重症肌无力患者血清miR-126、Foxp3 mRNA的表达及临床意义

为探讨重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者血清miR-126、叉头翼状螺旋转录因子3(forkhead box P3,Foxp3)mRNA的表达及临床意义,为MG发病机制研究提供更多的依据,选择63例MG患者为MG组,50例体检正常者为对照组。采用RT-PCR检测血清miR-126、Foxp3 mRNA的表达水平,并采用Spearman相关性分析法分析miR-126与Foxp3 mRNA的相关性。结果显示,MG组患者血清miR-126的相对表达量(2.59±0.84)高于对照组(1.05±0.73,P0.01),而Foxp3 mRNA的相对表达量(1.58±0.81)低于对照组(3.15±0.96,P0.01);miR-126核苷酸序列在人、小鼠、狗等7个物种间存在高度保守性;MG组患者血清miR-126与Foxp3 mRNA呈负相关(r=-0.852,P0.01)。提示MG患者存在miR-126及Foxp3 mRNA的差异表达,且高表达的miR-126可能通过抑制Foxp3 mRNA的表达参与MG的致病。     

雷公藤在大鼠1型糖尿病模型中对调节性T细胞Foxp3表达的影响及意义

目的: 研究雷公藤在大鼠1型糖尿病模型中对CD4 CD25 调节性T细胞(Tr)Foxp3基因表达的影响及意义.方法: 将48只大鼠随机分为3组, 每组各16只, Ⅱ、Ⅲ组采用小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法制备大鼠1型糖尿病模型, Ⅰ组为正常对照.Ⅲ组在成模后给与雷公藤多甙(GTT)灌胃, 1次/d, 连续3个月.淋巴细胞转化试验(MTT法)检测脾淋巴细胞增殖活性; 荧光定量PCR检测外周血及脾淋巴细胞Foxp3 mRNA的表达; 免疫组化检测淋巴结和脾组织FOXP3蛋白的表达.结果: Ⅱ、Ⅲ组血糖水平高于Ⅰ组(P＜0.01); 胰岛中Ⅲ组淋巴细胞浸润程度较Ⅱ组减轻; Ⅱ、Ⅲ组淋巴细胞增殖活性均较Ⅰ组升高(P＜0.01), 用药后Ⅲ组较Ⅱ组降低; Foxp3 mRNA、 FOXP3蛋白表达水平Ⅱ、Ⅲ组均高于Ⅰ组(P＜0.05), Ⅲ组表达水平较Ⅱ组有所升高, 但差别无统计学意义(P＞0.05).结论: Foxp3 Tr细胞参与了STZ诱导的大鼠1型糖尿病的发生发展; 上调Tr细胞Foxp3基因的表达可能为雷公藤治疗1型糖尿病的机制之一.     

MG132抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞活化

目的探讨泛素-蛋白酶体抑制剂MG132对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺成纤维细胞活化的影响及机制。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),随机分为对照组、TGF-β1组(10μg/L)和MG132(0.5μmol/L)处理组。Western blot法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α1(COL1A1)的表达;RT-PCR和Western blot法分别检测细胞Smad7、核转录共抑制因子SnoN、TGF-βI型受体(TβRI)、Smad2和Smad3 mRNA及蛋白的表达。结果与对照组比较,TGF-β1促进了α-SMA和COL1A1蛋白表达(P0.05),MG132抑制了TGF-β1的上述作用(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN mRNA表达较对照组增加(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN蛋白表达较对照组减少(P0.05),而MG132组Smad7和SnoN蛋白水平较TGF-β1组增加(P0.05)。结论 MG132可能通过阻止Smad7和SnoN蛋白泛素化降解,抑制TGF-β1诱导人肺成纤维细胞活化。     

ERK和Smad通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的： 探讨ERK通路是否参与TGF-β/Smad 通路诱导的血管平滑肌细胞增殖及可能的分子机制。方法: 原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,细胞分4组：(1)对照组;(2)TGF-β1组;(3)ERK阻断剂(PD98059)组;(4)TGF-β1+ ERK阻断剂(PD98059)组。MTT法测细胞的增殖活性,Western blotting法检测VSMCs中细胞内核增殖抗原(PCNA)、Smad2/3、ERK1/2、Smad7蛋白表达及相关磷酸化蛋白含量,RT-PCR方法测VSMCs中Smad2、3、7mRNA的表达。结果: (1)各组PCNA蛋白表达和MTT法测得A值均低于对照组 (P＜0.05),TGF-β1+ ERK阻断剂组与TGF-β1组相比无显著差异。（2）与对照组相比,TGF-β1组p-Smad2/3、p-ERK1/2蛋白含量和Smad7蛋白表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组则明显降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组降低 (P<0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无显著差异。(3)与对照组相比,TGF-β1组Smad7 mRNA表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组表达降低(P<0.05)。各组内VSMCs 的Smad2、Smad3 mRNA表达无显著差异。结论: (1)TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但对TGF-β1的抑制平滑肌细胞增殖的作用无影响,可能有其它信号通路参与此过程。(2)ERK通路可通过蛋白和mRNA水平促进Smad7表达,反过来其又可促进ERK通路激活。(3)ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA水平无影响。     

Toll样受体在重症肌无力患者胸腺组织中的表达及其临床意义

目的 研究Toll样受体(Toll-like receptor,TLRs)在重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者胸腺组织中的表达,分析其与MG发生、发展的关系.方法 收集我科2007年7月至2008年2月手术治疗的36例MG患者胸腺标本,分为胸腺瘤组、瘤旁胸腺组、非瘤MG胸腺组,以无MG的正常胸腺21例为对照(正常胸腺组),采用逆转录-PCR技术,检测TLR2、TLR3、TLR4在胸腺组织中的mRNA转录表达水平,进一步采用实时定量逆转录-PCR检测TLR4 mRNA转录表达水平以及与MG临床特点间的关系.结果 逆转录-PCR结果显示,TLR2 mRNA和TLR3 mRNA在4组之间的差别没有统计学意义,TLR4 mRNA的表达在4组之间的差别有统计学意义.进一步的实时定量逆转录.PCR检测TLR4 mRNA转录表达的结果显示,瘤旁胸腺组的TLR4 mRNA的表达比胸腺瘤组有明显的增加(0.8214±0.1019 vs 0.7101±0.0916,P=0.005),非瘤MG胸腺组TLR4 mRNA的表达量比正常胸腺组明显增加(0.8544±0.1200 vs 0.6851±0.1524,P=0.018),瘤旁胸腺组和非瘤MG胸腺组TLR4 mRNA的表达量之间的差别没有统计学意义,且都比正常胸腺组明显增加;TLR4 mRNA的表达与患者的Osserman分型呈正相关(R=0.609;P=0.004).结论 TLR4异常表达可能在MG发病中有重要作用,MG合并胸腺瘤患者瘤旁胸腺组织中TLR4的表达状态对胸腺瘤患者是否并发MG可能有重要影响.     

血管紧张素-（1-7）对转化生长因子β1诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

目的:研究血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(GMC)增殖的影响并初步探讨其机制.方法:采用WST法检测培养系膜细胞增殖;RT-PCR法检测细胞内信号传递分子Smad3/7基因mRNA的表达.结果:与对照组比较, Ang-(1-7)明显抑制TGF-β1诱导的GMC增殖(P＜0.05);同时, Ang-(1-7)对TGF-β1诱导的系膜细胞内Smad3, Smad7基因mRNA表达有明显的抑制作用(P＜0.05).结论:Ang-(1-7)对TGF-β1诱导的系膜细胞增殖有抑制作用, 其机制可能是通过下调细胞内信号传递分子Smad3/7的表达.     

重症肌无力患者胸腺组织CMTM8、CKLF1及相关趋化因子的表达

目的:比较重症肌无力(MG)患者与非自身免疫对照组胸腺组织CMTM8、CKLF1、相关趋化因子及受体的表达,为揭示MG胸腺异常及其发生机制提供理论依据.方法:用基因芯片筛选差异表达的趋化因子基因,采用RT-PCR和实时荧光定量PCR方法分别检测正常胸腺和MG胸腺中CMTM8 mRNA的表达,用免疫组织化学方法对CKLF1蛋白的表达和分布进行检测.结果:增生型MG 胸腺组织中CMTM8 mRNA的表达明显高于正常人胸腺(2-△△Ct=8.3),差异有统计学意义;CKLF1蛋白在正常胸腺、MG胸腺中的均有广泛的表达,阳性细胞主要为胸腺基质细胞;CXCR6、CCL2、CCL8、 CX3CL1、CXCL10和CCR1在 MG患者胸腺表达水平显著低于对照组;CCL22、CCL3、CXCL12、CCR5、CCR7和CCR9基因在MG患者胸腺表达水平显著高于对照组.结论:CMTM8及多种趋化因子基因在增生型MG胸腺的表达明显高于对照组胸腺,可能在MG患者T细胞异常发育的某些阶段起重要作用.     

Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞在体外对肝星状细胞TGF-β1信号传导的影响

目的:探讨Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞(Smad7-EGFP-BMSCs)在体外抑制肝纤维化的机制。方法:分离、纯化大鼠BMSCs并经Smad7基因腺病毒质粒(Ad-Smad7-EGFP)转染建立Smad7-EGFP-BMSCs。实验将大鼠肝星状细胞HSC-T6分为A组、B组、C组和D组,分别与Smad7-EGFP-BMSCs、BMSCs、Smad7质粒及PBS进行共同培养72 h,采用ELISA测定培养液中Smad7和TGF-β1的表达,采用Western印迹法和RT-PCR法测定细胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ、α-SMA蛋白和mRNA的表达,采用流式细胞术测定细胞凋亡情况。结果:(1)ELISA结果显示,B组、C组和D组培养液TGF-β1蛋白水平较A组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白水平较A组显著升高(P0.01);D组TGF-β1蛋白水平较B组和C组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白水平较B组和C组显著升高(P0.01);(2)Western印迹法和PCR结果显示,B组、C组和D组TGF-β1、ColⅠ和α-SMA蛋白和mRNA表达水平较A组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白和mRNA表达水平较A组显著升高(P0.01);D组TGF-β1、ColⅠ、α-SMA蛋白和mRNA表达水平较B组和C组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白和mRNA表达水平较B组和C组显著升高(P0.01);(3)流式细胞仪检测结果显示,B组、C组和D组HSC-T6细胞凋亡率较A组显著升高(P0.01),而D组细胞凋亡率较B组和C组显著升高(P0.01)。结论:Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞可通过作用肝星状细胞TGF-β1信号转导通路以及促进星状细胞凋亡而具有抗肝纤维化的作用。     

丹皮酚通过抑制miR-21表达减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化

目的研究丹皮酚(PAE)通过抑制微小RNA-21(miR-21)减轻博莱霉素(BLM)诱导肺纤维化的相关机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、BLM组、阳性对照(PC)组、PAE组,比较各组大鼠的肺纤维化相关指标,miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平,及Smad7、TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平;将制备好的纤维细胞分为对照组,TGF-β1组,PAE-L组,PAE-M组,PAE-H组,miR-21抑制剂组,检测各组细胞中miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平及Smad7、COLIA1、α-SMA蛋白水平,并验证miR-21与Smad7的靶向关系。结果与对照组相比,BLM组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度,miR-21mRNA表达水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白表达水平显著升高均显著升高(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P0.01),与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度均显著降低(P0.01);与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠肺组织中miR-21 mRNA水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低,Smad7的mRNA及蛋白水平显著升高(P0.01);与对照组相比,TGF-β1组成纤维细胞中miR-21的mRNA及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著升高(P0.01),Smad7的m RNA及蛋白水平显著降低(P0.01);与TGF-β1组相比,PAE-L组、PAE-M组、PAE-H组、miR-21 inhibitor组成纤维细胞中miR-21的mRNA水平及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著升高(P0.01);靶基因数据库预测及双荧光素酶报告实验表明,miR-21靶向抑制Smad7。结论 PAE可能通过抑制miR-21表达靶向促进Smad7表达,并抑制TGF-β1表达来减轻BLM诱导的肺纤维化。     

TRAF-6 调控TGF-β1-Smad2 / Smad3 信号通路在Graves 病免疫发病机制中的作用

目的:探讨肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF-6)是否在Graves病(GD)的发生过程中发挥免疫耐受作用及其可能的机制。方法:纳入Graves病初诊患者(GD) 30例,GD缓解期患者(e GD) 30例及健康人群(NC) 28例。提取外周血单个核细胞(PBMCs),分别采用实时定量PCR检测维甲酸相关孤儿受体(RORγt)、叉头蛋白P3(Foxp3)、白介素-2(IL-2)、TRAF-6 mRNA的表达,Western blot检测p-Smad2/Smad3、总Smad2/Smad3、TRAF-6蛋白的表达,ELISA检测血浆中转化生长因子-β1(TGF-β1)、IL-2、IL-17A、IL-10蛋白的表达。结果:①与NC组相比,GD组中IL-2的mRNA和蛋白、Foxp3 mRNA和IL-10蛋白的表达水平均减少,而RORγt mRNA和IL-17A蛋白的表达水平均增加,以上结果差异均有统计学意义(P0. 05)。②与NC组相比,GD组中TGF-β1蛋白的表达水平降低,差异有统计学意义(P0. 05); GD组中p-Smad2/Smad3的蛋白表达较NC组有上升趋势(P0. 05)。③GD组中的TRAF-6 mRNA与NC组比较表达降低,差异有统计学意义(P0. 05); TRAF-6蛋白表达较NC组有下降趋势(P0. 05)。④e GD组中TRAF-6 mRNA的表达水平较GD组增加,差异有统计学意义(P0. 05),较NC组差异无统计学意义(P0. 05);其余指标在e GD组与GD组、e GD组和NC组之间的差异均没有统计学意义(P0. 05)。结论:GD患者中TRAF-6低表达不足以抑制TGF-β1介导的Smad2/Smad3磷酸化,导致增多的Smad2/Smad3磷酸化蛋白下调IL-2表达,进而诱导Th17细胞的分化,同时抑制Treg细胞的分化,使机体不能维持免疫耐受,促进GD的发生。