种基因mRNA的表达;用Western blotting分析小鼠脾脏TLR4信号通路的抑制分子细胞因子信号抑制物(SOCS)1、SOCS3和白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK)-M蛋白的表达。结果: LPS可上调小鼠脾脏TLR4信号转导通路中相关炎症因子的mRNA表达,包括CXCL10、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IFN-β。小檗碱能显著下调下调髓样分化因子(MyD88)依赖信号通路下游TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达,也能MyD88非依赖信号通路下游基因IFN-β和CXCL10 mRNA的表达(P<0.05)。育亨宾能显著下调内毒素血症小鼠脾脏IL-1α、IL-1β 和IFN-β mRNA的表达(P<0.05),但对TNF-α、IL-6和CXCL10 mRNA表达的下调作用与LPS组相比没有显著差异(P>0.05)。小檗碱与育亨宾合剂能显著下调内毒素血症小鼠脾脏IFN-β和CXCL10 mRNA的表达,但不能显著下调内毒素血症小鼠脾脏IL-1α、IL-1β、TNF-α 和IL-6 mRNA的表达。LPS攻击后1 h,小檗碱和(或)育亨宾均不能增强内毒素血症小鼠脾脏SOCS1、SOCS3和IRAK-M蛋白的表达。结论: 小檗碱和育亨宾均能抑制LPS诱导的MyD88依赖和非依赖信号通路下游部分基因的表达,这种抑制作用的机制与SOCS1、SOCS3和IRAK-M蛋白无关。     

TLR2和TLR4在人慢性根尖周病组织肥大细胞上的表达

 目的: 观察人不同类型慢性根尖周病组织中肥大细胞(mast cells,MCs)上Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)和TLR4的表达情况,探讨TLR2-类胰蛋白酶(tryptase)和TLR4-tryptase双阳性MCs在慢性根尖周疾病发病机制中的作用。方法: 将60例自愿参与本研究的受试者按根尖周病分类标准分为3组:(1)正常对照组;(2)根尖周肉芽肿组;(3)根尖周囊肿组。将根尖周组织标本置于4%甲醛固定液中浸泡48 h以上,制作连续组织切片。HE染色,光学显微镜下观察各组根尖周标本的组织学变化;免疫荧光双染色后于荧光显微镜下观察TLR2-tryptase和TLR4-tryptase双阳性MCs在根尖周组织中的分布情况。结果: 根尖周病变组TLR2-tryptase和TLR4-tryptase双阳性MCs比正常牙周膜组明显增多(P<0.01);与根尖肉芽肿组相比,根尖囊肿组TLR2-tryptase及TLR4-tryptase双阳性MCs数目明显增高(P<0.01)。结论: TLR2及TLR4在慢性根尖周疾病组织中MCs上表达增加,提示TLR2-tryptase及TLR4-tryptase双阳性MCs可能参与慢性根尖周病发病过程的免疫调节。