红花对活化巨噬细胞产生一氧化氮的影响作用

目的 水提醇沉法对红花进行提取,研究红花提取物对脂多糖(LPS)活化小鼠巨噬细胞RAW264.7产生一氧化氮(NO)的影响作用,同时测定提取物中的总黄酮含量.方法 ATP-Lite法测定红花对RAW264.7细胞毒性的影响,姜黄素为阳性对照.采用Griess法测定由LPS活化RAW264.7细胞产生NO的含量,阿司匹林为阳性对照.以山奈酚为标准品测定红花提取物中总黄酮的含量.结果 姜黄素对RAW264.7的半数致死浓度为(29.9±4.3)μg/ml.红花提取物在低于125μg/ml时,对RAW264.7细胞的致死率低于5％.在12.5～100 μg/ml的浓度范围内,红花表现出对LPS活化RAW264.7细胞产生NO的抑制作用.以山奈酚计,1 g生药红花中含1.14 mg总黄酮.结论 红花对LPS活化巨噬细胞产生NO具有抑制作用,其作用可能与其所含黄酮类成分有关.     

蛇六谷葡苷露聚糖对小鼠巨噬RAW264.7细胞免疫调节作用及机制研究

目的探讨蛇六谷葡苷露聚糖(KGM)对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用及机制。方法采用MTT法检测KGM对小鼠巨噬RAW264.7细胞存活率的影响,观察巨噬细胞形态的变化;采用吞噬中性红和流式细胞仪测FITC-dextran的方法检测KGM处理后小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬活性;采用Griess法测定NO,ELISA法检测细胞培养液中IL-6,IL-1β和TNF-α等细胞因子的含量;采用qRT-PCR法检测小鼠巨噬细胞RAW264.7相关基因iNOS,IL-6,TNF-α,IL-1β,TLR4,My D88,TRAF-6,TRAM和NF-κB等的表达。结果 KGM在50～400 mg·L~(-1)对小鼠巨噬细胞RAW264.7没有细胞毒性。KGM处理24 h后,RAW264.7细胞体积增大,胞内颗粒小泡增多,呈不规则多边形,部分细胞伸出伪足,表现为典型的激活态;中性红吞噬实验和流式测定FITC-dextran实验结果表明,KGM 50～200 mg·L~(-1)能显著提升小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬活性,与对照组相比,KGM 100 mg·L~(-1)分别使细胞吞噬活性提高101.4%和404.3%。Griess法检测表明,KGM能显著增加小鼠巨噬细胞RAW264.7合成和释放NO,其中KGM100 mg·L~(-1)处理组细胞NO含量与LPS 5 mg·L~(-1)作用相当,与对照组相比,NO含量提高318.1%。ELISA检测表明,KGM 50～200 mg·L~(-1)能诱导RAW264.7细胞分泌IL-6,TNF-α和IL-1β等细胞因子,与对照组相比,KGM 100 mg·L~(-1)明显使细胞因子分泌量分别增加415.5%,158.6%和458.0%(P<0.01)。qRT-PCR的结果显示,与对照组相比,KGM组IL-6,i NOS,TNF-α,IL-1β,TLR4,My D88,TRAF-6和NF-κB的mRNA表达水平升高(P<0.05),表明KGM可以激活小鼠巨噬细胞RAW264.7中的核转录因子NF-κB和TLR4。结论 KGM对小鼠巨噬RAW264.7细胞具有免疫调节活性,能够显著提升小鼠细胞RAW264.7的吞噬能力,促进分泌与释放NO和TNF-α等相关细胞因子,推测可能是通过激活TLR4/My D88/NF-κB信号通路发挥免疫调节作用。     

褐藻糖胶促进小鼠巨噬细胞免疫活性及机制初探

目的 探讨褐藻糖胶(Fucoidan)对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫活性的影响及初步探讨作用机制。方法 采用体外细胞培养方法,比色分析检测不同浓度Fucoidan(0、100、200、300、400、500 μg/mL)作用下RAW264.7吞噬中性红的能力,噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度Fucoidan(0、50、250、500 μg/mL)作用下RAW264.7增殖,Western Blotting检测Fucoidan诱导的RAW264.7的MAPK/ERK1/2的磷酸化。结果 Fucoidan剂量依赖性地促进RAW264.7吞噬功能和增殖功能。200 μg/mL Fucoidan作用10min即使ERK1/2发生磷酸化,30min时ERK1/2磷酸化达到最大值。结论 Fucoidan可提高小鼠巨噬细胞的吞噬活性和增殖能力,其机制可能与Fucoidan直接激活RAW264.7的MAPK/ERK1/2信号转导通路有关。     

三七总皂苷调节iNOS-NO-NF-κB信号通路抑制LPS诱导的RAW246.7细胞炎症研究

目的 探讨三七总皂苷（PNS）对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞iNOS-NO-NF-κB信号通路相关分子表达及活性的影响。方法 MTT比色法检测PNS对RAW264.7细胞增殖的抑制作用;不同浓度PNS（25、50、100 μg/mL）干预体外培养LPS诱导的RAW264.7细胞24、48 h后,Griess法检测NO变化;PNS干预24 h后,Western blotting检测iNOS、NF-κB、p-NF-κB、IKKα、p-IKKα、p-ΙκΒα蛋白表达量的变化;PNS干预4 h后,激光共聚焦显微镜检测NF-κB转位入核情况。结果 PNS浓度大于150 μg/mL时,才表现出显著抑制细胞增殖的作用。25、50、100 μg/mL PNS作用于RAW264.7细胞24和48 h后,与模型组比较,NO生成量均显著降低（P<0.001）。50、100 μg/mL PNS作用于RAW264.7 24 h后,iNOS、NF-κB蛋白表达量显著降低,磷酸化蛋白p-NF-κB、p-IKKα、p-ΙκΒα表达水平也显著降低（P<0.01、0.001）。与模型组比较,PNS 25、50、100 μg/mL组核因子p65入核荧光强度显著降低（P<0.01、0.001）。结论 PNS能够显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS-NO-NF-κB信号通路的活性,降低细胞炎症反应。     

丹参酮ⅡA体内外抗炎作用研究

目的采用体内外炎症模型研究丹参酮IIA抗炎活性作用及其作用机制。方法建立脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7细胞体外炎症模型,检测不同浓度丹参酮IIA对炎症因子水平、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶2(COX-2)蛋白表达及其基因表达的影响。建立二甲苯致小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶大鼠足跖肿胀炎症模型,探讨不同浓度丹参酮IIA的体内抗炎作用。结果丹参酮IIA对RAW264.7细胞无明显毒性。与LPS组比较,丹参酮IIA剂量在2.5～40 mg/L呈明显剂量相关性地抑制一氧化氮(NO)、白细胞介素-1?(IL-1?)和白细胞介素-6(IL-6)释放(P0.05、0.01)。与LPS组比较,丹参酮IIA呈现剂量相关性地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS和COX-2蛋白的表达(P0.01)。与LPS组比较,丹参酮IIA呈剂量相关性地下调LPS诱导的RAW264.7细胞中的iNOS、COX-2、IL-1?和IL-6基因表达(P0.05、0.01)。丹参酮IIA在10～60 mg/kg对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有不同程度的抑制作用,对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀有不同程度的抑制作用,并呈剂量相关性(P0.05、0.01),且当丹参酮IIA给药剂量达到40 mg/kg时,其抗炎效果强于阿司匹林。结论丹参酮IIA具有抗炎作用,其作用机制可能与减少巨噬细胞炎症介质生成和释放、炎症基因iNOS、COX-2、IL-1?和IL-6的表达密切相关。     

基于Nrf2/HO-1信号通路研究橄榄苦苷的体外抗炎作用

目的 探讨橄榄苦苷对脂多糖（LPS）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞（RAW264.7）炎症的保护作用及机制。方法 MTT法检测橄榄苦苷（0、10、20、40 μmol/L）对RAW264.7细胞活性的影响;用橄榄苦苷（10、20、40 μmol/L）预处理细胞1 h后,LPS诱导炎症模型,Griess试剂检测细胞内Nitrite释放;Western blotting方法检测细胞iNOS、COX-2、Nrf2、Keap-1、HO-1、NQO1蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞内NO、ROS、Ca²⁺的水平;荧光显微镜检测线粒体膜电位（MMP）水平;ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）的释放。结果 与模型组比较,橄榄苦苷组Nitrite释放水平显著降低（P<0.05、0.01、0.001）,iNOS、COX-2蛋白的表达显著降低（P<0.001）,NO的产生显著减少（P<0.05、0.01）;TNF-α、IL-6的释放受到显著抑制（P<0.001）;Ca²⁺释放受到显著抑制（P<0.01）;ROS生成受到显著抑制（P<0.01）;JC-1单体降低,恢复聚合物状态（红色荧光变多）,MMP稳定性增强;Keap1蛋白表达显著降低, Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的表达均显著升高（P<0.05、0.01、0.001）。结论 橄榄苦苷对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症具有抑制作用,其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路相关。     

红毛五加茎皮抗炎有效成分筛选的初步研究

目的从红毛五加茎皮中提取、分离、筛选抗炎有效成分。方法粉碎红毛五加茎皮,95%乙醇浸渍48h,滤取提取液,合并提取液,减压低温回收溶剂,加水溶解,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。以LPS刺激小鼠巨噬细胞样细胞RAW264.7,加入红毛五加各萃取部分、水相部分共孵育24h,用放射免疫法测定细胞上清液中PGE2的含量,以抑制LPS刺激RAW264.7产生PGE2的作用为指标,逐步对红毛五加提取物进行筛选。结果正丁醇萃取部分的40mg/L以及10mg/L剂量对LPS刺激RAW264.7细胞产生PGE2为(7.26±0.95)pg/mL、(7.43±0.82)pg/mL,与LPS刺激组相比,有统计学意义(P<0.05),抑制率分别为23.7%、21.6%。萃取水相的40mg/L剂量组对LPS刺激RAW264.7细胞产生PGE2为(7.18±1.46)pg/mL,与LPS刺激组相比,有统计学意义(P<0.05),抑制率为24.7%。而其他萃取部分各剂量组与LPS刺激组相比均无统计学意义(P>0.05)。结论红毛五加抗炎的有效成分主要存在于其经乙醇提取,正丁醇萃取部分。     

栀子拮抗细菌脓毒症有效成分京尼平苷的研究

目的：脓毒症是感染因素介导的全身炎症反应综合征,是烧伤、创伤和感染性疾病患者的常见并发症,其中内毒素（LPS）是介导细菌脓毒症的重要病原体相关分子模式。重组人活化蛋白C作为FDA批准的第一个用于治疗重度脓毒症的药物,经过6年的应用评估,其疗效已被否定,迄今脓毒症治疗仍缺乏有效药物。本文通过从中药栀子中提取分离具有中和LPS作用的有效成分京尼平苷,研究其拮抗细菌脓毒症的活性。方法：以LPS活性中心LipidA为靶点,采用生物传感器技术,从传统清热中药中筛选出具有LipidA结合活性的栀子,进而利用现代色谱技术分离出具有拮抗LPS活性的单体京尼平苷,通过鲎试剂法检测京尼平苷对LPS的体内外中和作用;RT-PCR法检测京尼平苷对LPS诱导巨噬细胞TLR4和TNF—αmRNA表达的影响;ELISA法检测京尼平苷对LPS刺激RAW264．7细胞产生细胞因子（TNF—α）的抑制作用;观察京尼平苷对脓毒症模型小鼠的保护作用。结果：京尼平苷在体外对LPS具有直接的中和作用,并呈现出较好的剂量效应关系：同时可剂量依赖的抑制LPS刺激引起的RAW264．7细胞的活化（TLR4和TNF-αmRNA的表达下调,细胞因子TNF-α的产生减少）;在体内可降低LPS血症模型动物血中的LPS水平;对致死剂量热灭活大肠埃希氏菌攻击的小鼠具有显著的保护作用。     

黑鱼鱼胆抗炎活性成分研究

目的研究黑鱼鱼胆的抗炎成分活性。方法采用萃取、硅胶柱层析等方法进行分离纯化,然后通过氢谱、碳谱对分离出的单体进行结构鉴定,利用小鼠脾淋巴细胞增殖实验和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)实验评价黑鱼鱼胆抗炎活性成分。结果利用活性追踪的方法分离得到化合物牛黄胆酸钠(C1)和化合物牛黄鹅去氧胆酸钠(C2),且两个化合物对刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)诱导小鼠脾淋巴细胞增殖实验的细胞相对活力分别为65.9%±11.7%、60.5%±9.4%,与模型组相比差异均具有极显著性(P<0.01);对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的量分别为(16.4±1.9)、(15.5±1.7)μmol·L~(-1),与模型组相比差异均具有极显著性(P<0.01)。结论黑鱼鱼胆中牛黄胆酸钠和牛黄鹅去氧胆酸钠具有一定的抗炎活性且对正常脾淋巴细胞和巨噬细胞无毒性作用。     

黄芪提取物抑制小鼠巨噬细胞一氧化氮生成及对α-葡糖苷酶活性的影响作用

目的:研究黄芪提取物抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞一氧化氮(NO)生成及对α-葡糖苷酶活性的影响作用。方法:以400、200、100、50μg/ml黄芪提取物,20.0、10.0、5.0、2.5μg/ml黄芪甲苷,4、2μg/ml姜黄素作用于细胞。以不同质量浓度药液培养细胞2 h后,加入脂多糖(LPS,0.05μg/ml)培养细胞22 h;Griess法测定NO含量及计算对NO生成的抑制率。以2 000、1 500、750、375μg/ml黄芪提取物,250.0、125.0、62.5、31.5μg/ml黄芪甲苷,2.50、1.25、0.63、0.32μg/ml阿卡波糖作用于α-葡糖苷酶;以4-甲基-伞形酮-β-D-半乳糖苷(4-MUG)为反应底物,以4-MUG被酵母α-葡糖苷酶水解后产生的4-甲基-伞形酮(4-MU)为荧光探针,测定样品对α-葡糖苷酶活性的抑制率及半数抑制浓度(IC50)。结果:400、200μg/ml黄芪提取物,20、10μg/ml黄芪甲苷与4、2μg/ml姜黄素可明显减少模型细胞NO含量(P<0.01);各质量浓度对NO产生均有一定抑制作用。2 000、1 500、750、375μg/ml黄芪提取物对α-葡糖苷酶活性有明显抑制作用(P<0.01);黄芪提取物、黄芪甲苷、阿卡波糖的IC50分别为(1 686.00±810.00)μg/ml、(132.90±10.50)μg/ml、(1.75±0.42)μg/ml。结论:黄芪提取物具有抑制LPS活化小鼠RAW 264.7巨噬细胞生成NO及抑制α-葡糖苷酶活性的作用,其中的黄芪甲苷可能为有效成分。