不同种类乙型肝炎表面抗原诱导小鼠早期细胞免疫应答的比较

目的 比较不同表达系统来源的乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)免疫小鼠诱导早期脾淋巴细胞抗原特异性细胞免疫应答的特点,探讨影响乙肝疫苗保护效果的因素.方法 3种HBsAg(汉逊酵母、CHO细胞和血源)分别皮下接种不同组小鼠(BALB/c,H-2d),每只3μg,于免疫后4d分离脾单个核细胞(MNC),经细胞分选仪(MACs)分选后,获得纯度高于90％的CD4+和CD8+T细胞,应用ELISPOT测定MNC、CD4+和CD8+T细胞体外刺激后所产生的细胞因子IFN-γ、IL-2斑点数( SFC).结果 细胞分选后,汉逊抗原诱导CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平和CD4+T细胞分泌IL-2水平均显著高于CHO抗原组(8/10、2/10,P=0.035;6/10、0/10,P=0.005).汉逊抗原组与血源抗原组CD8+T细胞经体外刺激诱导IFN-y全部阳转(10/10),但分泌水平上汉逊抗原组显著高于血源抗原组(t=2.479,P=0.035);汉逊抗原组诱导CD4+T细胞IFN-γ阳转率及分泌水平均显著高于血源抗原组(10/10、4/10,P=0.005;t=3.967,P=0.003).结论 乙肝抗原免疫小鼠4d即可诱导细胞免疫应答,且汉逊酵母抗原早期诱导抗原特异性IFN-γ、IL-2的能力显著高于CHO和血源抗原,与其临床考核母婴传播阻断HBV保护率显著优于CHO和血源乙肝疫苗相一致,为及时接种乙肝疫苗的必要性和高危新生儿选择接种乙肝疫苗的类型提供依据.     

共刺激分子4-1BBL基因免疫对HBsAg核酸疫苗诱导小鼠特异性免疫应答的影响

目的 研究共刺激分子4-1BBL基因免疫对HBsAg核酸疫苗诱导小鼠特异性体液和细胞免疫应答的影响.方法 将HBV表面抗原核酸疫苗pcDS2单独或联合共刺激分子4-1BBL质粒肌肉注射免疫C57BL/6小鼠;ELISA法检测小鼠血清抗-HBs IgG及亚型IgG1和IgG2a;迟发型超敏反应(DTH)反应检测体内细胞反应;流式细胞仪检测CD4+ T淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ及CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ水平;流式细胞仪检测小鼠脾细胞HBsAg特异性体外细胞毒性T淋巴细胞杀伤作用(CTL).结果 与单纯免疫核酸疫苗pcDS2组比较,pcDS2和4-1BBL联合免疫组小鼠的抗-HBs水平显著提高,抗-HBs IgG亚类以IgG2a占优;免疫小鼠经HBsAg脚掌皮下刺激后,联合免疫组小鼠脚掌的厚度显著高于pcDS2组;联合免疫组CD4+T淋巴细胞的IL-4和IFN-γ表达水平及CD8+T淋巴细胞的IFN-γ表达水平显著升高;DNA疫苗免疫的各组小鼠,HBsAg特异性体外CIL杀伤作用高于对照组,其中联合免疫组小鼠的体外CTL杀伤作用最强.结论共刺激分子4-1BBL不仅能增强HBV DNA疫苗诱导特异性体液免疫应答,还能增强特异性型细胞免疫反应,尤其增强体内CIL的杀伤活性.     

CpG ODN激活慢性HBV感染者外周血单个核细胞和CD4+T细胞功能的研究

目的 探讨人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对慢性HBV感染者PBMC和CD4+T细胞产生免疫应答的影响.方法 将入选慢性HBV感染者20例分成两组,免疫耐受组和免疫清除组各10例,用CoG ODN、HBsAg、M[CpG ODN+HBsAg]分别与同一感染者的PBMC和CD4+T细胞孵育,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测两种细胞IFN-γ的分泌情况,以斑点数的多少来评价细胞分泌IFN-γ的能力.结果 CpG ODN、HBsAg、MECpG ODN+HBsAg]与PBMC孵育后IFN-γ斑点数是3±8、339±429、375±496;与CD4+Tcell孵育后IFN-γ斑点数是1±4、5±16、5±12.在免疫耐受组,CpG ODN、HBsAg、M[CpG ODN+HBsAg]与PBMC孵育后IFN-γ斑点数是3±8、361±153、375±276;与CD4+ Tcell孵育后IFN-γ斑点数是0±2、2±2、4±4.在免疫清除组,CoG ODN、HBsAg、M[CoGODN+HBsAg]与PBMC孵育后IFN-γ斑点数是3±21、289±345、405±656;与CD4+ Tcell孵育后IFN-γ斑点数是2±14、8±40、7±30.PBMC与HBsAg、M孵育后IFN-γ斑点数比较统计分析P=0.720;CD4+ Tcell与HBsAg、M孵育后IFN-γ斑点数统计分析P=0.890,两种不同细胞中与M孵育后IFN-γ斑点数比较统计分析得P=0.000.结论 在免疫耐受组和免疫清除组,CpG ODN不显著增加HBsAg刺激PBMC和CD4+ T细胞分泌IFN-γ,但CpG ODN对PBMC刺激效果优于CD4+T细胞.     

DNA疫苗诱导健康小鼠细胞免疫及HBV转基因小鼠抗-HBs产生

目的 :在HBVDNA疫苗成功地诱导健康小鼠体液免疫应答的基础上 ,探讨其作为抗 HBV治疗的可行性及作用机理。方法 :应用基因重组技术 ,构建编码HBV中蛋白 (preS2 +S)及人白细胞介素融合蛋白基因的真核表达质粒pS2 .S及pFP ,继经肌注免疫健康Balb C及HBV转基因 (Tg)小鼠并观察健康小鼠细胞免疫应答及HBVTg小鼠HBsAg的血清转换。结果 :1 体外HBsAg对DNA疫苗免疫后的T细胞的刺激呈浓度相关 ,HBsAg 30 μg ml时刺激pS2 .S免疫小鼠脾细胞增殖指数(5 6± 0 9)明显较pcDNA3 1组 (2 0± 0 5 )高。细胞培养上清液细胞因子水平检测结果 :免疫实验组IL 2及IFN γ的分泌水平明显较对照组高 ,而IL 4水平于各组影响不明显。 2 pS2 .S免疫小鼠局部引流淋巴结DCs诱导HBsAg致敏的T 细胞增殖指数(4 2 0 )较pcDNA3.1组 (2 5 5高 )。 3 高剂量的pS2 .S组与联合pFP组各有一只Tg小鼠分别于 2、4w开始发生HBsAg血清转换 ,且其抗体水平随时间而增长。结论 :结果表明HBVDNA疫苗能有效诱导HBsAg特异性的细胞免疫应答 ;HBV Tg小鼠初步实验结果为治疗型HBVDNA疫苗的深入研制提供了实验依据。     

比较以凋亡肿瘤细胞和肿瘤细胞裂解物制备疫苗的效果

目的在肿瘤DC疫苗的研究当中,探讨最佳的抗原负载DC细胞的方式。方法采用137Cs照射处理后凋亡的肿瘤细胞、丝裂霉素(MMC)处理的凋亡肿瘤细胞、反复冻融肿瘤细胞的裂解物3种方法制备肿瘤抗原后负载DC细胞,再分别诱导T淋巴细胞。采用胞内染色法检测T细胞活化情况,LDH法检测T细胞的杀伤活性。结果照射、MMC诱导细胞凋亡以及裂解细胞提取蛋白3种方法制备的肿瘤抗原,分别负载DC后诱导T细胞,T细胞对特异性靶细胞的杀伤活性分别为47.31±4.89、41.65±4.08、38.91±3.55,照射组高于MMC组及裂解组(P<0.05),其余各组间差异无统计学意义(P>0.05);3组CD4+/IFN-γ+分别为1.85±0.37、1.37±0.37、1.24±0.32(n=5,P=0.044),照射组和MMC组明显高于裂解组,而照射组与MMC组差异无统计学意义(P=0.072)。CD8+/IFN-γ+分别为1.42±0.23、1.13±0.19、1.08±0.19(n=5,P=0.043),照射组明显高于裂解组(P=0.0001),其余各组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论本研究显示凋亡的肿瘤细胞产生的杀伤能力以及T细胞分泌IFN-γ水平要高于肿瘤细胞裂解物,其中137Cs照射处理方法经比较为较佳的肿瘤疫苗形式。     

IL-17作为分子佐剂增强HIV DNA疫苗细胞免疫应答的研究

目的 为了进一步增强HIV DNA疫苗的免疫反应,本研究将IL-17作为HIV DNA疫苗的分子佐剂免疫小鼠,旨在探讨IL-17对HIVDNA疫苗诱导体液和细胞免疫应答的影响.方法 将小鼠IL-17构建到真核表达载体,与HW-1膜蛋白DNA疫苗pGX-Env联合免疫BALB/c小鼠;分别在第0、2周进行免疫,在第4周检测T淋巴细胞增殖指数、抗-Env IgG、细胞因子表达水平和体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤作用(CTL)等免疫学指标.结果 IL-17能够增强HIV DNA疫苗的特定免疫反应.与单注射疫苗组相比,IL-17作为佐剂组的T细胞增殖、抗体水平和CD4~+T细胞分泌IFN-γ、IL-4和IL-17的表达均无明显增强,但对CD8~+T细胞分泌IFN-γ的表达和体内CTL的效果影响明显(P<0.05).结论 IL-17作为分子佐剂不足以影响Th细胞分化,然而却能够增强特异性CD8~+T细胞中IFN-γ的表达,尤其是增强体内CTL反应.此结果为增强艾滋病DNA疫苗CD8~+T细胞活性和用于艾滋病的治疗提供了一个新的思路.     

铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的研究

目的研究铜绿假单胞菌重组双歧杆菌(rBb)-OprF疫苗免疫小鼠,PAO1株攻击后产生的细胞免疫应答。方法将rBb-OprF疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔黏膜和口服灌胃4种途径免疫Balb/c小鼠,免疫后8周用5×106CFU的PAO1株攻击,攻击1周后杀鼠取脾,MTT法检测特异性脾淋巴细胞增殖,流式细胞术检测脾CD4+T和CD8+T细胞比率,用ELISA法检测脾细胞培养上清IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10的水平。结果脾T淋巴细胞增殖明显;脾细胞CD4+和CD8+T细胞亚群显著增加;脾细胞培养上清IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10的水平显著升高,其中IFN-γ最为显著。结论铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗可诱导小鼠产生混合型的Th1和Th2免疫应答。     

腺病毒编码人TRP2修饰DC诱发抗小鼠黑色素瘤免疫的研究

目的比较腺病毒载体(Ad)介导人和小鼠酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-relatedpro-tein2,TRP2)修饰小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DC)诱发抗小鼠黑色素瘤免疫的差异。方法Ad编码人或小鼠TRP2(AdhTRP2或AdmTRP2)体外感染小鼠BM-DC并体内皮下免疫C57BL/6小鼠,7d后取出被免疫小鼠脾细胞行体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤试验(invivoCTL)和细胞内IFN-γ染色(ICS)分析CTL的杀伤活性和IFN-γ的产生;或给免疫后小鼠皮下接种小鼠B16.F10黑色素瘤细胞,观察荷瘤小鼠的成活情况。结果invivoCTL和ICS分析显示,AdhTRP2/BM-DC免疫小鼠,其6hCTL杀伤率为(98.7±1.2)%,IFN-γ产生的CD8+T细胞占总CD8+T细胞的(1.25±0.21)%;而AdmTRP2/BM-DC免疫的小鼠,其6hCTL杀伤率和产生IFN-γ的CD8+T细胞比例分别为(28.6±6.3)%和(0.24±0.06)%。荷瘤试验表明,AdhTRP2/BM-DC免疫小鼠后1周皮下接种106B16.F10细胞,观察3个月100%的小鼠无瘤生长;而接种5×104B16.F10细胞至AdmTRP2/BM-DC免疫1周的小鼠,3个月后小鼠成活率仅为40%。结论Ad介导异种(人)TRP2较自身(小鼠)TRP2修饰的BM-DC更为有效地打破肿瘤免疫耐受、诱导强烈的抗黑色素瘤免疫反应,是一种高效的以DC为基础的肿瘤疫苗。     

人类巨细胞病毒特异性CD8+ T细胞IFN-γ和穿孔素水平的检测

目的研究人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽(pp65495-503, NLV)特异性CD8+ T细胞的功能特性.方法将HLA-A2/NLV四聚体染色与细胞内细胞因子或穿孔素染色相结合,以流式细胞仪直接分析NLV特异性CD8+ T细胞内穿孔素的表达水平,或者在NLV抗原肽刺激6 h后分析γ-干扰素(IFN-γ)的表达水平.结果 NLV抗原肽能诱导hCMV特异性CD8+ T细胞分泌IFN-γ,不同供者特异性CD8+ T细胞产生IFN-γ的比率存在较大差异(55.69±17.64) %,当NLV抗原肽质量浓度为10 μg/mL时IFN-γ阳性细胞百分率最高;未经刺激的特异性CD8+ T细胞内表达较高水平的穿孔素(53.90±16.41)%.结论识别单一表位的hCMV特异性CD8+ T细胞合成IFN-γ和穿孔素的能力存在多样性.     

CpG ODN佐剂促进HBsAg疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的探讨

目的 探讨cpG ODN对重组乙型肝炎表面抗原（HBsAg）诱导小鼠细胞免疫应答的影响。方法HBsAg和HBsAg＋CpG ODN分别肌肉注射免疫Balb／c小鼠后，从淋巴组织（脾和淋巴结）和非淋巴组织（肺）分离淋巴细胞，体外经HBsAg抗原刺激后，利用ELISA检测细胞培养液中IFN-γ的水平，再利用流式细胞仪在单个细胞水平上检测IFN-γ^＋细胞的频率，分析IFN-7^＋细胞亚群。结果对照组和HBsAg免疫组IFN-γ产生的水平很低，当HBsAg加强免疫1～2次后，IFN-γ表达仍然没有明显升高；而CpG ODN＋HBsAg免疫1次或加强免疫后，CpG显著促进HBsAg诱导的IFN-γ产生。进一研究结果表明CpG促进HBsAg诱导淋巴器官和非淋巴器官内CD4^＋和CD8^＋T细胞IFN-γ的表达。结论CpG免疫佐剂不仅能诱导细胞免疫应答同时也诱导体液免疫应答，提示CpG ODN可以用于HBsAg预防和治疗性佐剂。