重组人Cu,Zn-SOD包含体的复性、纯化及复性蛋白稳定性研究

 目的通过体外复性和纯化技术获得具有高纯度、高生物活性的重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu,Zn-SOD),并研究复性蛋白的稳定性。方法以透析法对在大肠杆菌中以包含体形式表达的rhCu,Zn-SOD进行复性,采用金属螯合亲和层析对复性样品进行纯化,通过酶活性测定考查复性和纯化的rhCu,Zn-SOD的热稳定性、pH稳定性和对变性剂的稳定性。结果建立了体外透析复性的基本条件,其比活可达2 380 U·mg^-1。该复性样品经金属螯合亲和层析纯化后,结果得到纯度大于95%、比活5 000 U·mg^-1、活性回收率大于100%的目的蛋白。复性和纯化蛋白在温度25～70℃和pH 5.0～10.5内活性稳定,并可耐受2～10 mol·L^-1的尿素和2%～8%的十二烷基硫酸钠(SDS),对更强烈的变性剂盐酸胍稳定性较弱。结论确定了重组人Cu,Zn-SOD包含体的体外复性条件和复性蛋白纯化方法,且复性蛋白表现出很好的稳定性,为重组人Cu,Zn-SOD的生产奠定了良好基础。     

呼吸道合胞病毒重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法及免疫原性研究

 目的建立呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,并研究其免疫原性。方法PCR扩增G1和F/M2基因片段,经酶切后插入原核表达载体pET-DsbA中,构建重组质粒pET-DsbA-G1F/M2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni⁺螯合亲和色谱法纯化尿素变性的包涵体溶液,梯度透析复性,Western-blot鉴定重组蛋白的RSV特异性,免疫BALB/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL)。结果构建的重组质粒在E.coli中表达了RSV特异性的重组蛋白,经变性、纯化并复性后获得了高纯度的DsbA-G1F/M2(>90%);该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体和CTL活性。结论建立了重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础。     

v-Src蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其活性分析

 目的表达高纯度具有激酶活性的Src蛋白,为抗肿瘤药物研究提供蛋白质靶标。方法利用高效表达质粒pGEX-KT克隆v-src全基因,诱导表达得到的GST-Src融合蛋白经GlutationeSepharose4B亲和层析柱纯化后,采用Westernblotting和以polyGlu:Try(4:1)为底物的ELISA法鉴定其免疫原性和酪氨酸激酶活性。结果GST-Src蛋白表达量约占菌体总蛋白的30%,其中包涵体与可溶性蛋白的表达量分别约13.5和2mg·L^-1,纯度分别约98%和85%,比活约1.13和0.62nmol·min^-1·mg^-1。结论本法表达的GST-Src融合蛋白表达量高、纯化效果好,且具有较高的激酶比活。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体的表达、复性与分离纯化

 目的 获得具有高纯度、高生物活性的重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(瑞替普酶,reteplase,r-PA)。方法 reteplase基因克隆到表达质粒pJZ"-100中,转化Escherkhia coli BL21(DE3),在0.05mmol·L^-1异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)诱导下获得高效表达,表达产物通过脉沖稀释法复性,复性后的蛋白质用ETI-Sepharose4B亲和色谱纯化。结果 表达产物占菌体总蛋白质的20%,脉冲稀释法复性后复性收率为28%,经纯化后纯度达96%以上,比活为580 000 IU·mg^-1。结论 建立了reteplase表达、复性与纯化工艺,以此工艺可获得高活性高纯度的reteplase。     

抗人表皮生长因子受体2人源化单克隆抗体在中国仓鼠卵巢细胞中的表达、纯化及活性测定

 目的 筛选得到稳定表达重组人源化抗 HER2 单克隆抗体（rhHER2-mAb）的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）最优表达株,采用旋转振荡式培养及小规模放大,测定纯化后抗体蛋白的活性和亲和力。方法 使用一次性旋转振荡生物反应器——Tubespin 对细胞株进行高通量筛选,然后使用摇瓶进行规模放大培养,利用 Protein A 亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE、HPLC 检测产物的纯度,夹心ELISA 检测产物的表达量,MTT检测产物的活性。结果 通过比较,确定产量最高的 # 38 细胞克隆株,经过规模放大培养得到足量细胞上清液,摇瓶表达量达到（152±20） mg·L^-1。纯化后经检测目的蛋白的相对分子质量约为 150×10³,纯度在 96% 以上,与商品化的赫赛汀一致;活性检测和亲和力检测也显示其活性和亲和力与赫赛汀相当。结论 通过细胞株筛选得到高表达细胞株,经旋转振荡式放大培养,成功纯化获得抗体蛋白,与商品化药物性质一致,为大规模旋转振荡培养发酵奠定基础。     

重组人胰高血糖素样肽前药的表达、纯化及生物活性分析

 目的建立重组人胰高血糖素样肽前药(prodrug of recom binant human GLPs,Pro-rhGLPs)的表达、纯化方法,研究Pro-rhGLPs对体内血糖水平及血清胰岛素水平的影响。方法采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,0.01mmol·L^-1)诱导原核表达系统E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-hGLPs表达Pro-rhGLPs,12%SDS-PAGE检测蛋白表达量,Ni-NTA亲和层析纯化Pro-rhGLPs,应用Westernblot在体外观察前体药物的活性分子释放过程。在C57BL/6小鼠上进行葡萄糖耐量实验检测其生物学活性,不同时间间隔取血测定血糖及血清胰岛素水平。在糖尿病db/db小鼠上观察其降糖作用。结果所构建的Pro-rhGLPs原核表达系统中,Pro-rhGLPs表达量约为细菌总蛋白的50%。纯化得到的蛋白纯度达到95.43%,并且可以在特异性酶作用下缓慢降解,释放出多个胰高血糖素样肽1(GLP-1)分子。纯化的Pro-rhGLPs呈剂量依赖性降低血糖浓度,同时升高血清胰岛素水平。等剂量Pro-rhGLPs的降糖作用较GLP-1作用更强。结论建立了Pro-rhGLPs高效表达、纯化方法,获得了高纯度Pro-rhGLPs,对糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用。     

大肠杆菌T蛋白PDH结构域的高效表达纯化与活性测定

 目的构建高效表达菌株,以大量表达大肠杆菌T蛋白的预苯酸脱氢酶(PDH),为研究T蛋白双功能结构域CM和PDH的相互协同作用以及T蛋白抑制剂对其影响提供活性蛋白材料。方法利用pGEX高效融合表达系统将PDH与谷光甘肽疏基转移酶(GST)编码序列在表达宿主BL21实现高效表达,并利用对GST具有亲和作用的GlutathioneSepharose4B琼脂糖珠进行亲和层析以对其分离纯化。结果表达产物达菌体总蛋白的40%,可溶性目的产物得量为240mg·L^-1,利用亲和层析法纯化后纯度达92.5%,GSTPDH融合蛋白的PDH的比活为38U·mg^-1。结论本法成功构建高效表达PDH菌株,表达量高,纯化度高,GST-PDH酶活性正常,为进一步研究奠定基础。     

人细胞色素P450 2B6的异源表达及活性分析

 目的获得有活性的人CYP2B6重组酶,用于进一步药物代谢研究。方法采用Bac-to-Bac杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统进行人CYP2B6重组酶的表达,采用His抗体进行蛋白质印迹分析。安非他酮作为底物进行重组酶活性测定,高效液相色谱法测定其含量。结果蛋白质印迹分析检测到带有His标签的CYP2B6重组酶的表达,重组酶对安非他酮的Km值为(138±42)μmol·L^-1,V_max值为(676±21)pmol·min^-1·mg^-1蛋白。结论杆状病毒表达系统能成功表达有活性的CYP2B6重组酶,可用来进一步研究在药物代谢中的作用。     

小檗碱对肝细胞核因子4α表达及葡萄糖激酶活性的影响

目的：观察小檗碱对小鼠原代肝细胞核因子4α(HNF4α)表达及葡萄糖代谢关键酶葡萄糖激酶(GK)活性的影响，探讨小檗碱治疗2型糖尿病的分子机制。方法：采用改良两步灌流法培养小鼠原代肝细胞，用不同浓度的小檗碱(0, 1，3，10，30，100 μmol·L^-1)和1 mmol·L^-1二甲双胍干预24 h后，采用RT-PCR方法检测HNF4α mRNA表达；采用Western-blot方法检测HNF4α蛋白的表达，同时检测GK的活性。结果：与阴性对照组相比，小檗碱在10，30，100 μmol·L^-1时能够明显促进HNF4α mRNA及蛋白的表达，二者同时在30 μmol·L^-1时达到最大值(HNF4α mRNA相对吸光度为0.48±0.20,蛋白相对吸光度为3.47±0.86，P<0.01)；在10，30 μmol·L^-1时明显上调GK活性，同时在30 μmol·L^-1时达到最大值(0.080±0.073， P<0.05)；而二甲双胍对HNF4α mRNA、蛋白的表达及对GK活性的影响则与阴性对照组无明显差异。结论：小檗碱改善糖代谢的作用可能与其调节肝细胞核因子4α的表达进而调节GK活性有关。     

人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆、表达、发酵及纯化工艺研究

 目的:用基因工程的方法获得人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)的高产菌,通过发酵培养,最后纯化获得大量廉价的高纯度的hCu,Zn-SOD?方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增了人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)的cDNA,将此正确测定的cDNA重组到分泌型表达载体pET-22b(+)中,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中用5L全自动发酵罐表达hCu,Zn-SOD,表达产物用亲和层析一步法进行纯化?结果:hCu,Zn-SOD表达产物占菌体总蛋白的30%,发酵水平酶活力可达950u·ml^-1培基,比活为1400u·mg^-1,经亲和层析后纯度可达88%,活力回收率大于80%,比活大于5000u·mg^-1?结论:我们开展人重组SOD的研究不仅大大丰富了应用酶学的内容,而且积极开展应用研究,实现产业化,意义重大?     

冬凌草IrCYP71基因的克隆和功能

目的:克隆冬凌草二萜类化合物生物合成途径下游关键酶基因Ir CYP71,进行序列特征分析,对此基因编码的蛋白进行原核表达分析以及亚细胞定位,并对蛋白在宿主细胞表达的条件进行了优化。方法:根据转录组测序所得的Ir CYP71基因片段,克隆出全长c DNA序列;构建p ET28a(+)-Ir CYP71重组质粒,转化到Rosetta感受态细胞,小量表达和大量表达蛋白并鉴定,进行包涵体蛋白的纯化与复性,再对复性蛋白纯化鉴定分析。基于gateway克隆技术构建出PCR8/GW/TOPO-Ir CYP71载体之后与改造Pearleygate104载体重组,之后与农杆菌GV3101重组,转入烟草中瞬时表达,从而进行蛋白亚细胞定位。结果:克隆得到的Ir CYP71基因全长c DNA为1 593 bp,编码530个氨基酸,并在Gen Bank注册(登录号MG800628)。经大肠埃希菌表达系统表达的重组蛋白相对分子质量正确,在62 k Da左右,纯化后的重组蛋白总量有1 mg,蛋白纯度为85%。此蛋白亚细胞定位在细胞核。结论:对冬凌草Ir CYP71基因进行了初步验证,并对基因表达的蛋白进行原核表达和亚细胞定位,使该基因在冬凌草二萜成分的生物合成过程中的作用得到了进一步的阐述。     

荚膜红细菌十聚异戊二烯焦磷酸合成酶异源表达及纯化的研究

 目的构建生产辅酶Q₁₀的大肠杆菌基因工程菌并研究相关酶的表达情况。方法将荚膜红细菌(Rhodobacter capsula-tus B10)中十聚异戊二烯焦磷酸合成酶编码基因ddsA分别克隆在Lac,T7和Trc启动子下游,使其在Escherichia coli JM83中表达。同时利用His-tag的表达系统,对该酶的融合表达和镍柱纯化条件进行了研究。结果产物分析发现该基因在E.coli中表达出有活性的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并使宿主产生辅酶Q₁₀。同时,28℃培养过夜,该酶以可溶形式存在于上清液中。在150 mmol·L^-1咪唑的洗涤条件下,从镍柱上解离,并可以达到电泳纯。结论大肠杆菌可以表达 Rhodobacter capsula-tus B10 的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并合成辅酶Q₁₀。     

pQE-hbFGF表达系统的构建及其蛋白质的表达和纯化

 目的　构建pQE-hishbFGF表达载体,通过一步纯化得到6×HishbFGF蛋白质。方法　用PCR扩增目的基因hbFGF ,连接到pQE40载体上,转化到Top10菌株筛选重组子,经测序后将质粒转化到表达菌M15上,经IPTG诱导表达,超声波破菌后通过镍离子螯合层析一步纯化得6×HishbFGF蛋白质,ELISA鉴定产物 ,用MTT法检测产物促细胞增殖的生物活性。结果　hbFGF基因插入pQE载体中,在M15中6×HishbFGF的表达量达到20%,且为可溶性表达。经一步纯化后得到N端带 6个组氨酸的hbFGF蛋白,纯度为96%,6×HishbFGF具有免疫原性及促进NIH3T3细胞增殖的活性。结论　 6×HishbFGF蛋白质在M15中可溶性地高效表达,并经一步亲和层析得到纯度高活性高的产物,降低了生产成本,为大规模生产hbFGF及hbFGF的应用研究奠定了基础。     

茯苓免疫调节蛋白-1抗体的制备及分析

目的 制备重组茯苓免疫调节蛋白-1(WCFIP1)及其抗体。方法 合成WCFIP1基因、构建表达载体并转化大肠杆菌,表达并纯化重组蛋白,免疫小鼠、制备抗血清、纯化抗体并验证。结果 纯化得到重组WCFIP1蛋白并制备特异性抗体。结论 实现了重组WCFIP1蛋白的表达,纯化并制备了特异性较好的抗体。     

红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。