成人前脂肪细胞的原代培养

目的 探索人前脂肪细胞的原代培养方法。方法 取成人的腹部纯脂肪颗粒,采用原代消化细胞培养法培养出梭形细胞,对培养细胞进行形态学研究,测定生长曲线并用油红O脂肪染色法进行染色及定性。结果 培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高,经动态形态学观察、生长曲线测定及油红O脂肪染色法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞。结论 在成熟的脂肪组织中存在着可以增殖并分化成熟、形成脂肪组织的前脂肪细胞。组织工程化的脂肪组织是修复软组织缺损的最佳填充材料,该实验为脂肪组织工程的发展和应用打下了一定的基础。     

人网膜前脂肪细胞原代培养

目的：建立人网膜前脂肪细胞原代培养方法。方法：选取成人网膜脂肪组织,用原代消化细胞培养法培养出形态均一的梭形细胞,用条件培养基诱导分化,油红O染色进行脂肪细胞鉴定。结果：培养出的细胞形态均一,4-5代以内增殖旺盛。用条件培养基诱导后,细胞形态由梭形向圆形变化,细胞体积增大,胞浆内聚集脂肪颗粒,油红O染色鉴定为成熟的脂肪细胞。结论：人网膜脂肪组织中存在一定数量的前脂肪细胞,予以适当刺激可完成其向成熟脂肪细胞的分化。     

小鼠棕色脂肪原代培养模型的建立

目的:探索小鼠棕色脂肪细胞原代培养的方法?方法:取C57BL/6J小鼠棕色脂肪组织,采用胶原酶消化过滤法获得梭形细胞,对培养出来的细胞进行形态学观察,诱导分化后用油红O染色法染色定性,荧光定量PCR检测棕色脂肪标志基因表达情况?结果:培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,诱导分化后分化率高,经油红O染色证实为脂肪细胞,荧光定量PCR检测棕色脂肪标志基因UCP-1表达量明显升高?结论:从C57BL/6J小鼠棕色脂肪组织中可以分离出具有很强增殖?分化能力的前棕色脂肪细胞,这种棕色脂肪细胞原代培养模型的建立为在体外进一步研究棕色脂肪的功能提供了良好的基础?     

小鼠皮下和内脏前脂肪细胞原代培养模型的建立

目的:探索小鼠皮下和内脏前脂肪细胞的培养方法?方法:取C57BL/6J 小鼠腹股沟皮下脂肪和附睾旁内脏脂肪组织,采用胶原酶消化过滤法获得梭形细胞,对培养的细胞进行形态学观察,诱导分化后用油红O染色法染色定性,荧光定量PCR检测成脂功能标志基因表达情况?结果:培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,诱导后分化率高,经油红O染色证实分离获得的前脂肪细胞可以分化为成熟脂肪细胞,荧光定量PCR检测成脂功能标志基因Fabp4(fatty acid binding protein 4)的表达量明显升高?结论:从C57BL/6J 小鼠腹股沟皮下和附睾旁内脏脂肪组织中可以分离出具有很强增殖?分化能力的皮下和内脏前脂肪细胞,这种前脂肪细胞原代培养模型的建立为在体外进一步研究皮下?内脏脂肪功能的差异提供了良好的基础?     

人前脂肪细胞的原代培养

[目的]建立人前脂肪细胞原代培养方法,以更深入地研究人体脂肪组织增生的生物学特征.[方法]选用成人的腹部脂肪组织,采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞;同时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作为对照.[结果]培养出的棱形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高.经形态学动态变化的观察,生长曲线及油红O脂肪染色抽取法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞,并在体外重现了其增殖的全过程.[结论]在成熟的脂肪组织中存在着可分化成熟、生成脂肪的前脂肪细胞.由于脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,本实验为进一步研究与肥胖及胰岛素抵抗相关的疾病如多囊卵巢综合症等打下了基础.     

人大网膜间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导化分方法

目的建立人大网膜脂肪问充质干细胞（adiposederivedIIlesechymalSteITIcells,ADSCs）的原代培养及诱导分化为脂肪细胞的方法．方法术中取人大网膜脂肪组织,采用胶原酶消化法原代培养,经流式细胞仪鉴定细胞CD44、CD34、CD90和CD45分子、MTTr法测定细胞生长曲线,取P3细胞以3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松及吲哚美辛诱导该细胞向脂肪细胞分化,油红O脂肪染色法进行脂肪细胞鉴定．结果培养卅的细胞形态均-呈梭形或漩涡状生长,经流式细胞仪鉴定为ADSCs,细胞生长曲线表明P3细胞增值旺盛,用分化培养基诱导后,细胞形态由梭形变为圆形,细胞体积增大,胞浆内聚集脂肪颗粒,油红0染色鉴定为成熟的脂肪细胞．结论该方法能培养出形态均一的人大网膜ADSCs,经诱导后可向成熟脂肪细胞分化．     

人前脂肪细胞的原代培养

目的：建立人前脂肪细胞原代培养方法,以更深入地研究人体脂肪组织增生的生物学特征。方法：选用成人的腹部脂肪组织,采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞;现时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作为对照。结果：培养出的棱形细胞成分均一,增殖旺盛,分率化高。经形态学动态变化的观察,生长曲线及油红O脂肪染色抽取法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞,并在体外重视了其增殖的全过程。结论：在成熟的脂肪组织中存在着可分化成熟、生成脂肪和前缘脂肪细胞。由于脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,本实验为进一步研究与肥胖及胰岛素抵抗相关的疾病如多囊卵巢综合症等打下了基础。     

人网膜前脂肪细胞原代培养及其生物学特性研究

目的建立人网膜前脂肪细胞原代培养的方法,研究内脏脂肪增生肥大和内分泌功能的生物学特性。方法选取人网膜脂肪组织,采用酶消化细胞原代培养出梭形细胞,对培养细胞进行形态学观察、MTT法测定生长曲线、油红O脂肪染色法进行脂肪细胞鉴定、酶联免疫法测定脂肪细胞因子瘦素和脂联素水平。结果培养出的梭形细胞成分均一。第3天开始增殖,4～9d为指数增长期,倍增时间约为60h。经分化诱导21d约有90％的细胞分化为成熟脂肪细胞。前脂肪细胞可检出低水平瘦素分泌,经诱导分化分泌量持续增多,第17天达峰值（1．6ng·ml^-1·24h^-1）,之后保持高分泌状态至诱导结束;而脂联素直到诱导分化第7天始可检测到低水平分泌,此时光镜下已可见胞质含脂滴的细胞;7～17d分泌逐渐增多,第17天分泌达峰值（99ng·ml^-1·24h^-1）,之后有明显下降趋势。经油红0脂肪染色和瘦素、脂联素分泌检测证实分离培养的细胞为功能活跃的前脂肪细胞。结论成功建立了人网膜前脂肪细胞模型,观察到瘦素和脂联素不同分泌模式。脂联素可作为鉴定前脂肪细胞分化成熟的内分泌功能特异标志物。     

人眼眶前脂肪细胞的培养和诱导分化及鉴定

目的近来研究显示,人眼眶脂肪组织中的前脂肪细胞可能参与多种疾病的发病过程。文中建立人眼眶前脂肪细胞原代培养模式,对其进行培养、诱导分化及鉴定,以便深入了解人眼眶前脂肪细胞的生物学特性。方法从18～56岁成人眼眶脂肪组织中分别以组织块法及酶消化法分离得到前脂肪细胞,进行形态学观察,成脂诱导分化,并对其进行鉴定。结果 2种方法均可获得前脂肪细胞,细胞为长梭形,呈"S"形生长,可成脂分化,且油红O染色阳性。结论从人眼眶脂肪组织中可分离出纯度高、增殖快、成脂分化率高的前脂肪细胞。     

胰岛素抵抗患者前脂肪细胞培养及增殖与分化模型的建立

目的 探索多囊卵巢综合征(PCOS)胰岛素抵抗(IR)患者的前脂肪细胞原代培养模型.方法 取PCOS IR患者腹部纯脂肪颗粒,采用改进的"贴壁-天花板"法,培养出梭形细胞,同时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作对照,采用胰岛素样生长因子-1(IGF-1)为主的脂肪细胞分化培养液,诱导前脂肪细胞的分化.结果 培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高.经形态学动态观察、生长曲线及对IGF-1和地塞米松反应的测定证明其是功能活跃的前脂肪细胞,在体外重现了其增殖、分化的全过程.结论 采用改良"贴壁-天花板"法,能成功地培养出胰岛素抵抗患者前脂肪细胞;采用IGF-1取代胰岛素作为脂肪细胞分化培养液,可以诱导前脂肪细胞的分化.     

骨关节炎患者髌下脂肪垫前脂肪细胞成脂诱导模型的建立

目的 观察骨关节炎患者髌下脂肪垫前脂肪细胞的原代培养及成脂诱导过程.方法 采用酶消化法分离得到前脂肪细胞,进行细胞形态学观察、CCK-8法测定生长曲线;成脂诱导过程中,油红O染色方法鉴定脂肪细胞、酶联免疫吸附法测定细胞上清脂联素.结果 原代培养的前脂肪细胞呈梭形,与成纤维细胞类似.成脂诱导第3天胞质内出现反光脂质小滴,第21天80%以上的前脂肪细胞可分化为脂肪细胞.细胞上清脂联素随脂肪细胞数量的增多而升高,3周时达到稳定,证实成脂诱导的细胞为功能活跃的脂肪细胞.结论 成功建立了骨关节炎患者髌下脂肪垫前脂肪细胞的原代培养及成脂诱导方法,为研究髌下脂肪垫的内分泌代谢功能及其在骨关节炎发病机制中的作用提供较为理想的细胞模型.

Abstract：

Objective To investigate the primary culture and adipogenic process of pre-adipocytes from infrapatellar fat pad of osteoarthritic patients. Methods The pre-adipocytes were isolated by enzymatic digestion. The morphological changes of cultured cells were observed and the growth curve was drawn by CCK-8 method. During the adipogenic process, the intracytoplasmic lipid of differentiated cells was determined by oil red O staining. And the adiponectin levels in the culture supernatants were measured by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Results The primary cultured fibroblast-like cells were spindle-shaped. In the process of adipogenesis, the intracytoplasmic lipid droplets were observed at Day 3and over 80% of the cells differentiated into adipocytes at Day 21. With the increasing number of adipocytes, the adiponectin levels in the culture supemant elevated and peaked at Week 3. The differentiated cells were proven to be adipocytes functioning actively. Conclusion The primary culture and adipogenic process of pre-adipocytes in infrapatellar fat pad of osteoarthritic patients has been successfully established. Thus it may provide an ideal model for the study of endocrine function of infrapatellar fat pad and understanding its role in the pathogenesis of osteoarthritis.     

新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养模型的建立

目的:探索新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养的方法?方法:取新生小鼠颅盖骨,采用胶原酶消化获得间充质干细胞,观察细胞的形态及增殖情况,通过细胞周期分析细胞增殖能力,通过流式测定细胞表面标志来分析细胞纯度,对细胞进行成骨成脂诱导分化,并分别予茜素红及油红O染色定性,荧光定量PCR检测成骨标志基因Osteocalcin及成脂标志基因PPARγ?Fabp4表达情况?结果:培养出的纺锤形细胞均一性好?增殖能力强?流式测定细胞表面标志显示细胞纯度好,高表达CD29?CD44,几乎不表达CD34?CD45?诱导分化后分化率高,茜素红染色及油红O染色分别可见较多矿化结节及脂滴,荧光定量PCR显示随分化相关标志基因均明显增高?结论:本研究成功建立了新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养模型,为进一步研究间充质干细胞奠定基础?     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的：观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础。方法：应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原鉴定。经成脂和成骨诱导液体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,对诱导2周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Van-kossa银染染色及碱性磷酸酶染色。结果：经流式细胞术鉴定,全骨髓贴壁法可获得兔BMSCs,第三代兔BMSCs生物特征基本一致并能诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa银染均可观察到矿化结节。碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组呈强阳性。结论：全骨髓贴壁法是分离培养兔BM-SCs简便可行的方法。BMSCs来源丰富并有成脂及成骨潜能,是组织工程的优良种子细胞。     

人脂肪来源干细胞复合纤维蛋白胶构建可注射型工程化脂肪组织的实验研究

目的 探讨构建可注射型组织工程化脂肪组织的可行性,为临床修复软组织缺损寻求简便、微创的方法 .方法 采用酶消化法从人脂肪抽吸术的抽吸物中脂质部分获取人脂肪来源干细胞(ASC),以经成脂诱导和未经成脂诱导的ASC作为种子细胞,行DiI体外荧光标记后,分别以1×107个/ml细胞密度与纤维蛋白胶可注射支架复合.取6只裸鼠,将成脂诱导ASC-支架复合物注射于其背部左下方皮下(诱导组),未诱导ASC-支架复合物注射于背部右下方皮下(未诱导组),不加细胞的纤维蛋白胶注射于颈部正中皮下(空白支架组),每点注射0.2 ml.第12周末处死裸鼠取出移植物,通过大体观察、湿重测定、常规组织病理学检测、油红O染色和DiI荧光标记检测判断体内成脂能力.结果 诱导组和未诱导组均获得了外观类似脂肪组织的新生物,新生物湿重分别为(28±15)、(22±t6)mg(t=23.238,P<0.01).诱导组新生物常规组织病理学检查及油红O染色均证实为成熟脂肪组织,DiI荧光标记呈阳性,证实为外源性ASC;未诱导组新生物中见少量成熟脂肪组织,大部分为纤维样结构;空白对照组未见新生组织形成.结论 从人吸脂术抽吸物脂质部分提取的ASC能作为种子细胞,经成脂诱导后与纤维蛋白胶可注射支架复合,可在体内成功构建成熟脂肪组织.     

代谢综合征大鼠肠系膜脂肪组织中肾素-血管紧张素系统的变化

目的探讨代谢综合征(MS)大鼠肠系膜脂肪组织中肾素-血管紧张素系统(RAS)变化及拮抗血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对脂肪细胞成脂作用的影响。方法30只8周龄健康雄性Wistar大鼠随机分为MS组和正常对照组,分别给予高脂饲料和普通饲料喂养24周,造成MS模型后,取出肠系膜脂肪组织,应用RT-PCR和Westernblot法检测脂肪组织中mRNA和蛋白质表达。同时,将前脂肪细胞(3T3-L1)进行诱导分化,油红O染色观察脂滴形成情况,比率荧光倒置显微镜检测脂肪细胞内钙水平([Ca2 ]i)。给予AngⅡ刺激,并观察血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(ARB)坎地沙坦或血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)巯甲丙脯酸对脂滴形成及细胞内钙水平([Ca2 ]i)的作用。结果MS大鼠肠系膜脂肪组织的血管紧张素原(AGT)、血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素Ⅱ受体亚型1(AT1R)表达均显著高于正常对照组(P<0·05,P<0·01);未诱导前脂肪细胞和经AngⅡ处理的成熟脂肪细胞未见明显脂滴形成,给予ACEI和ARB的成熟脂肪细胞有明显的脂滴形成;AngⅡ可致前脂肪细胞内钙水平([Ca2 ]i)显著增加(P<0·01),巯甲丙脯酸和坎地沙坦可阻断其效应,而对成熟脂肪细胞,AngⅡ介导的细胞内钙水平([Ca2 ]i)升高受到抑制,但坎地沙坦能恢复AngⅡ的效应,巯甲丙脯酸与AngⅡ组比较细胞内钙水平([Ca2 ]i)差异无显著性。结论代谢综合征大鼠肠系膜脂肪组织中RAS系统处于激活状态,拮抗RAS能恢复脂肪细胞的基本功能。