β3整合素在生长因子促血管平滑肌细胞粘附和迁移中的作用

目的:探讨血小板衍生生长因子(PDGF)对β₃整合素表达的影响及β₃整合素在PDGF促血管平滑肌细胞(VSMC)粘附、迁移和增殖中的作用。方法:用抗β₃整合素胞外域抗体封闭VSMCβ₃整合素后,通过-TdR掺入、细胞粘附、细胞迁移分析及RT-PCR等方法,检测PDGF对β₃整合素表达及对VSMC粘附、迁移和增殖的影响。结果:阻断β₃整合素与细胞外基质(ECM)蛋白相互作用后,可在一定程度上抑制PDGF刺激的VSMC增殖,使-TdR掺入率降低39%;在β₃整合素抗体浓度为10mg/L时,PDGF引发的细胞粘附和迁移受到显著抑制(P＜0.05);PDGF作用于VSMC6h,β₃整合素基因表达活性达到峰值,比对照细胞高87%。结论:PDGF可显著诱导β₃整合素在VSMC中表达;β₃整合素与ECM蛋白相互作用在PDGF促VSMC粘附、迁移方面发挥重要作用。     

低氧-复氧对人鼻咽癌细胞增殖、细胞周期、黏附和侵袭能力的影响

目的: 研究细胞外微环境低氧-复氧对人鼻咽癌细胞(CNE-2Z)增殖、细胞周期、黏附和侵袭能力的影响。方法: 以混合气体(5% CO₂, 95% N₂, O₂<0.1%)置换法建立体外低氧培养模型;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期分布;同质黏附实验和细胞-基质黏附实验检测细胞黏附能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果: (1) 低氧24 h后抑制CNE-2Z细胞增殖(P<0.01),复氧后细胞快速增殖,在复氧第5 d A值与常氧对照组相比无显著差异(P>0.05);(2) 低氧24 h后细胞阻滞于G₁期(P<0.01),复氧后G₁期阻滞得到快速解除,在复氧24 h细胞周期分布与常氧对照组相比无显著差异(P>0.05);(3)低氧24 h后细胞的同质黏附能力下降(P<0.01)而细胞-基质黏附能力无明显改变(P>0.05),细胞侵袭能力降低(P<0.01);复氧24 h细胞同质黏附能力恢复至常氧对照组水平(P>0.05),而细胞-基质黏附能力(P<0.01)和细胞侵袭能力较常氧对照组显著增加(P<0.01)。结论: 鼻咽癌细胞能耐受微环境低氧的不利影响;低氧环境下存活的鼻咽癌细胞产生的适应性变化赋予肿瘤更强的增殖和转移潜能,从而促进肿瘤细胞的恶性演进。     

细胞外基质促血管平滑肌细胞迁移及β3整合素和粘着斑激酶表达

目的:研究细胞外基质(ECM)蛋白促血管平滑肌细胞(VSMC)迁移与β₃整合素及粘着斑激酶(FAK)表达之间的关系。方法:应用细胞迁移实验观察骨桥蛋白(OPN)和纤连蛋白(FN)对VSMC迁移活性的影响,利用RT-PCR和Western印迹探讨β₃整合素、FAK和转录因子Gax表达与细胞迁移之间的关系。结果:VSMC经10、20mg/LOPN和20mg/LFN处理后,迁移活性分别达对照组的1.36、1.57和1.26倍(P＜0.05)。用相同浓度(20mg/L)OPN和FN刺激细胞,随着作用时间延长,VSMC迁移距离逐渐增加。Western印迹和RT-PCR结果证实,两种基质蛋白促进VSMC迁移与诱导β₃整合素和FAK基因表达及抑制转录因子Gax表达有关。结论:β₃整合素-FAK是介导OPN和FN促VSMC迁移的信号途径之一。     

一种用于定量研究细胞缺氧的简易模型

目的:建立一种可用于定量研究培养细胞缺氧的实验模型。方法:用厚有机玻璃制作一带有控制气体出入管道的缺氧箱;用混合气(94%N₂+6%CO₂)吸空箱内气体, 然后注入一定体积的空气, 以达到研究所需氧浓度。将A549肺癌细胞置缺氧箱内培养, 检测不同缺氧时段箱内O₂和CO₂的浓度, 以及不同氧浓度下细胞培养液的酸度变化和细胞存活分数。结果:应用该实验模型获得了预计的氧浓度;细胞培养结果表明, 在细胞缺氧培养5 h以内箱内气体浓度无明显变化;细胞存活分数和培养液pH值随缺氧程度的加重和时间延长而下降。结论:该模型可应用于定量研究细胞缺氧, 具有简便、实用、可靠等特点。     

小鼠早期完整胚胎诱导子宫内膜白血病抑制因子和整合素β3表达并提高子宫容受性

目的: 探讨小鼠早期胚胎诱导子宫内膜容受性改变的空间结构,确定胚胎各个部分能否引起子宫内膜容受性中白血病抑制因子(LIF)和整合素β₃改变。方法: 选用6~8周昆明雌鼠,体外实验分为子宫内膜培养前组、子宫内膜单纯培养组、子宫内膜全胚胎共培养组、子宫内膜卵裂球共培养组、子宫内膜透明带共培养组,各组培养2 d后收集子宫内膜行下一步检测;体内实验分为胚胎移植前组、单纯培养液移植组、全胚胎移植组、卵裂球移植组、透明带移植组及正常妊娠未干预组,移植后2 d收集子宫内膜行下一步检测。荧光定量PCR检测整合素β₃和LIF mRNA表达;免疫组织化学及Western blotting检测整合素β₃和LIF的蛋白表达部位及表达水平。结果: 体外实验子宫内膜全胚胎共培养组中子宫内膜的整合素β₃ 和LIF表达显著高于其它组,体内实验正常妊娠未干预组的整合素β₃ 和LIF表达显著高于其它组。结论: 完整胚胎可显著提升小鼠孕早期子宫内膜容受性因子整合素β₃ 和LIF的表达,而单纯透明带或卵裂球则不能明显增加整合素β₃ 和LIF的表达。早期胚胎诱导子宫内膜容受性可能需要完整胚胎结构的存在。     

多种粘附分子基因在原发性肝癌的表达及其临床意义

目的:探讨多种粘附分子基因在原发性肝癌中的表达及其临床意义。方法:取64例用RT-PCR法半定量检测肝癌粘附分子的基因表达情况,分析其临床意义。结果:(1)原发性肝癌各粘附分子的表达率分别为:E-钙粘蛋白 90.62%、细胞间粘附分子-1 93.75%、粘附分子CD44 50.00%、粘附分子CD_44V 96.88%、整合素α₅ 100%、整合素β₁ 100%,CD44与其他粘附分子表达率的差异显著。(2)肝癌组织各粘附分子E-钙粘蛋白 、细胞间粘附分子-1 、粘附分子CD44、粘附分子CD_44V 、整合素α₅、整合素β₁ mRNA的表达量分别为:1.24±0.54、0.96±0.37、0.62±0.73、0.86±0.33、 0.97±0.49、1.41±0.24,其中粘附分子CD44与E-钙粘蛋白、整合素β₁的表达量差异显著。(3)肝癌分期与粘附分子基因mRNA表达量的关系显示:E-钙粘蛋白、粘附分子CD44的表达量随分期增高而下降,其中粘附分子CD44Ⅰ-Ⅱ期和Ⅳ期的表达量差别显著;细胞间粘附分子-1、粘附分子CD_44V,整合素α₅、整合素β₁的表达量随分期增高而增高,其中细胞间粘附分子-1Ⅰ-Ⅱ期和Ⅳ期的表达量差别显著。(4)肝癌粘附分子基因mRNA表达量与临床病理生理特点相关分析显示:肝癌粘附分子基因mRNA表达量与肿瘤大小、有无转移、有无包膜和结节数目有关,与AFP水平、肝硬化情况、肝功能状况无关。结论:肝癌粘附分子基因mRNA的表达存在明显的差异,粘附分子CD44表达缺失率高。肝癌粘附分子基因mRNA的表达与肿瘤大小、有无转移、结节数目、有无包膜相关。     

bFGF促进内皮细胞β1整合素表达及其意义探讨

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子对血管内皮细胞β₁整合素表达的影响。方法:采用WesternBlot法结合图像处理分析,检测bFGF作用前后培养血管内皮细胞β₁整合素的表达。结果:bFGF处理组和对照组平均灰度值分别为166.11±9.86和175.32±5.12,两组免疫酶显色有显著差异。结论:bFGF能够诱导内皮细胞膜表面β₁整合素合成增加。推测bFGF通过上调内皮细胞β₁整合素表达,可能在促进血管生成方面有重要作用。     

低氧时钙离子对冠状动脉内皮细胞释放ET-1、NO、PGI2的影响

目的:探讨低氧引起冠状动脉内皮细胞(CAEC)释放ET-1、NO和PGI₂改变的机制。方法:运用放射性[⁴⁵Ca²⁺]掺入、放免和比色等方法, 测定常氧组、低氧组冠状动脉内皮细胞钙摄取率, 以及常氧组、低氧组、低氧+维拉帕米组冠状动脉内皮细胞培养液中ET-1、NO和PGI₂含量。结果:低氧组CAEC[⁴⁵Ca²⁺]摄取率为(29.6±3.7)ng/gprotein/30min, 常氧对照组为(15.2±1.1)ng/gprotein(P<0.01).低氧+维拉帕米组ET-1分泌量显著多于低氧组(P<0.01).低氧+维拉帕米组分泌的NO显著低于低氧组(P<0.05), 与常氧组相差不显著。低氧+维拉帕米组分泌的PGI₂显著多于低氧组, 与常氧组相差不显著。结论:低氧时引起的NO、ET-1、PGI₂分泌改变与低氧引起的冠状动脉内皮细胞Ca²⁺内流增加有关。     

钾通道对大鼠肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i的调节

目的:探讨在常氧、低氧条件下钾通道对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)[Ca²⁺]_i的调节。方法:采用钙荧光探针(Fura-2/AM)负载培养的大鼠PASMCs,观察常氧、低氧培养后3种钾通道抑制剂(4AP,TEA、Glib)对PASMCs[Ca²⁺]_i的调节,同时用四唑盐(MTT)比色法比较4AP、TEA、Glib对大鼠PASMCs增殖的影响。结果:(1)常氧状态下,PASMCs[Ca²⁺]_i为(156.91±8.60)nmol/L,低氧时为(294.01±16.81)nmol/L(P＜0.01)。(2)常氧状态下,4AP可引起PASMCs[Ca²⁺]_i升高,达(280.52±23.21)nmol/L(P＜0.01),而TEA、Glib无此作用。(3)低氧时,4AP和TEA都可引起PASMCs[Ca²⁺]_i的升高,分别为(422.41±24.28)nmol/L、(380.84±11.02)nmol/L(P<0.01),Glib无作用。(4)MTT比色法中,常氧和低氧状态下4AP均引起吸光度(A)值升高,分别是0.582±0.062,0.873±0.043(P＜0.01)。TEA仅在低氧时A值升高(0.729±0.041,P＜0.05),而Glib无论常氧还是低氧均无影响。结论:无论常氧还是低氧条件下,电压依赖性钾通道(K_V)对PASMCs[Ca²⁺]_i及其增殖起主要作用。钙激活的钾通道(K_Ca)在常氧条件下对[Ca²⁺]_i不起调节作用,而在低氧下使[Ca²⁺]_i降低,反应性地调节PASMCs增殖。ATP敏感性钾通道(K_ATP)无论在常氧还是低氧情况下对[Ca²⁺]_i的调节不起作用。     

氧体积分数变化与大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及迁移*

背景：研究表明,细胞分化程度低的骨髓间充质干细胞移植在缺血环境的转归对疗效有很大影响。 目的：探讨氧体积分数改变对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和归巢能力的影响。 方法：分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,分别在低氧(体积分数1%O2)和常氧(体积分数20%O2)条件下培养0~7 d。细胞Transwell小室迁移实验分组为4组：体积分数1%O2培养1%O2迁移组、体积分数20%O2培养1%O2迁移组、体积分数1%O2培养20%O2迁移组和体积分数20%O2培养20%O2迁移组,比较不同氧体积分数变化条件下迁移细胞数。观察不同氧体积分数变化对间充质干细胞表达整合素β1和细胞间黏附分子1的影响,实验分为4组：恒定体积分数20%O2培养;恒定体积分数1% O2培养;体积分数20%O2培养后1%O2继续培养6 h;体积分数1%O2培养后20%O2继续培养6 h。 结果与结论：骨髓间充质干细胞在体积分数1%O2环境下增殖能力及迁移能力均增强,在体积分数20%O2环境下增殖能力及迁移能力减弱(P < 0.05);整合素β1表达水平在体积分数1%O2环境下增强(P < 0.05)。提示大鼠骨髓间充质干细胞移植在低氧(体积分数1%O2)下增殖和迁移能力增强。关键词：低氧;骨髓间充质干细胞;移植;整合素β1;迁移 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.19.005     

慢性缺氧应激可能通过EMT增强乳腺癌MCF-7细胞恶性生物学行为

目的:探讨慢性缺氧应激对人乳腺癌MCF-7细胞恶性生物学行为的影响及可能机制。方法:将人乳腺癌MCF-7细胞分为缺氧组(1%O_2、5%CO_2和94%N_2)和正常对照组(常氧)进行培养。利用MTT法、CCK-8实验、细胞直接计数法及细胞侵袭和迁移实验对MCF-7细胞活力、增殖及侵袭和迁移能力进行检测;用软琼脂集落形成实验及Matrigel 3D培养技术检测MCF-7细胞非锚定生长能力及极性改变情况;利用MCF-7细胞构建裸鼠皮下种植瘤模型,检测慢性缺氧应激对体内肿瘤生长及肺转移的影响;利用倒置显微镜观察MCF-7细胞形态改变;Western blot检测低氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)和磷酸化的糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在缺氧环境下表达水平的改变,以及E-钙黏连蛋白(E-cadherin)、N-钙黏连蛋白(Ncadherin)、波形蛋白(vimentin)、基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)、MMP-9等上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达水平。结果:与正常对照组相比较,慢性缺氧组MCF-7细胞活力、增殖能力及侵袭迁移能力增强,细胞非锚定生长能力提高且在3D培养系统更容易发生极性改变,呈现侵袭样生长,体内生长及转移能力增强;除了HIF-1被缺氧诱导表达升高外,GSK-3β呈现活化趋势,且上皮样标志物E-cadherin蛋白表达水平明显下降,而间充质样标志物N-cadherin、vimentin、MMP-3和MMP-9蛋白表达水平明显升高。结论:慢性缺氧应激促进了乳腺癌细胞恶性生物学行为,且其机制可能与EMT有关。     

EphA2在乳腺癌中的表达及其与上皮间质转化的关系

目的　研究EphA2、上皮间质转化（EMT）在乳腺癌中的表达情况及意义,探讨EphA2与EMT在乳腺癌的侵袭与转移过程中的关系。 方法　采用免疫组织化学方法检测30例乳腺纤维瘤组织和110例乳腺癌中EphA2、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、β-连环蛋白（β-catenin）、波形蛋白（vimentin）的表达情况,分析其与乳腺癌临床病理因素的关系及EphA2、E-cadherin蛋白、β-catenin蛋白、vimentin蛋白表达的相关性。 结果　在30例乳腺纤维瘤组织中EphA2、E-cadherin蛋白、β-catenin蛋白、vimentin蛋白阳性率分别为20%、90%、26.67%、13.33%,在110例乳腺癌中的阳性率分别为61.82%、34.54%、64.54% 、68.18%。EphA2的高表达、E-cadherin蛋白的低表达、β-catenin蛋白和vimentin蛋白的高表达与临床分期、淋巴结转移、组织学分级显著相关（P<0.05）,EphA2的高表达与E-cadherin蛋白的低表达呈负相关（P<0.05）,与β-catenin蛋白、vimentin蛋白的高表达呈正相关（P<0.05）。 结论　EphA2、E-cadherin蛋白、β-catenin蛋白、vimentin蛋白与乳腺癌的侵袭与转移有相关性;EphA2可能通过调控E-cadherin蛋白、β-catenin蛋白、vimentin蛋白的表达来促进EMT,进而在乳腺癌的侵袭和转移过程发挥重要作用。     

低氧通过上调乙酰辅酶A羧化酶1促进肺腺癌A549细胞迁移

目的 探讨低氧通过乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）促进人肺腺癌A549细胞迁移的机制。 方法 低氧（5％ O2）处理肺腺癌A549细胞,应用Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,Western blotting检测ACC1表达及上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的表达水平。 结果 与常氧（对照组）相比,低氧处理促进了A549细胞的迁移（P＜0.01）,低氧处理后ACC1表达上调（P＜0.01）,同时波形蛋白（vimentin）表达增加（P＜0.05）,E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达下降（P＜0.01）;敲除ACC1后与对照组相比,A549细胞的迁移能力减弱（P＜0.05）,vimentin表达下降（P＜0.05）,E-cadherin表达增加（P＜0.01）;敲除ACC1后A549细胞在常氧和5％ O2条件下迁移数目及vimentin、E-cadherin表达变化无统计学意义（P＞0.05）;补充亚油酸（LA）恢复低氧对A549细胞的促迁移作用（P＜005）。 结论 低氧通过上调ACC1的表达促进肺腺癌A549细胞迁移及EMT转化。     

低氧对卵巢癌SKOV3细胞乙酰肝素酶表达及侵袭力的影响

目的：探讨低氧对卵巢癌细胞乙酰肝素酶(HPA)表达及侵袭力的影响。方法:将SKOV3细胞置于常氧(37 ℃，5％CO2，21％O2)和低氧(37 ℃，5％CO2，1％O2) 12、24、36 h条件下培养，采用RT-PCR及Western blotting方法对HPA表达进行检测，采用基质凝胶侵袭实验测定各组细胞侵袭力。结果:与常氧组比较，SKOV3细胞在低氧12、24、36 h HPA mRNA表达增高，以12h增加显著，蛋白表达则依次增加，各组比较差异显著(P<0.01)，而低氧各组间比较，HPA表达量亦不同(P<0.05)；常氧组侵袭细胞数与低氧12、24、36 h组比较差异显著(P<0.05)，且低氧引起的细胞侵袭力的提高呈时间依赖性，随着低氧时间延长，侵袭细胞数逐渐增多，组间比较有显著差异(P<0.05)；低氧时HPA蛋白表达的变化与细胞侵袭力变化呈正相关(r=0.8530，P<0.05)。结论:低氧可提高SKOV3细胞HPA的表达及细胞的侵袭力，且侵袭力的增加可能与HPA表达水平增高有关。     

RNA干扰技术抑制上皮性钙黏附分子表达对HO-8910细胞的影响

目的 探讨通过RNA干扰(RNAi)技术下调上皮性钙黏附分子(E-cad)表达后,对人卵巢浆液性囊腺癌HO-8910细胞的侵袭、迁移能力的影响.方法 将针对E-cad的双链小干扰RNA(siRNA)转染入HO-8910细胞中,抑制E-cad基因表达;采用免疫荧光法及Western blotting检测RNAi效果;用Transwell小室法检测RNAi后细胞侵袭、迁移能力的改变.结果 RNAi后HO-8910细胞E-cad表达显著下降,由63.7%降低为11.9%(P＜0.01),RNAi有效;细胞对细胞外基质的侵袭能力明显提高,穿过滤膜的细胞数由13.4±3.93增至42.0±4.15(P＜0.01);细胞迁移能力也明显提高,穿过滤膜的细胞数由23.24±3.71增至82.0±5.51(P＜0.01).结论 人卵巢浆液性囊腺癌的侵袭、转移等恶性行为可能与E-cad基因表达下降有关.     

下调MARCH8基因的表达对宫颈癌Siha细胞侵袭、迁移与增殖的影响

目的：研究下调MARCH8基因表达对人宫颈癌Siha细胞侵袭、迁移、增殖以及克隆的影响,并探讨其可能的作用机制。方法：构建特异性针对MARCH8基因的siRNA片段,并将其通过脂质体介导转染至宫颈癌Siha细胞,同时设立转染无义序列的阴性对照组。分别采用Real-time PCR法与蛋白质印迹法检测转染后,细胞中MARCH8在mRNA和蛋白水平上的表达改变。通过Transwell小室实验、划痕实验检测MARCH8表达下调对细胞侵袭、迁移能力的影响,通过CCK-8法、细胞平板克隆实验检测MARCH8表达下调对细胞增殖、克隆形成能力的影响,并采用蛋白质印迹法检测MARCH8基因表达下调对基质金属蛋白酶9（MMP9）,波形蛋白（Vimentin）以及增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达的影响。最后采用蛋白质印迹法检测MARCH8基因表达下调,对Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin以及E钙黏蛋白（E-cadherin）表达的影响。结果：与转入siRNA-NC组相比,转入siRNA-MARCH8组细胞MARCH8在 mRNA和蛋白表达水平上均明显降低,细胞的侵袭、迁移以及增殖和克隆形成能力明显被抑制（P<0.05）,且侵袭标记蛋白MMP9,Vimentin以及增殖标记蛋白PCNA的表达也明显下降。MARCH8基因表达成功下调后,转入siRNA-MARCH8组细胞中β-catenin蛋白的表达水平较阴性对照组明显下降（P<0.05）,而E-cadherin蛋白的表达水平明显升高（P<0.05）。结论：下调MARCH8基因的表达可以抑制宫颈癌Siha细胞的侵袭、迁移、增殖和克隆能力,其机制可能与Wnt/β-catenin通路的抑制有关。     

转录因子Runx2对人乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮-间充质转化能力的影响

目的:建立稳定敲减Runt相关转录因子2(Runx2)表达的人乳腺癌MDA-MB-231细胞系,探讨Runx2对MDA-MB-231细胞上皮-间充质转化(EMT)、转移和侵袭能力的影响。方法:利用LV-Runx2-RNAi慢病毒载体感染MDA-MB-231细胞,构建稳定低表达Runx2的MDA-MB-231细胞株,检测比较Runx2表达水平对MDA-MB-231细胞的形态及E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达的影响。侵袭实验和软琼脂集落形成实验分析比较抑制Runx2表达对乳腺癌细胞侵袭和非锚定生长能力的效应。结果:E-cadherin蛋白表达在敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞中明显高于常规MDA-MB-231细胞(P0.05),而N-cadherin、β-catenin和MMP-9蛋白表达在敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞中明显低于常规MDA-MB-231细胞(P0.05)。敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞侵袭和非锚定生长能力明显低于常规MDA-MB-231细胞(P0.05)。结论:在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中抑制Runx2表达可以通过调控EMT相关蛋白的表达进而抑制乳腺癌细胞的EMT过程,从而对细胞的侵袭和转移起负调控作用。