汉坦病毒疫苗研究进展

汉坦病毒属于布尼亚病毒科的汉坦病毒属,主要引起人的两种疾病肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征.汉坦病毒基因组包括(L M、S)3个负链RNA片段.分别编码RNA聚合酶、囊膜糖蛋白G1和G2和核心蛋白.汉坦病毒基因工程疫苗研究主要包括亚单位疫苗、活病毒载体疫苗和核酸疫苗;传统的灭活疫苗包括鼠脑来源和细胞培养的灭活疫苗,本文就汉坦病毒这两方面的研究进展进行了综述.     

汉坦病毒疫苗研究进展

汉坦病毒属于布尼亚病毒科的汉坦病毒属，主要引起人的两种疾病：肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征。汉坦病毒基因组包括(LM、S)3个负链RNA片段。分别编码RNA聚合酶、囊膜糖蛋白G1和G2和核心蛋白。汉坦病毒基因工程疫苗研究主要包括亚单位疫苗、活病毒载体疫苗和核酸疫苗；传统的灭活疫苗包括鼠脑来源和细胞培养的灭活疫苗，本文就汉坦病毒这两方面的研究进展进行了综述。     

Klotho:与FPC蛋白相互作用的蛋白质分子

目的:利用酵母双杂交技术筛选与纤囊素相互作用的蛋白质,为进一步探讨纤囊素(FPC)在常染色体隐性遗传多囊肾病(ARPKD)发生、发展中的作用机制提供依据。方法:利用酵母双杂交系统以质粒pG-BKT7-FPC为"诱饵",在人类胚肾cDNA文库中筛选与FPC蛋白C末端相互作用宿主蛋白的基因,再通过一对一回交试验验证两者之间的相互作用。结果:酵母双杂交筛选得到相互作用的蛋白分子Klotho(后简称KL),回交试验再次确认KL能够与FPC蛋白相互作用。结论:FPC的C末端能够与KL相互作用,它们之间的相互作用可能为研究FPC在ARPKD发病中的功能及作用机制提供新途径。     

α1A-肾上腺素受体与骨形成蛋白-1的相互作用研究

目的 :在α1-AR 3种亚型中 ,α1A-AR的效应最强、功能最广泛 ,但原因一直不明 ,有研究者认为“非G蛋白”可能是一种参与因素。方法 :本研究采用酵母双杂交方法 ,以α1A-AR的细胞内游离C末端 (32 2 - 4 6 6aa)作为诱饵 (bait) ,在酵母细胞中对预转化的人脑cDNA文库进行筛选。对筛选出的克隆进行测序 ,采用免疫共沉淀和免疫荧光等方法在HEK2 93细胞中进一步观察“非G蛋白”与α1A-AR相互作用。结果 :(1)在酵母双杂交实验中 (Y187酵母细胞 ) ,筛选出骨形成蛋白 1片段与α1A-AR细胞内游离C末端 (32 2 - 4 6 6aa)结合 ,但不与α1B-AR…     

人类ZAKβ与YWHAZ蛋白相互作用的初步研究

目的研究ZAKβ与YWHAZ蛋白之间的相互作用。方法以ZAKβ为诱饵蛋白,利用酵母双杂交筛选人类肝脏cDNA文库,经GST Pull-down、免疫共沉淀和细胞共定位实验分别验证ZAKβ与猎物蛋白在体外和细胞内的相互作用,构建ZAKβ的截短体以确定相互作用的区域,用磷酸化抗体检测ZAKβ在相互作用中的磷酸化作用,并通过流式细胞仪检测这对蛋白相互作用对细胞周期的影响。结果利用酵母双杂交筛选到一个能与ZAKβ相互作用的蛋白YWHAZ,并在体外和细胞内都验证了这二者的相互作用,发现这两个蛋白都能共定位于293T细胞的胞质中,确定了ZAKβ的N端1~250氨基酸为与YWHAZ蛋白相互作用的区域。体外实验发现了这二者的相互作用涉及到磷酸化反应,发现这对蛋白的相互作用能提高293T细胞的G2期水平。结论首次发现并证实了ZAKβ和YWHAZ之间的相互作用,发现该相互作用涉及到磷酸化过程并能够对细胞周期产生影响。     

应用单克隆抗体确定汉坦病毒囊膜糖蛋白抗原决定簇的特性（文摘）

应用一组24种抗汉坦病毒囊膜糖蛋白G1和G2的单克隆抗体(McAb)来检测抗原位点的表面分布和功能特性。用竞争结台法证明其中9种抗原位点性质不同，部分位点有重迭，有2个在G1上，7个在G2上。用血凝抑制试验和空斑减少中和试验分析表明，所有抗原位点除G1中的一种外均与病毒血凝活性有关。仅G1中的一个和G2中的2个位点具有病毒中和作用。     

酵母双杂交系统在膜蛋白相互作用研究中的应用

膜相关蛋白约占细胞总蛋白质中的1/3,它们大都参与了细胞的诸多生理、病理过程和药物反应机理.研究膜蛋白的相互作用对于揭示细胞的生命活动规律及寻找药物作用靶标都有重要的意义.由于膜蛋白本身的特性及其难以进入核内等原因,经典的酵母双杂交技术并不适用于检测膜蛋白间的相互作用.针对在活细胞中研究膜蛋白相互作用的需要,近年来国际上先后发展了一系列用于膜蛋白相互作用研究的酵母双杂交新系统,并取得了许多重要发现.     

RGD肽类肿瘤受体显像剂的研究进展

细胞与细胞、细胞与基质间的相互作用是肿瘤血管生成、侵袭和转移的基础.整合素属于细胞黏附分子家族,是一种跨膜糖蛋白,有19种α亚基8种β亚基构成,在肿瘤侵袭和转移中起到重要作用[1,2].     

原癌基因LMO3相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的 通过筛选LMO3的相互作用蛋白,进一步了解LMO3的作用及可能机制.方法:酵母双杂交方法 筛选LMO3相互作用蛋白,并通过酵母结合试验、免疫共沉淀及荧光共定位等进行验证.结果:在初步获得相互作用蛋白CIB的基础上,在酵母中证实了LMO3与CIB的相互作用,并通过酵母结合试验确定了CIB与LMO3的相互作用位点,发...     

汉坦病毒G1蛋白胞质区ITAM样基序氨基酸序列多态性分析

汉坦病毒( Hantavirus,HV)属于布尼亚病毒科汉坦病毒属,是一种有包膜、单股负链、分节段的RNA病毒[1-2].免疫受体酪氨酸活化基序( Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,ITAMs)是与免疫受体活化信号由细胞外向细胞内传递有关的一段以两个酪氨酸残基为中心的序列,在启动免疫细胞的活化和增殖中发挥关键作用,其基本形式为YxxLx6-9 YxxL,其中x代表任意氨基酸[3].近年有研究表明,HFRS及HPS相关汉坦病毒的囊膜糖蛋白1(G1)胞质区尾段(约615-631氨基酸位点)均含有ITAM样基序(ITAM-like sequences),具有与一些重要的免疫受体ITAMs相似的功能,但目前对汉坦病毒G1胞质区尾段ITAM样基序多态性的认识仍停留在零碎、非系统的基础上.世界各地测定了大量的汉坦病毒毒株的ITAM样基序氨基酸序列,本研究采用生物信息学方法对这些序列进行分析,结果报告如下.     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1(1),pDBLeu-GATA1(2),pDBLeu-GATA1(3),筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

日本脑炎病毒E蛋白基因酵母双杂交表达载体的构建

日本脑炎病毒 (ＪＥＶ)为黄病毒属成员 ,基因组为单股正链ＲＮＡ ,长约 11ｋｂ ,编码 3个结构蛋白和7个非结构蛋白〔1〕。其中 3个结构蛋白分别为衣壳蛋白Ｃ、膜蛋白Ｍ和囊膜蛋白Ｅ。Ｅ蛋白为该病毒外部的糖蛋白 ,由 50 0个氨基酸组成 ,相对分子质量(Ｍｒ)约为 530 0 0 ,具有多种生物学功能 ,包括受体结合活性和膜融合作用等 ,与病毒的致病性及组织亲嗜性密切相关〔2〕。酵母双杂交技术 ,是一种新近发展的研究蛋白质之间相互作用的方法。为研究ＪＥＶ的受体 ,我们将编码ＪＥＶ中具有受体结合活性的Ｅ蛋白的基因(约 1.5ｋｂ)克隆入酵母表达载…     

酵母双杂交筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的 筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白.方法 PCR扩增单剪接型2.2 kb HBV剪接特异性新基因TPss并克隆于诱饵载体pGBKT7,在证实TPss蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与TPss蛋白相互作用的肝细胞蛋白,进而通过哺乳动物细胞双杂交实验验证候选肝细胞蛋白与TPss蛋白在Huh7和HepG2肝细胞中的相互作用.结果 构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TPss,Western blot显示其在酵母中表达TPss蛋白.酵母双杂交筛选及哺乳动物细胞双杂交证实TPss蛋白可与4种肝细胞蛋白相互作用,即组织蛋白酶B、微粒体环氧化物水解酶、组织蛋白酶D与纤维蛋白原γ链.结论 TPss可与多种肝细胞蛋白相互作用.     

与14-3-3ζ相互作用的蛋白Polo样激酶1的筛选与鉴定

目的:应用酵母双杂交系统筛选与14-3-3ζ相互作用的蛋白,进一步鉴定其与Polo样激酶1(Plk1)相互作用。方法:构建pGBKT7-14-3-3ζ诱饵表达载体,筛选HeLa细胞cDNA文库中与14-3-3ζ相互作用蛋白,进一步通过共转酵母、免疫荧光以及外源性和内源性的细胞免疫共沉淀实验验证两者的相互作用。结果:通过酵母双杂交系统筛选出的阳性相互作用蛋白中包括Plk1,进一步通过共转酵母,外源性和内源性的细胞免疫共沉淀实验证实两者的相互作用,免疫荧光实验证实两者共定位于有丝分裂过程中胞质分裂期的中体。结论:Plk1是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在中体的成熟,有丝分裂期染色体的分离,胞质分裂以及DNA的损伤应答等环节发挥重要作用,其与14-3-3ζ的相互作用为14-3-3蛋白家族参与有丝分裂(M期)的调控提供了直接证据。     

酵母双杂交技术筛选并回转验证在胞内与PML-C结构域相互作用的蛋白

目的 利用酵母双杂交技术在活细胞内筛选并回转验证与PML-C结构域相互作用的蛋白质.方法 通过诱饵质粒pGBKT7-PML-C,利用酵母双杂交系统从白血病细胞cDNA文库中筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质.结果 利用酵母双杂交技术筛选到43个能与PML-C结构域相互作用的克隆;经进一步的归类与酵母回转试验得到9个阳性克隆.结论 在细胞内PML-C结构域能与多种蛋白质有相互作用.中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)介导的急性早幼粒细胞白血病的发生可能与这些相互作用所致的生物学功能改变有关.     

汉滩病毒重组腺病毒疫苗与DNA疫苗的联合免疫效果分析

汉坦病毒基因组由L、M、S3个负链RNA片段组成，M片段编码囊膜糖蛋白G1和G2，G1和G2在病毒的吸附、病毒膜与细胞膜的融合、中和抗体的产生等方面起着重要作用。以腺病毒为载体的活载体疫苗安全性好，能有效感染呼吸道和肠道等组织细胞，不仅能激发黏膜免疫，还能诱导系统免疫和细胞免疫反应。我们分别以腺病毒和质粒pcDNA3．1为载体，构建了含有完整汉滩病毒基因M片段和单独表达G1的重组腺病毒和重组DNA疫苗。DNA疫苗能够引发体液和细胞介导的免疫应答，但接种后只能引发很弱的免疫应答。为了克服上述疫苗的缺     

酵母双杂交技术筛选NECL1胞内区的结合蛋白

目的 筛选人源膜表面黏附分子NECL1蛋白胞内区相互作用蛋白。 方法 构建含人NECL1蛋白胞内区氨基酸编码序列的诱饵质粒pGBKT7-NECL1C,对人胎脑cDNA文库进行酵母双杂交筛选。用GST pull down实验进行体外蛋白相互作用的验证。结果 酵母双杂交阳性克隆测序后显示共存在9段不同序列（存在重复克隆）。比对氨基酸序列得到5个可能相互作用蛋白。通过GST pull down 实验验证了其中两个蛋白与NECL1胞内区的相互作用。结论 应用酵母双杂交系统,获得了一些候选的NECL1胞内区相互作用蛋白。     

应用酵母双杂交系统筛选Foxp3△2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交系统从人外周血白细胞cD-NA文库中筛选与转录因子Foxp3相互作用的蛋白,为进一步研究Foxp3的转录调控机制奠定基础。方法:首先构建pG-BKT7-Foxp3△2酵母双杂交诱饵载体,转化AH109酵母细胞,检测其毒性及自激活作用;然后将诱饵质粒与人外周血白细胞cDNA文库共转AH109酵母细胞,筛选了与Foxp3△2存在相互作用的蛋白。结果:成功构建了pGBKT7-Foxp3△2酵母表达载体,经转染AH109酵母细胞,无有毒性,无自激活作用。获得了40个阳性克隆,经生物信息学分析,其中9个具有开放读框。结论:应用酵母双杂交技术筛选出一组可与Foxp3△2相互作用的候选蛋白,为进一步研究Foxp3△2功能奠定了基础。     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A／Guangdong／7028／2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性：酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5．22％,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾／钠ATP酶B1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体1亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

整合素连接激酶的研究进展

整合素(integrin)是由α和β亚单位构成的跨膜糖蛋白,是细胞表面的主要黏附分子,在细胞外基质和细胞骨架之间提供了生理上的连接,介导了细胞外基质与细胞、甚至细胞与细胞之间的相互作用,参与了一系列细胞功能的调节,如胚胎发育、肿瘤的发生发展和转移、细胞凋亡、细胞对机械力的应激等[1].整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)处于整合素的下游,是一种多功能细胞内信号蛋白,通过与多种胞外因子相互作用,参与多种信号传导通路,包括整合素、生长因子及Wnt信号传导通路等,进而发挥一系列生理病理功能.