量子点技术在荧光标记免疫分析中的发展与应用

量子点是一种新型荧光标记材料,与传统荧光染料相比具有激发波长宽,发射波长窄而对称,不同粒径和组成的量子点其发射波长不同等优点.应用不同发射波长的量子点对不同的待检分析物同时进行标记,可以达到多个指标同时检测的目的.量子点作为荧光标记物已在免疫分析领域及医学诊断研究中得到了广泛的应用,并显示出了巨大的发展前景.     

巯基丙酸修饰CdTe量子点光学性能及其生物相容性研究

目的:研究水相合成巯基丙酸(MPA)修饰的CdTe量子点(CdTe QDs)用于对细胞的标记,探讨其与活细胞的生物相容性.方法:水相中合成MPA CdTe QDs;透射电子显微镜、荧光分光光度计及紫外分光光度计表征MPA CdTe QDs;将MPA CdTe QDs与亲和素连接、纯化、制备成MPA CdTeQDs荧光探针;应用激光扫描共聚焦显微术观察MPA CdTeQDs荧光探针标记小鼠腹腔巨噬细胞(PM@)MHC Ⅱ抗原的表达;以黑色素瘤B-16细胞为靶细胞,应用细胞培养和MTT法观察MPA CdTe QDs的生物相容性.结果:水相中合成MPACdTe量子点粒径均匀,具备良好的光学性能,稳定性强;以量子点标记亲和素(QDs-Avidin)作为荧光探针标记小鼠腹腔巨噬细胞MHCⅡ抗原,在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下可见标记细胞具有较强的荧光表达;MPA CdTe QDs在高浓度时有一定的细胞毒性,但是,在用于对细胞进行荧光标记成像的浓度范围内,量子点对细胞活性的影响很小.结论:MPA CdTe QDs大小比较均匀且具有较好的光学性能,不易漂白淬灭,稳定性好,是一种新的良好的荧光标记物;MPACdTe QDs具有较好的生物相容性.     

连翘提取物对小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬和NO释放的影响

目的:分析连翘(FS)对小鼠腹腔巨噬细胞的体外吞噬和体外NO释放的影响.方法:无菌收集小鼠腹腔巨噬细胞和羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)标记大肠杆菌DH5α,短期培养3 h后流式细胞术(FCM)分析FS对腹腔巨噬细胞体外吞噬的影响.用LPS体外刺激活化腹腔巨噬细胞,Griess Reagent试剂盒检测并分析FS对巨噬细胞体外释放NO的影响.结果:FCM分析显示,终浓度为40、80、160 mg/L的FS对小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬具有明显的促进作用(P<0.05).不同终质量浓度的FS对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞体外NO的释放均有抑制作用(P<0.05).结论:FS可以促进小鼠腹腔巨噬细胞的体外吞噬和抑制NO体外的释放.     

量子点在小鼠腹腔巨噬细胞内的定位及对其超微结构的影响

目的 观察体外实验量子点在小鼠腹腔巨噬细胞内的分布和对其超微结构的影响.方法 利用量子点与小鼠腹腔巨噬细胞体外共孵育和电子显微镜技术,观察量子点在小鼠腹腔巨噬细胞内的分布及对其超微结构的影响.结果 透射电镜下,量子点被小鼠腹腔巨噬细胞内吞入细胞质内,形成单位膜包被的空泡样结构.扫描电镜下,可见与量子点体外共孵育的小鼠腹腔巨噬细胞的表面有较多的片状细胞突起.结论 量子点可使巨噬细胞活化,并使其表面突起增多;量子点被巨噬细胞内吞后,分布在细胞质内,并形成单位膜包被的空泡样结构.     

一株植物乳杆菌内化于小鼠回肠派伊尔结及其免疫调节作用的研究

目的 探讨决定Lactobacillus plantarum Lp6 在小鼠小肠派伊尔结 (PP)内化的细菌源因素,并分析该菌株的免疫调节作用.方法 FITC标记不同处理的细菌,分析在含PPs的回肠结扎段内化的情况.给小鼠灌胃活或灭活细菌,研究其对小鼠脾、PP细胞增殖和腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响.结果 甘露糖可以强烈的抑制细菌内化,灭活和四甲基脲处理可以较明显的减低细菌内化.活菌和灭活菌可以特异性的调节腹腔巨噬细胞、PP细胞和脾淋巴细胞的活性.结论 细菌表面甘露糖糖凝集素是影响细菌PP内化的最主要因素.细菌活力、表面疏水性也有一定的作用.活菌和灭活可以不同程度的增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性并抑制脾和PP淋巴细胞增殖.     

活菌H37Ra与灭活菌H37Rv感染小鼠腹腔巨噬细胞的实验研究

目的:探讨小鼠腹腔接种结核分枝杆菌活菌H37Ra、灭活菌H37Rv后,诱导巨噬细胞免疫物质的表达差异,探讨活菌H37Ra及灭活菌H37Rv作为新的结核候选疫苗的可行性。方法:分别培养BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞,用活菌H37Ra,灭活菌H37Rv感染10小时后用抗酸染色方法,观察各组巨噬细胞吞噬情况并计算吞噬率。将活菌H37Ra、灭活菌H37Rv、生理盐水分别接种BALB/c小鼠腹腔,免疫30天后取小鼠腹腔巨噬细胞,RT-PCR法检测小鼠腹腔巨噬细胞IL-12P40、TNFα-、IFNγ-的基因转录水平;ELISA法检测细胞因子IL-12P40、TNFα-、IFNγ-的表达;Griess法、化学法检测小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO、H2O2水平;流式细胞仪检测IFNγ-诱导的CD40L的变化情况。结果:巨噬细胞对活菌H37Ra和灭活菌H37Rv的吞噬率分别为(55.71±8.42)%、(14.82±2.12)%。与灭活菌相比,活菌H37Ra有更强的被吞噬能力(P<0.01)。活菌H37Ra免疫小鼠腹腔巨噬细胞后能显著诱导巨噬细胞的IL-12P40、TNF及IFNγ-基因的转录;细胞因子IL-12P40、TNFα-、IFNγ-、NO及H2O2高水平分泌;同时活菌H37Ra刺激IFNγ-诱导的巨噬细胞表面CD40L的高表达。结论:活的结核分枝杆菌H37Ra能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生更多的保护性免疫物质,有利于免疫应答,有可能作为新的结核候选疫苗,而灭活菌H37Rv不能显著激活小鼠腹腔巨噬细胞分泌保护性免疫物质,不宜作为新的结核候选疫苗。     

用酶解法制备壳寡糖及其对机体免疫功能的调节作用

目的:研究本课题组酶解制备的主要含3-7聚合度壳寡糖(COS)对机体免疫功能的调节作用。方法:利用本课题组分离的高活性壳聚糖酶通过酶水解法制备壳寡糖,HPLC法对壳寡糖的成分进行鉴定,并用异硫氰酸荧光素(FITC)将壳寡糖进行荧光标记得到FITC-COS,研究小鼠腹腔巨噬细胞对壳寡糖的吞噬作用及其与Toll样受体4(TLR4)的关系,进一步研究了不同浓度壳寡糖对小鼠腹腔巨噬细胞的增殖,吞噬中性红能力及分泌TNF-α能力的影响,并对小鼠灌胃不同剂量的壳寡糖,研究了壳寡糖对小鼠血清IgG和IgM含量及小鼠胸腺、脾脏指数的影响。结果:HPLC分析结果显示壳聚糖酶水解法制备的COS主要为3-7单糖聚合度的寡糖。将FITC-COS作用于小鼠腹腔巨噬细胞不同时间后,荧光显微镜观察结果表明巨噬细胞能够吞噬COS,随着时间的延长吞噬COS的量增加,TLR4单克隆抗体预处理巨噬细胞1小时后再加入FITC-COS,巨噬细胞对COS的吞噬作用几乎完全被抑制。COS被巨噬细胞吞噬后可显著增强巨噬细胞的吞噬功能,刺激巨噬细胞分泌TNF-α。体内研究结果表明小鼠灌胃COS能够显著增加小鼠的脾脏指数,增加血清中IgG的含量,对胸腺指数和血清中IgM的含量没有显著影响。结论:壳寡糖(3-7聚合度)能够被巨噬细胞吞噬,进而激活巨噬细胞,具有较好的体外、体内免疫调节功能,壳寡糖对巨噬细胞的激活是通过细胞表面TLR4受体介导的。     

Pam3Csk4 预处理增强巨噬细胞对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀菌作用

目的:初步探讨TLR2激动剂Pam3Csk4预处理后,小鼠腹腔巨噬细胞对耐甲氧西林金葡菌(Methicillin-resistant S.aureus,MRSA)的免疫反应性。方法:1μg/ml Pam3Csk4作用于鼠腹腔巨噬细胞,12 h后以热灭活耐甲氧西林金葡菌刺激细胞,ELISA和荧光定量PCR(Q-PCR)法分别检测培养细胞中TNF-α、IL-6和IL-1及mRNA含量,流式检测小鼠腹腔巨噬细胞对热灭活金葡菌的吞噬能力,平板计数法检测Pam3Csk4预处理巨噬细胞对金葡菌杀菌能力;Q-PCR法检测Pam3Csk4预处理巨噬细胞6 h和12 h后吞噬相关受体与补体受体、一氧化氮诱导合成酶(i NOS)及抗菌肽LL37基因表达。结果:金葡菌刺激后,Pam3Csk4预处理组TNF-α、IL-6、IL-1蛋白和基因水平均显著低于未处理组(P0.05),但Pam3Csk4预处理组细胞对金葡菌吞噬和杀菌能力均显著增强(P0.05),对于MRSA菌株,增强的杀菌能力在补体和抗体参与。进一步Q-PCR结果显示Pam3Csk4预处理巨噬细胞6 h和12 h后调理吞噬相关受体FCγRⅠ/Ⅲ与补体受体CR1/3表达均显著增强,i NOS和LL37基因表达也显著增加。结论:Pam3Csk4预处理小鼠腹腔巨噬细胞能增强其对金黄色葡萄球菌甲氧西林敏感和耐药菌株杀菌或抑菌能力,并降低其相应炎症反应,该现象可能与Pam3Csk4激活巨噬细胞吞噬相关受体以及i NOS和抗菌肽表达有关。     

量子点纳米荧光探针在示踪炎症细胞向淋巴结迁移中的应用研究

利用量子点优越的光学性质,用于追踪炎症消退时炎症性细胞向淋巴结的迁移.通过电脉冲作用在小鼠胫前肌制造炎症模型并注射量子点后,发现:量子点在炎症部位呈聚集状态,并被炎症细胞所内吞;在引流淋巴结中,量子点主要分布于T细胞区域;透射电镜与Confocal研究表明,多数量子点位于单核细胞/巨噬细胞的内吞体内.本工作表明,量子点可以用于标记细胞特别是具有吞噬性的细胞的迁移情况,因此在免疫学研究中可能具有重要应用.     

HMGB1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和I-A/E表达的影响

目的:探讨HMGB1对巨噬细胞免疫功能的影响.方法:梯度浓度HMGB1处理小鼠腹腔巨噬细胞, 或将小鼠随机分为生理盐水对照、 24 h和48 h高与低剂量HMGB1注射组, 腹腔注射0.2 μg或20 μg HMGB1, 或生理盐水.检测巨噬细胞吞噬功能和I-A/E表达.结果:10 μg/L HMGB1刺激6～12 h, 巨噬细胞吞噬功能较其他剂量组明显增强(P<0.05或P<0.01).HMGB1对培养巨噬细胞I-A/-E表达无影响.高剂量HMGB1攻击小鼠24 h, 其腹腔巨噬细胞吞噬能力明显降低(P<0.05); 低剂量HMGB1攻击48 h, 巨噬细胞I-A/-E表达明显上调(P<0.05或P<0.01).结论:高剂量HMGB1抑制巨噬细胞吞噬功能, 低剂量HMGB1增强巨噬细胞免疫功能.