部分背根切断改变备用背根节神经元和卫星细胞脑源性神经营养因子的基因表达

目的　探讨部分去背根后备用背根节 (L6 )各类细胞脑源性神经营养因子 (BDNF)及其mRNA的量变情况。　方法　对成年雄性猫行单侧部分背根切断术 (切除一侧L1 ～L5、L7～S2 DRG ,保留L6 为备用根 )。取正常组一侧和术后 3d及 7d组手术侧的L6 DRG并分别行免疫组织化学及原位杂交染色。观察BDNF及其mRNA在DRG各类细胞的分布 ,测定BDNF及其mRNA在神经元和卫星细胞的光密度值。　结果　部分去背根后 3d ,中小神经元内BDNF及其mRNA的光密度值较正常者明显减少 (P <0 0 5 ) ,而 7d时又恢复近正常水平 (P >0 0 5 )。BDNF及其mRNA在大神经元的光密度值术后 3d无明显变化 ,而 7d时较正常者明显减少 (P <0 0 5 )。比较之 ,卫星细胞BDNF及其mRNA的光密度值术后 7d时明显升高 (P <0 0 5 ) ,术后 3d与正常者比未见明显变化。　结论　部分背根切断导致备用DRG各类细胞BDNF的表达水平发生不同程度的改变。提示备用DRG内BDNF的变化与脊髓Ⅱ板层可塑性有关。     

部分去背根猫备用背根节和脊髓Ⅱ板层BDNF及其mRNA表达的变化

采用免疫组织化学和原位杂交技术探讨了部分去背根猫术后 3 d和 10 d的备用背根节和脊髓 II板层内 BDNF及其m RNA的表达变化。结果表明 ,正常组 ,BDNF主要分布于背根节的部分中、小神经元及脊髓背角浅层神经元内 ,II板层内还有大量的 BDNF阳性神经膨体。背根节同时也为 BDNF m RNA阳性 ,唯背角阴性。部分去背根后 10 d组 ,备用背根节 BDNF及其 m RNA阳性中、小神经元百分数较正常及 3 d者明显增加 (P<0 .0 5 )。而 L3,L5II板层 BDNF阳性神经膨体密度在术后两组均明显下降 (P<0 .0 5 ) ,唯 BDNF的含量在 3 d组者减少 (P<0 .0 5 ) ,10 d组者恢复 (P>0 .0 5 )。术后 II板层未见 BDNF m RNA的杂交信号。结果提示 :去背根术后 3 d组脊髓 II板层阳性膨体数的下降及 BDNF含量减少 ,可能是因背根切断导致输入脊髓 II板层的 BDNF中断所致 ;而 10 d时 II板层 BDNF合成得以恢复 ,可能来源于备用背根节中、小神经元的 BDNF增多所致 ,BDNF在脊髓可塑性中可能发挥作用     

电刺激引起背根节PPTA mRNA表达的变化

给予大鼠背部左侧胸 9脊神经皮支电刺激后 ,用原位杂交方法观察了本节段背根节 PPTA m RNA表达的变化。证明电刺激后 2 4h,左侧胸 9节段背根节 PPTA m RNA的表达较对侧和对照组有显著增高 ( P<0 .0 1)。表明较强的电刺激可增加背根节细胞 PPTA m RNA的表达 ,提示 PPTA在伤害性信息的传递和调控中发挥着重要作用     

丹酚酸B对人脐带间充质干细胞向胆碱能神经元分化的影响

目的:评估不同剂量丹酚酸B联合脑源性神经营养因子(BDNF)对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)向胆碱能神经元分化的影响。方法:流式细胞技术鉴定培养的hUCMSCs细胞表型;MTT法评估丹酚酸B浓度对hUCMSCs细胞增殖生存率的影响;观察3种不同剂量丹酚酸B联合BDNF诱导hUCMSCs分化后的细胞形态学变化;ELASA法测定培养上清液中乙酰胆碱(Ach)浓度,免疫组化法测定细胞神经巢蛋白(Nsetin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胆碱乙烯转移酶(ChAT)表达水平。结果:hUCMSCs细胞表型具有干细胞的表型特征,丹酚酸B随着作用浓度的增大对hUCMSCs的增殖具有抑制作用。丹酚酸B联合BDNF诱导分化后的hUCMSCs可见神经元样分化及轴突形成的网状结构;上清液Ach浓度和细胞Nestin、NSE及ChAT表达率,在中、高剂量联合组中的表达均高于低剂量联合组和BDNF组(P0.05),而中、高剂量联合组之间差异不显著。结论:丹酚酸B联合BDNF能提高hUCMSCs向胆碱能神经元分化效率,丹酚酸B的最宜诱导分化浓度为50 mg/L。     

部分背根切断后备用DRG卫星细胞NGF、BDNF和NT-3的表达变化

为探讨部分去背根猫备用背根节 ( L6 )卫星细胞 NGF、BDNF和 NT-3的表达变化 ,将成年雄猫 2 0只分为正常对照组和术后 3 d、术后 7d及术后 10 d三个实验组。实验组行单侧部分背根切断术 (切除一侧 L1 ～ L5,L7～S2 DRG,保留 L6 背根为备用根 )。取正常组一侧和术后 3 d、7d及 10 d实验组手术侧的 L6 DRG制作 2 0μm厚冰冻切片 ,行免疫组化反应 ;观察 NGF、BDNF和 NT-3在 DRG卫星细胞的分布 ,计数各组 L6 DRG的 NGF、BDNF和 NT-3的阳性卫星细胞数量。结果发现 ,部分去背根术后7d和 10 d组 L6 DRG的 NGF、BDNF和 NT-3的阳性卫星细胞数量较术后 3 d组和正常组者明显增高 ( P<0 .0 1)。表明 ,单侧部分背根切断导致备用 DRG卫星细胞的 NGF、BDNF和 NT-3的表达上调 ,这一变化可能与脊髓可塑性有关。     

部分背根切断对备用背根节NT-3表达的影响

目的　探讨部分去背根后备用背根节 (L6 )各类细胞NT 3及其mRNA的含量变化。　方法　对成年雄性猫行单侧部分背根切断术 (切除一侧L1 ～L5,L7～S2 DRG ,保留L6 为备用根 )。取正常组一侧和术后 3d及 7d组手术侧的L6 DRG制作 2 0 μm厚冰冻切片 ,分别用NT 3抗体及NT 3cRNA探针行免疫组织化学及原位杂交染色。观察NT 3及其mRNA在DRG各类细胞的分布 ,测定NT 3及其mRNA在神经元和卫星细胞的光密度值 ,所得数据用q检验进行统计分析。　结果　部分去背根后 ,各时相备用背根节大神经元内NT 3的光密度值较正常者进行性减少 ,(P <0 0 5 ) ,而NT 3mRNA的光密度值术后 3d减少 ,7d回升至近正常者水平。比较之 ,小神经元和卫星细胞NT 3及其mRNA的光密度值进行性增多 (P <0 0 5 )。　结论　部分背根切断对备用背根节各类细胞NT 3表达的影响不同 ,其功能意义可能与NT 3参与脊髓Ⅱ板层可塑性有关     

部分去背根猫备用背根节和脊髓Ⅱ板层NT-3及其mRNA的表达变化

采用免疫组化和原位杂交技术探讨了部分去背根猫备用背根节 (L6 )和 L3、L5脊髓 II板层 NT-3及其 m RNA的表达变化。结果发现 ,正常组 NT-3及其 m RNA阳性产物主要分布于背根节的大型神经元和少数中、小型神经元。部分去背根后 ,3 d和10 d两时相 NT-3 m RNA大型神经元阳性数明显减少 ,而 NT-3阳性大型神经元数术后 10 d时方明显减少 (P<0 .0 1) ;NT-3及其 m RNA阳性小型细胞数在术后两时相均较正常组者增多 (P<0 .0 1) ;而在中型神经元只有 NT-3阳性神经元数有增加。相对地 ,在脊髓 板层 ,两时相 NT-3阳性神经元及胶质细胞百分数均较正常者明显增加 (P<0 .0 1) ,且以 3 d组者为最明显 ,但均未见 NT-3 m RNA阳性信号。结果表明 ,部分去背根不仅导致背根节各类神经元中 NT-3的表达发生了变化 ,且对 板层 NT-3阳性神经元及胶质细胞数量也有明显影响。提示 NT-3可能在脊髓 板层可塑性中发挥作用     

逆行电刺激对相邻背根节PPT mRNA表达的影响

给予大鼠左侧胸 9脊神经背侧皮支或其外周断端较强电刺激后 ,用原位杂交方法观察相邻节段背根节 PPT m RNA表达的变化。结果表明 ,电刺激完整神经后 2 4h,同侧胸 8、胸 9和胸 10背根节 PPT m RNA表达的阳性细胞数明显高于对照组 ( P<0 .0 5 )。电刺激断离中枢的神经外周端后 2 4h,同侧胸 8和胸 10背根节 PPT m RNA表达的阳性细胞数明显高于对照组 ( P<0 .0 5 )。表明较强的逆行电刺激 ,可以在外周通过跨节段传递信息 ,引起相邻节段背根节的 PPT m RNA表达的增强。提示由 PPT生成的 SP等生物活性物质在跨节段信息传递的过程中起着重要作用     

体外培养的大鼠Schwann细胞神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达

目的：研究体外培养的Schwann细胞神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。方法：用细胞培养技术，培养新生SD大鼠Schwann细胞，传代后用ABC免疫细胞化学法检测Schwann细胞的NGF、BDNF反应。结果：体外培养的Schwann细胞立体感强、折光性好，细胞为梭形、椭圆形或三角形，NGF、BDNF免疫反应为阳性。结论：体外培养的Schwann细胞能表达NGF、BDNF。     

MEF2C调控大鼠脊髓背根节感觉神经元P物质和低分子量神经丝微管蛋白的表达

目的:研究肌细胞增强因子2C(MEF2C)在大鼠脊髓背根神经节神经元细胞内的表达及其与P物质和低分子量神经丝微管蛋白合成的关系。方法:分离培养背根神经节神经元细胞,然后暴露于不同浓度的神经生长因子下24h,最后用实时聚合酶链反应技术检测P物质与低分子量神经丝微管蛋白基因在背根神经节神经元细胞内的表达。通过化学转染方法将合成的3条siRNA-MEF2C分别转染PC12细胞株,并用实时聚合酶链反应技术筛选干扰效率最高的siRNA。采用化学转染方法干扰背根神经节神经元细胞内MEF2C的表达,在高浓度神经生长因子刺激背根神经节神经元细胞后采用实时聚合酶链反应技术检测干扰后背根神经节神经元细胞内P物质与低分子量神经丝微管蛋白基因的表达。结果:P物质及低分子量神经丝微管蛋白基因表达随刺激用神经生长因子浓度的升高而升高。使用化学转染方法成功地干扰背根神经节神经元细胞内MEF2C的表达,MEF2C较对照组下降52%,同时没有检测到对cAMP反应元件结合蛋白表达的影响。实验组背根神经节神经元细胞内P物质在RNA水平较对照组下降了39%,而低分子量神经丝微管蛋白在RNA水平较对照组下降了62%。结论:神经生长因子促进大鼠脊髓背根节感觉神经元内P物质与低分子量神经丝微管蛋白的合成。大鼠背根神经节神经元细胞内P物质及低分子量神经丝微管蛋白基因表达受MEF2C调控。     

电刺激对背根神经节和雪旺细胞髓鞘化的影响

目的:建立体外的背根神经节（DRG）—雪旺细胞（SCs）—电刺激模型,为研究电刺激促周围神经成髓鞘机制提供基础。方法:以函数发生器和电刺激小室构建电刺激细胞培养系统,DRG/SCs共培养24 h后分为对照（Ctrl）组和电刺激（ES）组。ES组给予矩形波电刺激,6 Vp-p,10 Hz,1 h/d,7 d。Ctrl组无电刺激。利用CCK8观测电刺激对细胞毒性的影响,利用髓磷脂碱性蛋白（MBP）免疫荧光检测电刺激对DRG/SCs髓鞘化的影响。结果:CCK8细胞增殖毒性实验显示,ES组光密度值略高于Ctrl组,但两组之间无统计学意义。免疫荧光检测结果显示ES组MBP的荧光强度明显高于Ctrl组（P<0.01）。结论:本文设计的电刺激细胞培养系统对神经细胞安全无毒,连续7 d的电刺激可提高神经髓鞘化率。     

PKAc促进成年大鼠背根神经节神经元突起生长及其机制的研究

观察慢病毒载体介导PKA催化亚单位PKAc转染促进成年大鼠原代培养的背根神经节(DRG)神经元突起生长及其机制的研究。我们运用三质粒系统共转染293T细胞合成慢病毒载体LV/PKAc-IRES-GFP和对照病毒LV/GFP,原代分离培养成年大鼠DRG神经元,应用免疫组织化学染色和Western blot等方法检测cAMP/PKA信号通路下游关键转录因子cAMP反应元件连接蛋白(CREB)磷酸化水平,图像分析经组织化学染色后的神经元突起长度和有突起神经元的百分比。结果观察到,慢病毒能介导外源基因在哺乳动物原代培养的神经元中表达,转染LV/PKAc-IRES-GFP的PC12细胞和DRG神经元均能表达外源基因并激活CREB,克服CNS髓鞘蛋白的抑制,促进突起生长。以上实验结果表明拯救成年大鼠神经元cAMP/PKA水平可有效改变神经元内在生长能力,从而改变它们对抑制环境的敏感性,进而促进突起生长。     

许旺细胞及小肠黏膜下层复合生长因子缓释微球修复周围神经缺损

背景：前期实验已初步证实许旺细胞复合小肠黏膜下层及碱性成纤维细胞生长因子构建的人工神经具有体外神经活性、趋化性。 目的：观察许旺细胞及小肠黏膜下层复合碱性成纤维细胞生长因子缓释微球修复周围神经缺损后神经传导的再通情况。 方法：制作SD大鼠坐骨神经缺损模型,随机分组：实验组以许旺细胞及小肠黏膜下层复合碱性成纤维细胞生长因子缓释微球修复,阳性对照组以许旺细胞及小肠黏膜下层复合游离碱性成纤维细胞生长因子修复,阴性对照组以许旺细胞及小肠黏膜下层修复,空白对照组以自体神经修复。 结果与结论：术后16周实验组再生神经纤维数目,DiI示踪标记的阳性神经元数量、S-100及神经细丝蛋白的阳性表达率、髓鞘及再生轴突的超微结构恢复、神经传导速度及复合动作电位的改善均优于阳性对照组与阴性对照组(P < 0.05)。表明许旺细胞复合小肠黏膜下层及碱性成纤维细胞生长因子缓释微球构建的人工神经可重建坐骨神经缺损后的神经传导通路。     

坐骨神经损伤大鼠模型鞘内移植神经干细胞后脊髓背角和背根神经节脑源性神经营养因子的表达

背景：坐骨神经损伤模型可测试伤害性的热刺激和机械刺激所引发的痛觉过敏及冷、触觉异常。 目的：观察坐骨神经损伤模型大鼠鞘内移植神经干细胞后脊髓背角和背根神经节脑源性神经营养因子的表达。 方法：72只SD大鼠随机均分为假手术组、对照组和实验组。对照组和实验组制作坐骨神经损伤模型,假手术组仅暴露坐骨神经,不结扎。分别于造模后第3,10天进行鞘内移植,实验组注入30 μL的神经干细胞悬液,空白组和对照组注入30 μL的细胞培养液。 结果与结论：与假手术组相比,对照组和实验组移植后3 d机械痛阈和热痛阈逐渐降低,至移植后7 d降低至最低点(P < 0.01),于移植后21 d恢复至移植前水平;实验组移植后7,14 d机械痛阈和热痛阈较对照组明显上升(P < 0.01)。与对照组相比,假手术组移植后7,14,21 d各组大鼠脑源性神经营养因子的表达呈低水平(P < 0.05);移植后14,21 d,实验组脑源性神经营养因子的表达量高于对照组(P < 0.05)。提示鞘内移植神经干细胞可提高脊髓背角和背根神经节中脑源性神经营养因子的表达。从而抑制了周围神经损伤产生的神经病理性疼痛。 关键词：脑源性神经营养因子;神经干细胞;慢性限制损伤;脊髓背角;背根神经节 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.031     

重组腺病毒载体AxCA-BDNF基因转染修复坐骨神经损伤

背景：如何促进周围神经损伤修复与再生一直是基础与临床研究的热点。基因治疗有可能成为今后解决该问题的主要手段之一。 目的：观察携带小鼠脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF) cDNA表达片段的重组腺病毒载体AxCA-BDNF转染大鼠损伤坐骨神经后BDNF的表达,以及脊髓前角运动神经元的存活和神经生长情况。 方法：切除成年Wistar大鼠股中部10 mm长的坐骨神经,AxCA-BDNF转染组、BDNF组和对照组分别用硅胶管内置AxCA-BDNF原液,BDNF溶液或空白病毒稀释液桥接坐骨神经两断端。术后3,7,14 d,1,2,4个月应用原位杂交和免疫组织化学方法检测损伤坐骨神经及相应脊髓节段BDNF mRNA和蛋白的表达,并观察损伤坐骨神经的组织学及超微结构改变,再生的神经元及有髓神经纤维数目和髓鞘厚度。 结果与结论：术后3,7,14 d及1个月时,AxCA-BDNF转染组损伤坐骨神经近、远端神经干及脊髓(L_3~6)中BDNF mRNA和蛋白水平明显高于BDNF组和对照组(P < 0.01)。光、电镜病理组织学检查和图像分析证实,BDNF基因转染后,脊髓前角运动神经元存活数量、新生神经纤维数目及其髓鞘厚度、神经联接的再形成均明显优于对照组(P < 0.01)。说明经腺病毒介导转染的BDNF基因可在大鼠坐骨神经内有效表达,并通过轴突逆行转运到了相应的脊髓神经元,不仅能促进损伤神经纤维再生,也能保护损伤的脊髓神经元。     

Adenovirus-mediated brain-derived neurotrophic factor expression regulated by hypoxia response element protects brain from injury of transient middle cerebral artery occlusion in mice

Some gene expression may be regulated by hypoxia-responsive element (HRE) that is bound by hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) which is up-regulated during cerebral ischemia. To explore ischemia/hypoxia-controlled expression and the neuroprotective effects of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) after ischemic brain injury, an adenoviral vector using five copies of hypoxia response element (HRE) in the vascular endothelial growth factor gene to regulate the expression of BDNF gene (Ad5HRE:BDNF) was constructed, and its efficacy was verified for driving BDNF expression in cultured Hela cells under hypoxic condition by ELISA. We found that the concentration of BDNF in the Ad5HRE:BDNF-transfected culture media was 28-fold greater in a hypoxic condition than under normoxia. To examine the effect of Ad5HRE:BDNF on ischemic brain injury in vivo, Ad5HRE:BDNF was injected into right caudate putamen of adult mice 7 days prior to 60 min transient middle cerebral artery occlusion (MCAO). It was found that exogenous BDNF expression was increased in the Ad5HRE-BDNF-treated group and infarct volume of the Ad5HRE:BDNF-treated group at 3 days after MCAO was significantly smaller than that of vehicle- or AdNull-treated groups. Moreover, Ad5HRE:BDNF injection resulted in significantly improved sensorimotor scores 7 days after MCAO and induced a reduction in the number of Fluoro-Jade B-positive neurons and TUNEL-positive cells, compared with vehicle- or AdNull-injection. Our findings suggest that BDNF expression could be regulated in hypoxia/ischemia condition with five copies of HRE and ameliorates ischemic brain injury in a mouse focal cerebral ischemia model.     

卵巢移植对去势大鼠海马神经元形态及BDNF表达的影响

目的:观察卵巢移植后大鼠海马神经元形态变化及BDNF的表达,评价卵巢移植对海马神经元的保护效果。方法:制作去势SD大鼠模型,卵巢移植干预组在其肾被膜下移植出生3 d内的SD乳鼠卵巢,外源性激素干预组隔天给予腹腔注射乙烯雌酚1 mg/kg。分别于干预后的4、7、14和28 d,电镜观察海马神经元形态及免疫组化观察BDNF的表达情况。结果:卵巢移植后随着移植时间的延长血清雌激素和孕酮水平都逐步升高,乙烯雌酚组仅雌激素水平升高;各组海马神经元形态逐渐好转,移植14 d和28 d组海马神经元的形态改善优于同期给药组。卵巢移植组和乙烯雌酚组BDNF的表达在各区均有所升高,卵巢移植14 d和28 d组CA3区尤为明显(P<0.05)。结论:卵巢移植可以恢复卵巢内分泌功能,对海马神经元形态有改善作用及促进BDNF的表达,其神经元保护作用优于单纯乙烯雌酚干预组。     

The timecourse of induction of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the rat hippocampus following voluntary exercise

In this study we examined the timecourse of induction of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) mRNA and protein after 1, 3, 5, 7, 14 and 28 days of exercise in the rat. To measure the expression of mRNA for individual BDNF exons we utilized a semi-quantitative RT-PCR technique, while BDNF protein was assessed using commercial ELISA kits. We demonstrated that the distance run by animals increased significantly (P<0.05) after 4 weeks. BDNF protein was significantly (P<0.05) increased after 4 weeks of exercise, while the mRNA for individual BDNF exons increased significantly (P<0.05) over the timecourse (exon I after 1 and 28 days and exons II and V after 28 days). The Morris water maze was then utilized to demonstrate that 3 weeks of prior exercise enhanced the rate of learning on this task. Exercise, therefore, was shown to modulate BDNF induction in a time-dependent manner, and this may translate to improvements in neurotrophin-mediated tasks within the CNS.     

大鼠脊髓全横断后脊髓内BDNF表达的变化

为了探讨大鼠脊髓全横断后不同时相(3、7、14、21d)脊髓内BDNF表达的变化,我们采用免疫组织化学ABC法和阳性神经元计数,来检测脊髓全横断后不同时相BDNF的表达。结果发现:(1)BDNF免疫阳性产物主要位于腹角运动神经元,胞浆着色;(2)脊髓全横断后脊髓腹角BDNF阳性细胞数3d开始增多,7d达高峰(P<0.05),14d恢复正常(P>0.05)。提示BDNF表达的变化可能与脊髓可塑性有关。     

葛根素对血管性痴呆大鼠海马锥体细胞和BDNF表达的影响

为了观察葛根素对血管性痴呆(VD)模型大鼠海马锥体细胞和BDNF表达的影响及其作用机制,本研究采用双侧颈总动脉缺血再灌注,同时腹腔注射硝普钠建立血管性痴呆大鼠模型,选出造模成功者随机分为模型组及葛根素干预组,各为24只,另以条件匹配的24只大鼠为假手术组。分别在造模术后15d,1、2和4个月等时间点,采用水迷宫检测大鼠学习记忆能力的变化,HE染色和免疫组化染色观察大鼠海马神经元的形态学改变及BDNF表达的变化。结果显示:(1)模型组大鼠的逃逸潜伏期(EL)均明显长于假手术组(P<0.01),葛根素干预组大鼠的EL较模型组明显缩短(P<0.05),但仍长于假手术组(P<0.05);(2)模型组大鼠海马CA1区锥体细胞数比假手术组明显减少(P<0.01),葛根素干预组2个月和4个月时点锥体细胞数较模型组明显增多(P<0.01),但仍少于假手术组(P<0.01);(3)模型组大鼠海马BDNF阳性细胞明显减少(P<0.01),除15d和1个月组DG区外,葛根素干预组大鼠海马BDNF阳性细胞数较模型组明显增多(P<0.05),但仍低于假手术组(P<0.05);(4)模型组大鼠海马BDNF阳性细胞平均吸光度值较假手术组明显降低(P<0.01),而葛根素干预组比模型组和假手术组均明显降低(P<0.05)。本研究结果提示,脑缺血再灌注后,海马BDNF阳性神经元和锥体细胞持续减少,在VD学习记忆障碍的发生和发展过程中起重要作用;葛根素对脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其机制可能与葛根素上调BDNF的表达、减少锥体细胞的丢失有关。