猪胸主动脉脱细胞血管基质的制备

目的 完全去除猪胸主动脉的细胞,制备成血管脱细胞基质。方法 采用胰酶和TritonX-100制备猪胸主动脉脱细胞基质。根据TritonX-100的浓度将实验分为0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％等6组。标本进行大体、光镜、电镜观察,并进行DNA含量的测定。结果0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％浓度的TritonX-100能分别在(104.0±3.8)h、(89.6±3.4)h、(74.4±3.9)h、(72.8±2.5)h、(72.0±0.0)h、(72.0±0.0)h内完全脱除猪胸主动脉的细胞,同时较好地保持了胶原纤维和弹性纤维的原有排列和分布。TritonX-100的脱细胞作用呈浓度依赖性,最佳脱细胞浓度为0.5％。结论 本方法可以成功制备大血管脱细胞基质,可以进一步用于组织工程带瓣管道或瓣膜的研究。     

组织工程心脏瓣膜内皮细胞的整合素β1表达

目的体外构建组织工程心脏瓣膜（TEHV），初步探讨内皮细胞黏附生长的分子机制。方法猪主动脉瓣膜经胰酶-EDTA、表面活性剂、核酸酶处理，去除猪主动脉瓣叶的细胞成分，测定瓣叶脱细胞后的生物力学特性；将扩增的人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）种植在瓣叶上，体外静态构建TEHV，观察内皮细胞的生长状态。消化瓣膜内皮细胞，半定量RT-PCR检测内皮细胞整合素＆mRNA的表达，Western-Blot检测内皮细胞膜上整合素＆蛋白的表达。结果猪主动脉瓣膜中的细胞成分能完全去除，脱细胞瓣叶的生物力学特性同新鲜瓣叶相比无明显变化；种植的HUVECs在瓣叶表面生长状态良好，长成一层连续的细胞层。瓣膜内皮细胞可检测到整合素岛mRNA和蛋白的表达。结论脱细胞猪主动脉瓣膜作为支架，HUVECs做种子细胞可以成功构建TEHV，瓣膜内皮细胞可以表达整合素岛。     

脱细胞猪主动脉瓣膜与可降解聚合材料共同构建复合组织工程瓣膜

目的对新型复合组织工程瓣膜进行体外生物力学和动物体内移植试验，为临床应用过渡提供依据。方法以脱细胞猪主动脉瓣作为支架，用可降解聚合材料3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯（3一hydroxybutyrate—co-3-hydroxyhexanoate，PHBHHx）涂层，构建新型复合组织工程瓣膜。（1）复合组织工程瓣膜、新鲜猪主动脉瓣和脱细胞猪主动脉瓣各12枚，用单轴生物拉伸机进行体外生物力学测试；（2）小尾寒羊10只，其中5只在全身麻醉非体外循环下接受复合组织工程瓣膜，移植到羊的肺动脉瓣位；其余接受脱细胞猪主动脉瓣作为对照。术后18周处死动物，取出移植瓣膜，进行组织学、免疫荧光染色、扫描电子显微镜检查和钙含量测定。结果复合组织工程瓣膜保持了自然瓣形态，抗拉强度显著提高（P〈0．05）；瓣膜柔软，表面光滑无血栓；免疫荧光染色检测，瓣膜新生内膜中内皮细胞呈CD31阳性反应，沿瓣表面连续排列，间质细胞呈现单克隆鼠抗人平滑肌actin（sMA）阳性反应；复合组织工程瓣膜钙含量明显低于脱细胞猪主动脉瓣（P〈0．05）。结论复合组织工程瓣膜具有自然瓣膜的三维形态结构，良好的生物力学特性、生物相容性和细胞引导性，初步具备组织工程瓣膜雏形。     

脱细胞天然支架生物力学性能变化及预处理改善组织相容性的实验研究

目的观察脱细胞猪主动脉瓣的生物力学性能变化,探讨不同预处理改善天然支架组织相容性的效果。方法新鲜猪主动脉瓣经酶加去污剂法去除细胞,力学测试仪检测其最大负荷、最大应力、最大应变和弹性模量的变化,苏木精-伊红（HE）染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和扫描电镜观察其病理形态学变化;将脱细胞瓣膜分别予磷酸缓冲液、多聚赖氨酸和未灭活胎牛血清包被处理,然后种植大鼠主动脉肌成纤维细胞,甲基噻唑基四唑试验检测细胞黏附率,HE染色和扫描电镜观察形态学变化。结果酶加去污剂法能完全脱去瓣膜细胞,基本维持胶原纤维的空间结构,但其最大负荷、最大应力及弹性模量下降,最大应变上升（P〈0．05）;胎牛血清预处理去细胞瓣能显著提高肌成纤维细胞的黏附率,促进细胞生长、分化和增殖,并在瓣膜表面形成连续的细胞层（F值=129．26,P=0．000）。结论酶加去污剂法可较完全去除猪主动脉瓣膜细胞并保持细胞外基质的三维结构,但其生物力学性能有所下降;胎牛血清预处理能改善脱细胞瓣天然支架的细胞黏附、生长和繁殖。     

脱细胞血管基质制备和异体移植的实验研究

目的研究建立无细胞血管基质制备的新方法,并探讨脱细胞血管异体移植的可行性。方法采用不同去垢剂[1％Triton X-100、1％十二烷基磺酸钠(SDS)]多步骤对血管进行脱细胞处理,并通过组织学和力学观测,建立兔动脉血管脱细胞的方法;并进行脱细胞血管的异体移植。结果经低渗溶液和去垢剂1％TritonX-100、1％SDS等多步骤处理,兔胸主动脉血管的细胞基本脱除,细胞外基质保持完好,血管的弹性、韧性和力学强度仅轻度降低;用该法制备的兔颈动脉(直径约2．0mm)进行异体移植,经2个月观察,全部通畅。结论经去垢剂TritonX-100、SDS加低渗溶液和蛋白酶抑制剂处理的多步法,可以脱除血管的细胞成分,细胞外基质和力学特性保持完好,是一种较好的方法;用该法制备的兔颈动脉(直径约2．0mm)进行异体移植,初步取得成功。     

新型复合组织工程瓣膜的构建和体外生物力学研究

目的 构建复合瓣膜进行体外生物力学和脉动流测试.方法 猪主动脉瓣脱细胞处理作为支架,用3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯涂层,构建复合瓣膜,用拉伸机进行体外生物力学研究,以新鲜和脱细胞猪瓣作为对照(每组12枚);用脉动流仪进行流体力学研究,以脱细胞猪瓣作为对照(每组6枚).结果 复合瓣膜抗拉强度(12.08±1.72)MPa,与新鲜猪瓣(8.38±0.52)MPa和脱细胞猪瓣(8.16±0.66)MPa比较,差异有统计学意义(P＜0.05);在心输出量2～7L/min时,复合瓣膜与脱细胞猪瓣血流动力学参数差异无统计学意义(P＞0.1).结论 复合瓣膜具有良好的生物力学、流体力学特性.     

染料介导光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的生物学特性

目的探讨染料介导光氧化处理猪主动脉瓣膜的生物学特性，以期获得性能良好的新型生物瓣膜材料。方法经去细胞处理的猪主动脉瓣30个，随机分为3组。光氧化处理组（n=10）：去细胞瓣膜经染料介导光氧化处理；戊二醛处理组（n=10）：去细胞瓣膜采用戊二醛处理；去细胞对照组（n=10）：去细胞瓣不做固定处理，置于生理盐水中备用。分别测定并比较3组瓣膜的形态学改变、组织学特点、瓣膜厚度、含水量、热皱缩温度、断裂强度和可溶性蛋白含量。结果光氧化处理组主动脉瓣呈淡蓝色，瓣膜质地柔软，弹性大，瓣叶无皱缩。光氧化处理组主动脉瓣瓣膜厚度较戊二醛处理组薄（0．26±0．09mm vs．0．38±0．08mm；P〈0．05），组织含水量较戊二醛处理组大（86．30％±4．03％VS．71．10％±3．23％；P〈0．05），热皱缩温度低于戊二醛处理组（76．30±0．70℃ vs．87．70±0．30℃；P〈0．05）；瓣膜厚度、组织含水量和热皱缩温度与去细胞对照组比较差异无统计学意义。光氧化处理组断裂强度较去细胞对照组明显增大（17．33±2．65mPa vs．9．11±0．95mPa，P〈0．05），可溶性蛋白含量较去细胞对照组明显减少（0．039％±0．013％VS．0．107％±0．024％；P〈0．05），而与戊二醛处理组比较差异无统计学意义。结论染料介导光氧化处理去细胞猪主动脉瓣有较好的生物学特性。     

应用猪主动脉去细胞瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜

目的　探讨应用猪去细胞瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。　方法　采用去垢剂、渗透压改变和核酸酶消化的方法制备猪主动脉瓣去细胞瓣膜支架 (实验组 ) ,用去内皮细胞主动脉瓣作对照 (对照组 ) ,并对两组含水量、可溶性蛋白含量、热皱缩温度、力学性能和组织相容性进行测定。培养犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞 ,将其种植于实验组去细胞支架上 ,观察细胞生长情况 ,并测定内皮细胞合成前列环素的功能。　结果　实验组瓣膜细胞成分完全从瓣膜中去除 ,与对照组新鲜瓣膜相比 ,含水量增高 (P<0 .0 5 ) ,可溶性蛋白含量减少 (P<0 .0 5 ) ,热皱缩温度和抗张强度无明显变化。实验组瓣膜组织相容性试验显示 ,材料组织相容性好 ,体内降解时间为 10周 ;犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞在瓣膜表面生长良好 ,内皮细胞具有合成分泌前列环素的功能。　结论　采用去垢剂、渗透压改变和核酸酶消化的方法制备猪主动脉瓣去细胞瓣膜支架 ,在去除细胞和可溶性蛋白质的同时保持了瓣叶的基本结构和力学性能 ;以其为支架体外构建组织工程心脏瓣膜的细胞不仅能在材料表面生长 ,还能合成、分泌血管活性物质 ,是具有生理功能的组织工程心脏瓣膜。     

人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的研究

目的探讨人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法经1%TritonX100、0.01%胰酶0.02%EDTA、DNaseI及RNaseI处理制备去细胞猪主动脉瓣叶支架,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性;人骨髓基质干细胞体外分离、培养、扩增后种植在去细胞瓣叶表面,观察细胞生长情况。结果猪主动脉瓣叶去细胞后获得完整无细胞的纤维网状支架,瓣叶去细胞前、后的断裂强度和断裂伸长率差异无统计学意义(P>0.05);体外培养的人骨髓基质干细胞(MSCs)在去细胞瓣叶表面形成一层基本连续的细胞层。结论去除细胞成分的猪主动脉瓣叶组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程心脏瓣膜;人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的。     

去细胞猪主动脉瓣叶的获取和内皮细胞的种植

目的　探讨猪主动脉瓣叶去细胞后作为组织工程心脏瓣膜支架的可行性。　方法　经胰酶 - EDTA、表面活性剂和核酸酶处理 ,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分 ,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性 ,并在其表面种植新生牛主动脉内皮细胞 (BAECs) ;分别行大鼠皮下包埋实验。　结果　猪主动脉瓣叶中的细胞成分能完全去除 ,获得完整无细胞的纤维网状支架 ,断裂强度和断裂伸长率无明显变化 ;种植的 BAECs在去细胞瓣叶表面可形成一层连续的细胞层 ,其分泌前列环素 (PGI2 )的能力同直接种植在 2 4孔板中的比较 ,差异无统计学意义 (P>0 .0 5 )。　结论　猪主动脉瓣去细胞后获得的纤维支架可以用来构建组织工程瓣膜 ,适宜于血管内皮细胞的生长。