益骨胶囊含药血清对共育体系中破骨细胞活性和凋亡的影响

目的： 观察益骨胶囊含药血清在成骨-破骨细胞共育体系中对SD大鼠破骨细胞（OC）活性和凋亡的影响。 方法： (1)取1d龄SD大鼠颅骨分离培养成骨细胞（OB），取5d龄SD大鼠四肢股骨、胫骨分离培养OC，建立细胞上清相通但细胞间不相互混杂的平面式成骨-破骨细胞共育体系，实验分为含药血清组和对照组；（2）将10月龄SD雌性大鼠分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水对照组，制备含药血清和对照血清；（3）重氮盐法检测抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和光镜观察骨陷窝数；（4）光镜和荧光显微镜下观察共育体系中OC凋亡情况。 结果： 含药血清组在48 h、72 h、96 h对成骨-破骨细胞共育体系中OC分泌TRACP的活性均明显降低于对照组，OC的存活数明显低于对照组，OC的凋亡率明显高于对照组且呈明显的时效关系；所形成骨吸收陷窝的数目明显低于对照组(P<0.01)。 结论： 益骨胶囊含药血清在共育体系中能够抑制OC活性，诱导破骨细胞的凋亡。     

益骨胶囊含药血清在共育体系中对大鼠成骨细胞增殖、ALP 活性及IL-11 mRNA表达的影响

目的：观察益骨胶囊含药血清在成骨-破骨细胞共育体系中对SD大鼠成骨细胞(OB)增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性及白细胞介素-11(IL- 11)mRNA表达的影响。方法：(1)取1d龄SD大鼠颅骨分离培养OB，取5 d龄 SD大鼠四肢股骨、胫骨分离培养破骨细胞(OC)，建立细胞上清相通但细胞间不相互混杂的平 面式成骨- 破骨细胞共育体系，实验分为两组(含药血清组和对照组)。 (2) MTT法检测OB增殖，氨基安替吡啉测酚法测定ALP活性，FQ-PCR法测定IL-11 mRNA相对表达量。结果：含药血清组中OB的A值、ALP活性、IL-11/β-actin比值均高于对照组(P<0.05) 。结论：益骨胶囊含药血清在共育体系中可促进OB增殖、增强OB ALP活 性，提高IL-11 mRNA的表达。     

抗骨松丹杞颗粒含药血清对成骨-破骨细胞共培养体系中破骨细胞功能的影响

目的:观察补肾方抗骨松丹杞颗粒含药血清在成骨-破骨细胞共同培养体系中对大鼠破骨细胞(OC)骨吸收功能的影响。方法:取1 d龄SD大鼠的胎鼠颅骨与四肢骨分别分离、培养成骨细胞和破骨细胞,建立细胞上清相通但细胞间不相互混杂的平面式成骨-破骨细胞共育体系,实验分为不同浓度(低、中、高)的补肾方含药血清组和对照组进行比较,用重氮盐法检测抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和光镜观察骨陷窝数。结果:25%的补肾方含药血清组在48 h、72 h、96 h成骨-破骨细胞共育体系中OC分泌TRAP的活性明显降低于对照组;25%的补肾方含药血清组在48 h、72 h、120 h所形成骨吸收陷窝的数目明显低于对照组(P0.01)。结论:补肾方抗骨松丹杞颗粒含药血清在共育体系中能够抑制OC活性。     

益骨胶囊含药血清对共育体系中成骨细胞表达骨保护素mRNA的影响

目的 观察益骨胶囊含药血清在成骨-破骨细胞共育体系中对SD大鼠成骨细胞表达骨保护素(OPG)mRNA的影响.方法 取1d龄SD大鼠颅骨分离培养成骨细胞(OB);取5d龄SD大鼠四肢长骨分离培养破骨细胞(OC).建立上清相通但细胞间不相互混杂的平面式成骨-破骨细胞共育体系,实验分为含药血清组和对照组.将10月龄SD雌性大鼠分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水对照组,制备含药血清和对照血清.检测共育体系中成骨细胞OPG mRNA的表达.结果 含药血清组与对照组比较,OPGmRNA表达明显升高(8.2567±0.1118比3.3350±0.9854),差异有统计学意义(P＜0.01).结论 益骨胶囊含药血清在共育体系中通过刺激OB表达OPG来实现对OC的活性和凋亡的调节.     

梓醇对OB-OC共育体系中OB、OC活性及OBERα、βmRNA表达的影响

目的:观察中药单体梓醇在成骨-破骨共育体系中对成骨细胞(OB)增殖、OB碱性磷酸酶(ALP)活性、破骨细胞(OC)活性及OB雌激素受体(ER)α及βmRNA表达的影响,从细胞水平阐释其防治骨质疏松症的作用机制。方法:分别选取1 d和5 d SD大鼠分离培养OB和OC,并建立OB-OC共育体系;在共育体系中,用MTT法检测低浓度(0.05、0.1、0.5、1 mg/L)、中浓度(2、5、10 mg/L)和高浓度(20、50和100 mg/L)梓醇干预下的OB增殖率,并以梓醇最佳促OB增殖浓度进行后续实验,实验分为对照组和梓醇组。p NPP法检测各组OB的ALP活性;光镜观察OC骨吸收陷窝数目;重氮盐法检测OC抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性;RT-PCR方法检测OB ERα及ERβmRNA的表达。结果:在OB-OC共育体系中,0.05~2 mg/L梓醇各组中OB的增殖率显著高于对照组(P0.01),且0.05 mg/L梓醇组促进OB增殖的能力明显高于其它浓度组(P0.01),5~100 mg/L梓醇各组OB的增殖率与对照组比较无显著差异(P0.05)。0.05 mg/L梓醇组的ALP水平高于对照组(P0.05),并在作用48、72和96 h后均对OC骨吸收陷窝数及TRAP有明显抑制作用(P0.01);0.05 mg/L梓醇组OB中ERαmRNA的表达与对照组相比差异无统计学意义(P0.05),而ERβmRNA的表达显著高于对照组(P0.05)。结论:梓醇在共育体系中可提高OB增殖和成骨活性,抑制OC活性并上调OB中ERβmRNA的表达。     

建立小鼠成骨与破骨细胞相互作用的共育新体系

背景：众所周知,骨重建是骨组织中重要的生物学反应过程,其中成骨细胞与破骨细胞发挥了关键作用。但目前,关于骨重建中成骨与破骨细胞间信号传递的深层机制还不清楚。 目的：利用transwell技术,在体外建立一种成骨与破骨细胞的新型共育体系,为深入研究骨重建中成骨与破骨细胞的相互作用提供成熟的实验模型。 方法：采用MC3T3-E1成骨样细胞株与RAW264.7破骨前体细胞株,进行体外成骨与破骨细胞的诱导分化,并利用Transwell共培养板(0.4 µm聚酯膜)建立成骨与破骨细胞的共育体系。共培养6 d后,通过测定细胞活性和碱性磷酸酶(ALP)活力分析成骨细胞的增殖和分化活性,利用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝(TB)染色、TRAP活性测定及扫描电镜技术观察破骨细胞的分化及骨吸收功能。 结果与结论：共培养体系中成骨样细胞的无限增殖能力减弱,而分化活性明显增强,同时破骨前体细胞被诱导分化为成熟的破骨细胞,并具有一定的骨吸收功能。因此,该共培养体系可用于骨重建中成骨与破骨细胞间信号通路的深层研究。     

应用破骨细胞-颅骨联合培养体系研究先天性成骨不全的骨再建过程

目的　采用先天性成骨不全(OI)小鼠,oim/oim为动物模型,应用破骨细胞-颅骨联合培养体系研究OB和OC两种细胞在OI骨再建过程中的功能改变和相互作用。 方法　实验采用小鼠颅骨（CAL）组织培养,实验设两组：WTCAL-WTOC组：联合培养对照组颅（WTCAL） 与对照破骨细胞（WTOC）;OICAL-OIOC组：联合培养OI颅骨（OICAL）与OI破骨细胞（OIOC）。以免疫组化染色方法　-TRAP识别破骨细胞,ALP免疫组化染色方法识别成骨细胞。破骨细胞骨吸收活性为骨吸收陷窝占颅骨表面百分比。单位OC吸收面积为总骨吸收陷窝除以破骨细胞数。 结果　于7d,OICAL-OIOC组破骨细胞数低于WTCAL-WTOC组;OICAL-OIOC组的OC/OB比例低WTCAL-WTOC组;OICAL-OIOC组单位破骨细胞吸收能力高于WTCAL-WTOC组。 结论　OI的小鼠模型骨再建中骨量丢失一方面由于其成骨细胞功能异常,另一方面也可能因为其破骨细胞的代偿性功能活跃。     

TNF-α对共育体系中成骨细胞凋亡的影响及益骨胶囊含药血清的保护作用

目的： 探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对成骨-破骨细胞共育体系中成骨细胞（OB）凋亡的影响及益骨胶囊含药血清的保护作用。方法: （1）将20只10月龄SD大鼠随机分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水灌胃组，制备含药血清与空白血清；（2）将分离的OB与破骨细胞（OC）分别接种到共育体系中，加培养液培养后， 同时添入20 μg/L、30 μg/L、40 μg/L、50 μg/L、60 μg/L TNF-α分别作用24 h、48 h、72 h诱导OB 凋亡，用DNA电泳法确定最佳诱导方案；(3）将细胞分为TNF-α组、TNF-α+含药血清组、TNF-α+空白血清组和正常对照组，分别加入DMEM培养液、含药血清培养液、空白血清培养液、DMEM培养液，除正常对照组加入PBS外，其它各组均同时加入60 μg/L TNF-α，培养72 h后，用荧光染色法、DNA电泳法、流式细胞仪观察各组OB凋亡情况。结果: (1）60 μg/L TNF-α作用72 h后，共育体系中OB DNA电泳呈较典型的梯形改变；(2）TNF-α+含药血清组中OB DNA电泳仅出现二个条带，荧光染色可见大多数细胞均匀染色，其凋亡率（9.60%±0.26%）明显低于TNF-α组(26.90%±0.06%)与TNF-α+空白血清组(18.10%±0.06%)，P＜0.01。结论: 60 μg/L TNF-α作用72h可诱导共育体系中OB凋亡；益骨胶囊含药血清对TNF-α诱导的OB凋亡具有抑制作用。     

清络通痹颗粒对滑膜成纤维细胞与单核细胞共培养诱生的破骨样细胞的影响

目的:建立关节炎大鼠滑膜成纤维细胞和单核细胞共培养诱生破骨样细胞的方法,研究清络通痹颗粒对破骨样细胞分化、增殖的影响及机制。方法:分离佐剂性关节炎大鼠外周血单核细胞和滑膜组织,将滑膜成纤维细胞和单核细胞共培养诱生破骨样细胞并以TRAP染色鉴定;制备清络通痹颗粒含药血清,加入共培养体系,MTT法检测破骨样细胞增殖、TRAP试剂盒检测培养上清TRAP活性、扫描电镜观察骨吸收作用、ELISA法检测培养上清中IL-1、TNFα-和RANKL水平。结果:关节炎大鼠滑膜成纤维细胞和外周血单核细胞共培养可诱生出破骨样细胞;清络通痹颗粒3.6、7.2、14.4 g/kg给药的大鼠含药血清可不同程度抑制破骨样细胞的增殖、TRAP活性和骨吸收,降低培养上清中IL-1、TNFα-和RANKL的水平。结论:清络通痹颗粒可抑制共培养诱生的破骨细胞的分化和活性,这一作用与抑制共培养体系中细胞因子的过度分泌有关。     

益骨胶囊含药血清对大鼠破骨细胞凋亡和分泌抗酒石酸酸性磷酸酶的影响

目的:观察益骨胶囊含药血清对体外培养的大鼠破骨细胞(OC)分泌抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和凋亡的影响。方法:(1)将20只12月龄SD大鼠随机分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水灌胃组, 制备含药血清和对照血清;(2)分离培养新生SD大鼠OC, 加血清培养后, 重氮盐法检测TRAP, 倒置显微镜下观察OC存活数及荧光染色法观察OC凋亡情况。结果:与空白血清组比较, 含药血清组在24h、48h和72h时TRAP的活性均明显降低, OC存活数明显降低, 凋亡比率明显高(P<0.01或P<0.05)。结论:益骨胶囊含药血清可以抑制体外培养OC分泌TRAP, 诱导OC凋亡, 提示这可能是该方防治骨质疏松的机理之一。     

从细胞水平研究龟鹿二仙含药血清在治疗骨质疏松中的作用

从细胞水平研究龟鹿二仙含药血清在治疗骨质疏松中的作用.(1)用酶消化法获得新生大鼠的成骨细胞.碱性磷酸酶(ALP)染色进行鉴定,通过对成骨细胞增殖、胰岛素样生长因子(IGF-1)分泌的检测来考察成骨细胞功能.(2)用1,25(OH)2D3诱导骨髓单核细胞获得破骨细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定破骨细胞.电镜扫描观察破骨细胞形成的骨凹陷情况;同时检测TRAP( )细胞数和破骨细胞TRAP活性.(3)用血清药理学方法制备龟鹿二仙含药血清,分别加入不同剂量组10%含药血清进行干预,观察该中药血清对上述成骨细胞和破骨细胞功能指标的影响.龟鹿二仙高剂量组血清可促进成骨细胞增殖,增加IGF-1的分泌量.而中剂量组血清可明显抑制骨髓细胞向破骨细胞的转化,抑制骨凹陷形成,降低细胞内TRAP的活性.本研究表明龟鹿二仙具有显著的抗骨质疏松作用.     

流体剪应力对大鼠破骨细胞骨吸收活性的影响

探讨流体剪应力对大鼠破骨细胞骨吸收活性的影响。我们采用低温离心法获取6月龄健康雌性SD大鼠椎骨骨髓细胞,以1.6×106细胞密度种植于血盖片上,采用1,25-(OH)2维生素D3体外诱导获取破骨细胞。于破骨细胞诱导的第7d取出细胞爬片,置于流体剪应力装置中,分别加载5.97、11.36、16.08、20.54dyne/cm2大小的流体剪应力,持续30min,以未加载流体剪应力的破骨细胞为对照组。实验结束时,以2.5%戊二醛固定细胞爬片,置于0.25mol/L氢氧化铵液超声处理10min,清除细胞爬片上的破骨细胞,经1%硪酸固定,梯度酒精脱水,醋酸异戊酯置换酒精,CO2临界点干燥,喷金后扫描电镜观察骨吸收陷窝并计数,图像分析法测定骨吸收陷窝的面积;同时分别收集每次灌流液10ml,冻干,用1ml复溶后,紫外分光光度仪检测抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)活性的变化。结果显示:在本实验中所选用的流体剪应力可增强破骨细胞TRAP活性,而骨吸收陷窝的数量和面积也增加,尤其是剪应力在16.08dyne/cm2时,破骨细胞TRAP活性增强以及骨吸收陷窝的数量和面积增高最为明显。结果表明,一定范围内的流体剪应力可以增强破骨细胞的骨吸收活性。     

免疫活性细胞对骨代谢的调控作用

1 骨免疫学的概念 骨形成和骨吸收之间的平衡调节着骨内环境稳定，这包括有成骨细胞（Osteoblasts，OB）和破骨细胞（Osteoclasts，OC）间相互的协调作用。OB是骨形成细胞，可分泌骨基质分子；而来源于造血前体细胞的OC则吸收骨基质。     

周期性张应变对破骨前体细胞和破骨细胞增殖和抗酒石酸酸性磷酸酶的影响

目的研究不同强度的力学载荷对破骨细胞及其前体细胞增殖、分化和功能的影响。方法以破骨诱导液培养RAW264.7破骨前体细胞,同时施加3 d的周期性张应变,然后培养4 d;另外一组RAW264.7细胞以破骨诱导液培养4 d,将其诱导为破骨细胞,再施加3 d的周期性张应变。结果在不同张应变下,两组细胞增殖活性的变化大致相同,但细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatage,TRAP)活性和破骨细胞(TRAP阳性多核细胞)数量的变化明显不同。在2 500με的中等强度张应变下,第1组的TRAP活性降幅和破骨细胞数量减幅均最高,而后者TRAP活性降幅和破骨细胞数量减幅均最低。结论不同张应变对分化初期破骨前体细胞和已分化出破骨细胞的破骨前体细胞的破骨分化和功能状态的影响有明显差异。     

破骨细胞骨吸收上清液对骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的研究破骨细胞骨吸收活动中的分泌产物对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。方法诱导小鼠脾脏细胞为破骨细胞,用抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)染色。破骨细胞与牛骨磨片共培养,扫描电镜观察骨吸收陷窝。收集骨吸收实验破骨细胞培养上清液作用于小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC),MTT法检测BMSC生长曲线;成骨诱导后钙化结节茜素红染色法检测BMSC成骨能力;成脂诱导后油红O染色检测BMSC成脂能力;Western blot法检测小鼠BMSC成骨相关蛋白RUNX2、碱性磷酸酶(ALP)及成脂相关蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达。结果 TRAP染色、扫描电镜显示脾脏细胞可诱导分化为具有骨吸收能力的破骨细胞;与对照组相比,加入破骨细胞培养上清液,BMSC的增殖受到抑制,成骨分化增强,成脂分化减弱(P0.05)。结论破骨细胞骨吸收上清液具有使BMSC增殖能力降低,成骨分化增强,成脂分化减弱的作用。     

破骨细胞释放凋亡小体微小RNA-30a对成骨活性的影响

目的 探讨破骨细胞凋亡释放凋亡小体介导成骨活性的作用。 方法 通过小鼠（n=10）骨髓单核细胞体外诱导破骨细胞,用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和细胞骨架F-actin与DAPI双标免疫荧光鉴定破骨细胞,破骨细胞与小鼠成骨细胞MC-3T3E1共培养体系,DNA片段化ELISA分析破骨细胞凋亡,凋亡小体标志物检测,骨形成标志物Real-time PCR分析,凋亡小体微小RNA (miRNA)表达谱芯片筛查。 结果 100 μmol/L 阿伦膦酸钠(ALN) 诱导成熟破骨细胞凋亡,并释放凋亡小体;Western blotting检测表明,ALN诱导凋亡小体特异性表面标志物蛋白表达增强;破骨细胞凋亡小体蛋白C3b表达增高与成骨细胞活性负相关;凋亡小体表达谱芯片筛查提示,miR-30a与骨形成标志物血清碱性磷酸酶(ALP)相关。 结论 破骨细胞凋亡释放的凋亡小体携带miR-30a抑制成骨细胞活性,凋亡小体可能参与破骨细胞与成骨细胞的对话。     

基于Nrf2通路探讨松脂醇二葡萄糖苷改善小鼠骨质疏松的机制研究

目的 分析松脂醇二葡萄糖苷（Pinoresinol diglucoside,PD）改善骨质疏松的作用机制。方法 微型CT分析小鼠小梁骨体积/总体积（bone volume/total volume,BV/TV）、平均小梁厚度（average trabecular thickness,Tb.Th）、平均小梁数目（average number of trabeculae,Tb.N）和平均小梁间距（average trabecular spacing,Tb.Sp）;HE染色检测骨组织损伤；TRAP染色分析成骨细胞数量/骨周长（number of bone cells/bone circumference,N.Ob/B.Pm）、空泡率以及破骨细胞表面/骨表面百分比（osteoclast surface/bone surface,Ocs/BS）;ELISA检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase,TRAP）相对活性，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）...     

抗酒石酸酸性磷酸酶染色方法的改良

<正>破骨细胞是一种执行骨吸收功能的细胞,其清晰辨识对骨组织生理病理学研究及代谢性骨病的研究具有十分重要的意义。当机体内破骨细胞功能活跃时,胞质内产生大量的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistnt acid phosphatase,TRAP)。因此,鉴定破骨细胞的TRAP染色技术在病理诊断中不可或缺。TRAP作为破骨细胞的特异性标志酶,是鉴别破骨细胞的重要标志~([1]),应用TRAP染色法可显示破骨细胞     

成骨细胞参与白细胞介素—1调节破骨细胞功能的实验研究

建立了成骨细胞和破骨细胞共同培养体系，探讨了白细胞介素－１（ＩＬ１）促进骨吸收的作用机理。研究发现，破骨细胞＋ＩＬ１组的骨吸收陷窝数目和面积，与单纯破骨细胞组比较，差异无显著性意义。破骨细胞＋成骨细胞＋ＩＬ１组，骨吸收陷窝数目和面积均显著增加，与破骨细胞＋ＩＬ１组及单纯破骨细胞对照组比较，差异均有显著性意义。提示ＩＬ１对破骨细胞缺乏直接作用，而是在成骨细胞介导下，发挥调节破骨细胞的骨吸收作用。     

左、右归丸及其拆方对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

 目的： 研究左、右归丸及其拆方含药血清对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的作用。方法：分别以左归丸、右归丸、两方共同药、滋肾阴药、补肾阳药、阳性对照药补佳乐和蒸馏水制备的大鼠含药血清加诱导剂（地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠）干预BMSCs,并以不含诱导剂的空白含药血清组为对照,共8组,采用改良钙钴法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,茜素红法观察矿化结节的形成,并用real-time RT-PCR法检测核心结合因子α1（core binding factor alpha 1,Cbfα1）和Ⅰ型胶原（typeⅠcollagen,ColⅠ）mRNA表达,用Western blotting法检测Cbfα1和ColⅠ蛋白表达。结果：左、右归丸及其拆方与阳性对照药补佳乐均可协同诱导剂诱导BMSCs成骨分化,其中,左归丸和滋肾阴药可显著促进ALP生成和矿化结节形成,上调Cbfα1和ColⅠ mRNA及蛋白表达（P＜0.05）。结论：左、右归丸及其拆方含药血清能协同诱导剂促进BMSCs成骨分化,左归丸和滋肾阴药促进BMSCs成骨分化的作用优于右归丸和补肾阳药。