抗人超氧化物歧化酶单克隆抗体制备及临床应用

人体内超氧化物歧化酶(SOD)质与量的检测,对体内超氧阴离子自由基的动态的研究和所引起机体生理病理状态的自由基医学的发展,具有理论意义和应用价值。作者从人红细胞内纯化CuZn SOD,其比活性为3300U/mg,紫外光谱分析最大吸收峰在265um处,经酶染色定位证明为均一性纯酶。以其为抗原,制备了(绵)羊抗人CuZnSOD抗体和3株鼠抗人CuZn SOD McAb。建立了反向间接血凝试剂盒和酶联免疫吸附试验试剂盒,用于验测人体内SOD滴度,前者的     

人tau蛋白外显子2和外显子3特异性抗体的制备

目的 制备人微管相关蛋白tau N端的外显子2和外显子3特异性多克隆抗体.方法 从人外周血DNA中获得tau蛋白外显子2及外显子3序列并连接至原核表达载体pGEX-2T,表达纯化重组融合蛋白GST-E2、GST-E3;以此融合蛋白免疫家兔及小鼠制备抗血清,通过ProteinG/A、偶联GST蛋白的溴化氰(CNBr)活化柱对抗血清进行亲和纯化;用Western Blot及ELISA方法确定所制备抗体的特异性和敏感性.结果 在大肠埃希菌中表达纯化出人tau外显子2和外显子3重组融合蛋白GST-E2和GST-E3,相对分子质量为29×103.免疫实验动物后获得抗血清,经系列纯化后Western Blot和ELISA检测显示,制备的抗人tau蛋白外显子2和外显子3抗体具有良好的特异性和免疫反应效价.结论 成功制备了4种人tau外显子2和外显子3特异性抗体,为进行tau蛋白在神经退行性疾病中的作用研究提供了基础.     

人SUMO1蛋白表达纯化及单克隆抗体的制备、鉴定

目的 表达重组人SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)蛋白并制备单克隆抗体.方法 构建含人SUMO1基因的重组表达质粒pET32a-HIS-SUMO1,在大肠杆菌中表达重组蛋白HIS-SUMO1;以纯化后的HIS-SUMO1蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,通过ELISA和Western blot方法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定抗体Ig的类型及亚类;取一株筛选细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore抗体纯化试剂盒进行抗体纯化,Western blot方法检测抗体效价.结果 表达纯化了重组人HIS-SUMO1蛋白;3株稳定分泌特异性抗人SUMO1的单克隆抗体杂交瘤细胞株被筛选出,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得效价较高的鼠抗人SUMO1单克隆抗体.结论 通过表达纯化人SUMO1重组蛋白,制备出高效价鼠抗人SUMO1的单克隆抗体,该抗体可用于蛋白质SUMO化的研究.     

重组蛋白PTD-HSP27的制备及其穿细胞膜和角膜组织的功能研究

目的:制备PTD-HSP27蛋白并研究其能否穿过人晶状体上皮细胞SRA01/04细胞膜及新西兰大白兔的角膜组织进入眼前房。方法:利用重叠延伸PCR法获得重组目的基因片段PTD-HSPB1-6His,构建重组质粒p KYB-PTD-HSP27-6His,原核诱导PTD-HSP27蛋白表达及纯化重组蛋白后对其进行Western blotting鉴定;用异硫氰酸荧光素(FITC)标记重组蛋白PTD-HSP27并检测其穿透SRA01/04细胞膜的能力及兔眼角膜组织的能力。结果:成功构建并纯化制备目的蛋白PTD-HSP27,在PTD-HSP27孵育后的SRA01/04细胞及结膜囊滴注PTDHSP27兔眼前房内均可检测出重组蛋白PTD-HSP27。结论:通过重叠延伸PCR法及镍柱层析纯化法可以获得较纯的重组蛋白PTD-HSP27;重组蛋白PTD-HSP27能够穿透SRA01/04细胞膜及穿越兔眼角膜进入房水。     

重组人颗粒溶素的纯化及其单克隆抗体的制备

目的:纯化原核系统表达的颗粒溶素(GNLY),并制备其单克隆抗体(mAb)。方法:用Ni亲和层析纯化重组人GNLY,用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。mAb纯化后,用间接ELISA法测mAb的效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸盐洗脱法测定mAb的相对亲和力指数,并进行Ig亚类、特异性及杂交瘤细胞分泌mAb的稳定性检测。结果:经Ni亲和层析纯化的可溶性GN-LY融合蛋白,其纯度和含量分别为95%和0.8g/L。共筛选出能稳定分泌抗人GNLYmAb的杂交瘤细胞4株,分别为6C8、9C6、5G7和5E5。4株杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价分别为1∶100～1∶3200和(0.1～8)×10-4,5E5mAb的Ig亚类为IgM,其余3株mAb均为IgG1。结论:成功地纯化人GNLY融合蛋白。以其为免疫原制备的鼠抗人GN-LYmAb,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

人OX40胞外区基因的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

目的制备抗人OX40单克隆抗体,为进一步研究OX40/OX40L通路以及针对该通路进行疾病干预、疾病治疗和药物筛选奠定基础。方法 PCR扩增人OX40胞外区的基因序列,将其构建到原核表达载体pET-32a(+)中,利用大肠杆菌表达系统表达OX40胞外区蛋白,经Ni柱纯化后获得目的蛋白。以纯化的OX40胞外区蛋白为免疫原免疫小鼠,采用常规方法进行细胞融合,通过ELISA和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过ELISA、Western blot和免疫荧光检测抗体的效价及特异性。结果成功构建人OX40原核表达质粒pET-32a(+)-OX40,并在BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定、Ni柱纯化、透析后获得OX40胞外区蛋白;以此纯化蛋白为免疫原,成功制备具有较强亲和力的单克隆抗体。结论克隆表达并纯化了人OX40蛋白,成功制备针对该蛋白的高亲和力单克隆抗体,为进一步研究OX40/OX40L的生物学功能奠定了实验基础。     

抗人AFP单抗及多抗与丝裂霉素联接物对肝癌细胞的杀伤作用

用本室制备的分泌IgG AFP McAb的杂交瘤株G2及G10,接种于BALB/c小鼠腹腔,取其腹水经硫酸铵及Sepharose 4B柱亲和层析纯化,获得抗人AFP单抗。将马抗人AFP血清经硫酸铵及Sepharose 4B柱亲和层析提取AFP抗体IgG,得到AFP多抗。将纯化     

人精胺氧化酶的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆、原核表达有酶活性的重组人精胺氧化酶(SMO)蛋白,并制备兔抗人SMO多克隆抗体.方法:采用RT-PCR法从人非小细胞肺腺癌A549细胞株总RNA中克隆人精胺氧化酶cDNA,构建SMO原核表达质粒pET-15b/SMO.将SMO原核表达质粒转化E.coli的BL21(DE3)菌并使用IPTG诱导重组SMO表达.表达的蛋白产物经Ni-NTA亲和层析纯化、透析复性后,化学荧光法测定其酶活性.使用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、纯化重组人SMO蛋白,以此蛋白作为抗原皮内接种日本大耳白兔来制备抗人SMO多克隆抗体.分别以ELISA、Western blot和免疫细胞化学法检测兔血清中抗体的滴度和抗原特异性.结果:纯化并透析复性后的重组人SMO蛋白具备快速氧化精胺的酶活性.用此重组蛋白制备的抗体具有较高抗体滴度和针对人SMO的特异性.结论:建立了人SMO原核表达、纯化系统,获得了有酶活性的高纯度人SMO蛋白并成功制备了兔抗人SMO的多克隆抗体,为以SMO为靶点的抗肿瘤基础和临床研究提供了有力的研究工具.     

抗重组人干扰素-α2b单克隆抗体的制备与应用

<正> 人α型IFN治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎及白血病有显著疗效。rHuIFN-α2b因其副作用小,疗效高,因而更为广泛使用。其生产过程中亲和层析纯化至关重要。为此我们制备了高特异性单克隆抗体3D9McAb用于分离纯化重组人干扰素α-2b(rHuIFN-α2b),现报道如下。1 材料和方法1.1 rHuIFN-α2b抗原制备 本所自制,用亲和层析柱纯化,比活2.0×10~8IU/mg,SDS-PAGE纯度达99％。1.2 单抗的筛选和制备 取8周龄雌Balb/c小鼠,用适当处理过的抗原免疫5次后进行细胞融合。ELISA法筛选,有限稀释法4次克隆后获得3D9细胞扩大培养,诱生腹水。     

人CL-L1基因片段的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 获取重组人CL-L1颈区.糖识别区纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 采用PCR方法扩增人CL-L1颈区.糖识别区目的 基因片段,构建原核表达载体,进行原核表达与蛋白纯化,然后免疫家兔,制备多克隆抗体.采用EIJSA检测抗体效价,免疫印迹法检测蛋白纯度和抗体的特异性.结果 成功构建了人CL-L1颈区.糖识别区原核表达载体pRSET-C/NECK-CRD△K,在E.coli BL21中表达,镍亲和层析柱纯化,得到相对分子质最19 200的融合蛋白,免疫家兔后收获抗血清,ELISA显示抗体效价为1/20 000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组人CL-L1颈区一糖识别区蛋白特异性结合.结论 本研究获得了人CL-L1颈区.糖识别区纯化蛋白,制备了人CL-L1颈区.糖识别区多克隆抗体,为cL厂L1的结构、组织表达谱和功能的研究奠定了基础.     

PCGF1蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的:原核表达人表观抑制因子Polycomb家族成员PCGF1蛋白片段,并制备其鼠源单克隆抗体(mAb)。方法:应用PCR技术扩增人PCGF1基因编码区部分序列(CDS区第382～567bp的DNA片段)并插入到pET-32a(+)质粒中,在大肠杆菌BL21中进行His-PCGF1-128/189融合蛋白(简写为His-N128/189)的原核表达。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和层析纯化。用所获得的纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,分别通过ELISA和Western blot法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定mAb的Ig亚类。取1株杂交瘤细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore公司的mAb纯化试剂盒纯化mAb,用Western blot法检测mAb的效价。结果:表达纯化了重组人His-N128/189蛋白;筛选出2株可稳定分泌特异性抗人PCGF1 mAb的杂交瘤细胞株,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得高效价(1∶6000)、高特异性的鼠抗人PCGF1 mAb。结论:原核表达的PCGF1片段融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应mAb可特异识别内源性和外源性PCGF1蛋白,可以运用于PCGF1基因功能的研究。     

间接血凝试验检测人铜锌超氧化物歧化酶(HCuZn SOD)

人铜锌超氧化物歧化酶是一种以超氧阴离子为底物的特异性酶,具有清除超氧阴离子的功能。我们采用纯化的SOD抗体致敏绵羊红细胞可以半定量的检测患者血清内Cu Zn SOD的含量,以待了解人体衰老、肿瘤等疾病与SOD的相关性。 我们用间接血凝法测定正常人(无特殊体征)血清标本275例,均值200±87.2ng/ml同     

抗核糖核酸酶抑制因子抗体的制备与纯化

目的 :制备并纯化抗核糖核酸酶抑制因子 (RI)的抗体。方法 :从人胎盘中提取RI,经亲和层析纯化后免疫家兔制备RI抗体。用rProteinASepharoseFastFlow层析对抗RI抗体进行纯化 ,并用SDS PAGE、ELISA及Westernblot等进行鉴定。结果 :制备并纯化了抗RI抗体 ,经SDS PAGE分析达到了电泳纯。结论 :获得了效价高、特异性强、稳定性好的抗RI抗体 ,为对其深入研究奠定了基础     

PPM1A蛋白的表达纯化及鼠多克隆抗体制备研究

目的 表达、纯化PPM1A-His融合蛋白及制备鼠多克隆抗体.方法 将pBEX1-PPM1A-His原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内进行诱导表达,用纯化的PPM1A-His融合蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA、免疫组化和免疫荧光检测抗体的灵敏度和特异性.结果 成功表达并纯化了PPM1A-His融合蛋白,纯化后纯度可达90%;ELISA法测定抗体效价为1:100 000;免疫组化和免疫荧光结果显示所制备的抗体可特异性检测肝和肝癌细胞的PPM1A.结论 获得的PPM1A鼠多克隆抗体有较高的效价和特异性,为PPM1A在肝癌的相关研究打下了基础.     

人IgE-Fc结构域的基因克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

目的通过制备小鼠抗人IgE单克隆抗体,为过敏性疾病的研究及诊断打下基础。方法以CRL8033细胞的cDNA为模板扩增人IgE Fcε3-4段基因序列并将其连接到p ET-32a(+)载体中,转化BL21(DE3)大肠杆菌并进行表达。然后将表达所得包涵体进行变复性,把复性所得蛋白进行亲和纯化,通过SDS-PAGE验证纯化效果。最后将纯化的蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,经三次免疫后取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞融合。用ELISA法筛选出能结合人IgE蛋白的阳性克隆,并应用ELISA、Western blot等手段对杂交瘤所分泌单克隆抗体的特异性进行鉴定。结果成功构建p ET-32a(+)-IgE Fcε3-4载体并纯化IgE Fcε3-4蛋白。用该蛋白作为免疫原免疫小鼠,成功制备了杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体能够特异性结合人IgE蛋白,可用于ELISA、Western blot等手段对人IgE的检测。结论成功获得了可用于特异性检测人IgE蛋白的单克隆抗体,为人IgE的检测及哮喘等过敏性疾病的研究、诊断及治疗奠定了基础。     

天然白细胞干扰素制剂中亚型组分的研究

天然人白细胞干扰素-α(IFN-α)有多种亚型,各亚型在人体免疫防御机制中有特定的作用。纯化的IFN-α有否与天然人白细胞IFN-α一样具有相同的亚型,对其临床应用至关重要。本文以纯化IFN-α制备的多克隆抗体,建立了IFN-α的纯化和亚型鉴定方法。首先以部分纯化IFN-α免疫动物制备多克隆抗体,经IFN-α亲和层析进行分离纯化,纯化后用Western blot 证明所制备的抗体特     

免疫亲和层析法纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体

目的：制备可以纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体的免疫亲和层析柱。方法：纯化的抗抗CD3ScFv单克隆抗体与预活化的Sepharose4B偶联制成免疫亲和层析柱,采用自制的免疫亲和层析柱纯化由摇瓶发酵获得的抗Pgp/抗CD3双功能抗体,采用间接免疫荧光法测定抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体能与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合活性。结果：成功地制备了可以纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体的免疫亲和层析柱,采用此柱纯化的抗体与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合的活性与带有E-tag纯化标志的抗体基本一致。结论：此介质可以替代价格高昂的E-tag亲和层析介质在纯化Pgp/抗CD3双特异双功能抗体中的应用,同时还可以避免由于E-tag纯化标志而带来的免疫原性问题,此项研究工作为抗Pgp/抗CD3双功能抗体将来在临床应用奠定了基础。     

兔抗人APE1多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备兔抗人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶多克隆抗体并进行鉴定.方法:以纯化的全长APE1蛋白为抗原, 采用改良的快速免疫法制备兔抗人APE1多克隆抗体并进行特异性亲和纯化, ELISA、Western blot和免疫组化检测制备抗体的效价和特异性.结果:ELISA检测显示该抗体的效价达到1:128 000, 相对亲和力常数为8.96×10-6 mol/L.Western blot显示该抗体能与APE1蛋白特异性结合, 免疫组化检测显示阳性反应产物主要定位于细胞核.此外, 该抗体还可用于小鼠和大鼠组织APE1蛋白的检测.结论:制备的多克隆抗体特异性和效价良好, 不仅为今后深入研究人APE1蛋白的性质与功能提供了有用的实验工具, 还可用于检测小鼠和大鼠组织中APE1蛋白的表达.     

人HSPC011蛋白表达纯化和单克隆抗体制备

目的表达纯化人造血干细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)相关基因HSPC011,并制备其单克隆抗体.方法构建HSPC011原核表达载体,转化至E. coli诱导表达;Ni2+-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化HSPC011蛋白免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术制备单克隆抗体;Western blot法鉴定其特异性;以所得特异性抗体为一抗,使用免疫组化法检测人毛囊毛乳头细胞中HSPC011的表达.结果成功构建了高效原核表达载体pET28a/HSPC011;经IPTG诱导在E.coli中表达了相对分子量约为13 000的目的蛋白;表达产物经纯化后纯度大于90%;获得1株抗HSPC011杂交瘤细胞;Western blot检测多种人体组织样本均在相对分子量约13 000处有一特异性条带;免疫组化检测在毛乳头细胞胞浆中可见阳性着色.结论成功表达纯化了人HSPC011蛋白并制备了其单克隆抗体,为进一步研究HSPC011基因在毛囊周期性生长调控中的具体作用,寻找有临床应用价值的毛囊活性蛋白奠定了基础.     

自制肝素亲和柱分离纯化载脂蛋白H及其抗体制备与鉴定

目的：自制肝素-琼脂糖6B亲和柱提纯人血清载脂蛋白H（apoH）,免疫制备多克隆抗体,为大量制备与进一步研究做准备。方法：利用间接还原胺化法制备亲和层析柱,并优化反应条件。运用高氯酸沉淀、离子交换及亲和层析从人血清中纯化抗原,制备兔源多克隆抗体。结果：自制亲和柱肝素结合量约5mg/g（介质体积）。纯化的抗原经SDS-PAGE鉴定分子量约50kD,无杂带;16种氨基酸组成分析结果与报道一致。多克隆抗体与购置的国外抗体一样,在进行ELISA与dot-ELISA时与小牛血清白蛋白有交叉反应;但在变性且还原的条件下,Western blot结果显示无交叉反应。结论：自制亲和柱成本低、亲和性好、肝素结合稳定,用之分离纯化得到了高纯度apoH;兔多克隆抗体用于检测血清中载脂蛋白H含量时需进一步纯化。