流式细胞术联合共聚焦显微镜对G2和M期作用位点的鉴别意义

本研究探讨抗癌药物在细胞周期G2期和M期作用位点的鉴别方法。用G2期和M期细胞阻滞刺的甲安吖啶（m—AMSA）和长春花碱（VBL）,分别诱导MOLT-4细胞产生细胞G2期和M期阻滞,用流式细胞术分析DNA直方图含量变化,共聚焦显微镜观察阻滞后细胞形态,并寻找上述两种药物诱导阻滞成功后的差异。结果表明：流式细胞术有检测显示,诱导阻滞成功的MOLT-4细胞均表现为G2／M峰增高,但仅凭流式细胞术单独检测无法判别两者差异。共聚焦显微镜观察显示甲安吖啶诱导G2期阻滞的细胞呈现G2期形态特征,VBL诱导M期阻滞的细胞呈现M期形态特征,共聚焦显微镜对细胞形态学的观察有助于区分两者的差异。因此,在流式细胞术验证诱导成功的基础上进一步经共聚焦显微镜观察有助于鉴别G2和M期的阻滞剂。结论：流式细胞术与共聚焦显微镜技术结合是判别抗癌药物的G2期和M期细胞阻滞剂类型的有效方法之一。     

Chk1/2反义寡核苷酸对顺铂作用下K562细胞凋亡的影响

为了观察顺铂作用下细胞周期变化规律和Chk1／2反义寡核苷酸转染K562细胞后对顺铂诱导凋亡的影响，采用流式细胞术检测顺铂作用下K562细胞周期变化；以脂质体作为载体，转染Chk1／2反义寡核苷酸于K562细胞，用Western blot和共聚焦显微镜检测转染Chk1／2反义寡核苷酸后Chk1／2蛋白表达；用流式细胞术检测转染Chk1／2反义寡核苷酸后顺铂作用下细胞凋亡率。结果发现，10μmol／L顺铂作用下K562细胞出现S期阻滞，Chk1／2反义寡核苷酸对K562细胞中Chk1／2蛋白表达有明显抑制作用，转染Chk1／2反义寡核苷酸可明显增加顺铂诱导下K562细胞凋亡率，Chkl和Chk2联合转染作用优于单独转染。结论：Chk1／2可作为白血病增敏治疗的有效靶点。     

甘草酸单铵盐调节急性早幼粒细胞白血病细胞NB4肿瘤干细胞样特性、氧化应激及线粒体的功能

目的:探讨甘草酸单铵盐(MAG)对急性早幼粒细胞白血病细胞NB4肿瘤干细胞样特性、氧化应激及线粒体功能的影响.方法:CCK-8法检测急性早幼粒细胞白血病细胞NB4活力,筛选合适剂量;克隆法检测NB4细胞增殖;Western blot检测细胞周期相关蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡并分选NB4干细胞阳性(CD133+);...     

三氧化二砷对NB4及Jurkat细胞系端粒酶活性的抑制效应

为了探讨三氧化二砷(As2O3)对白血病细胞系NB4及Jurkat细胞端粒酶活性的调节作用和机制，采用MTT、基因组DNA电泳、蛋白／DNA双参数流式细胞术，端粒重复扩增(TRAP)-SYBR Green I染色及RT—PCR等方法研究了As2O3对两种细胞的增殖及端粒酶活性的影响。研究发现，随着As2O3作用时间的延长，NB4及Jurkat细胞增殖明显受到抑制，DNA电泳出现“梯状”条带；流式细胞术检出亚Gl峰，细胞周期阻滞于Gl和G2／M期，端粒酶活性显著降低，部分细胞周期及凋亡相关的调控蛋白的表达发生变化。结论：As2O3在抑制NB4及Jurkat细胞增殖和诱导其凋亡过程中导致端粒酶的活性下调，细胞周期及凋亡相关蛋白的表达改变可能参与了部分作用机制。     

全反式维甲酸对人白血病细胞系U937细胞生长的影响及其机制分析

目的 研究全反式维甲酸(ATRA)作用于人白血病细胞系U937细胞后,对细胞生长的影响及可能的机制.方法 收集1 μmol/L ATRA作用后的U937细胞,利用流式细胞术检测细胞周期分布,Western blot法检测细胞周期相关蛋白(cyclinA、p16、021、027及p27相关分子skp2)表达水平的变化,采用免疫沉淀方法检测U937细胞中027与Skp2的结合情况.结果 流式细胞术分析显示,在1μmol/L ATRA作用72 h后,72%的U937细胞被阻滞在G0/G1期.Western blot分析显示,ATRA能诱导cyclinA、Skp2表达下凋,p21、p27表达上调.免疫沉淀法检测结果显示在U937细胞中p27与skp2存在相互结合的情况.结论 ATRA可能主要通过诱导p27表达上调引起U937细胞生长阻滞,其过程是由p27相关分子Skp2所介导的.     

沉默FRAT1基因对结肠癌HT-29细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究

目的 探讨沉默FRAT1基因对结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡的影响及其可能分子机制.方法 将成功转染FRAT1基因RNA干扰序列的人结肠癌HT-29细胞扩大培养,MTT比色法检测细胞增殖,双染流式细胞术检测细胞凋亡率,单染流式细胞术分析细胞周期,免疫荧光法激光共聚焦显微镜下观察β-catenin蛋白变化.结果 转染组细胞较对照组细胞生长明显减缓（P＜0.01）,凋亡率明显增加（P＜0.01）,细胞周期出现G0/G1期阻滞,差异显著（P＜0.01）,胞质β-catenin蛋白表达明显下调.结论 FRAT1基因RNA干扰序列可以有效诱导结肠癌HT-29细胞凋亡和细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,其机制可能通过下调β-catenin表达实现.     

DRAM基因真核表达载体的构建及其表达对HepG_2细胞的作用

目的:构建DRAM全长cDNA的真核表达载体pEGFP-DRAM,观察DRAM在人肝细胞HepG2中的作用。方法:应用RT-PCR技术扩增获得DRAM全长cNDA,克隆扩增产物,经酶切、DNA测序鉴定正确后,构成pEGFP-DRAM的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HepG2细胞,在激光共聚焦显微镜(LSCM)下观察DRAM的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期和死亡细胞,MTS法检测细胞增殖能力,Westernblot鉴定细胞表达蛋白质的水平,并在透射电子显微镜下观察自噬体。结果:构建完成的真核表达重组质粒pEGFP-DRAM,经DNA测序证实与GenBank中的人DRAM cDNA序列一致。LSCM下可观察到转染DRAM的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。流式细胞分析仪检测显示,转染DRAM的HepG2死亡细胞明显增高(P<0.05);G1期细胞百分数则明显减少(P<0.05);MTS法检测结果显示转染DRAM的HepG2细胞增殖力明显增高(P     

流式细胞术在肿瘤临床和研究中的应用

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对生物颗粒包括细胞、血小板、微生物以及人工合成的微球等进行多种物理和生物学特性的定量分析，并能对特定的细胞群加以分选的一种细胞多参量的分析技术。该技术集单克隆抗体技术、激光技术、细胞计数及计算机技术之大成，是医学分子生物学、血液学、细胞生物学、肿瘤学、免疫学、病理学、生理学等学科研究的重要手段，目前已广泛用于基础研究和临床研究。FCM的功能包括（1）细胞表型分析（celluar phenotype）、（2）DNA含量及细胞周期分析（DNA content analysis）、（3）胞内及核膜成份分析、（4）细胞分选、（5）自身抗体检测等。本文就流式细胞术在肿瘤临床和研究巾的应用作一概述。     

肿瘤DNA含量与p53，p21，p16，Rb基因异常表达的肿瘤生物学特性

背景：p53，Rb，p16和p2l蛋白是肿瘤相关基因产物，其异常表达在细胞周期的不同阶段直接或间接影响着肿瘤的形成和发展，DNA倍体异常也是肿瘤细胞周期频发事件，而肿瘤细胞DNA倍体与P53，Rb，P16和P2l蛋白异常表达关系间的研究鲜见报道。目的：研究流式细胞仪(FCM)检测肿瘤组织DNA倍体与多种癌相关基因蛋白p53，Rb，p16和p2l异常表达的意义。设计：以诊断为依据设立对照的前瞻性研究。地点和对象：实验地点：江苏省肿瘤防治研究所，实验对象：30例女性癌症患者，其中卵巢癌lO例，乳腺癌20例，平均年龄55岁。干预：对30例卵巢癌和乳腺癌瘤体中心灶进行3点取样，应用FCM检测DNA倍体及p53，Rb，p16和p2l异常表达。主要观察指标：肿瘤组织DNA倍体及p53，Rb，p16和p2l蛋白阳性细胞百分率。结果：瘤灶多点取样法可检测出90％(27／30)的异倍体；不同倍性的肿瘤普遍存在程度不同地p53，Rb，p21和p16基因蛋白异常表达。96．7％(29／30)的肿瘤存在至少一种以上癌相关基因(1353，Rb，p16，p21)异常表达。结论：DNA异倍体与多种癌相关基因蛋白异常表达均是肿瘤恶性指标，FCM同步检测这些指标，为快速了解肿瘤细胞生物学特性、把握患者临床治疗及预后提供了良好途径。     

鱼藤素对U937细胞细胞周期及核孔蛋白Nup98和Nup88的调控作用

目的研究鱼藤素对人类白血病细胞株U937细胞体外抗肿瘤作用，研究其引起细胞周期与核孔蛋白Nup98和Nup88的改变，探讨其抗癌作用的分子机制。方法采用MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期分布，激光共聚焦显微镜检测Nup98和Nup88蛋白表达变化，免疫电镜和流式细胞术观测鱼藤素对Nup98和Nup88的调控，Western blot检测鱼藤素对U937细胞Nup98和Nup88蛋白表达的影响。结果①鱼藤素对U937细胞具有明显的增殖抑制作用，其抑制作用呈时间和剂量依赖性。②鱼藤素作用U937细胞后细胞周期发生变化，0、5、10、20、40、80nmol／L鱼藤素处理U937细胞24h，主要使细胞阻滞于S期和G2／M期，而G1／G0期细胞呈浓度依赖性降低。G1／G0期细胞比例依次为73．01％、71．15％、68．42％、52．45％、43．99％和22．82％，S期细胞比例依次为17．18％、16．30％、18．09％、27．56％、31．21％和46．85％，G2／M期细胞比例依次为9．75％、12．31％、13．09％、18．99％、24．83％和27．79％。③鱼藤素可以调节U937细胞Nup98和Nup88的表达，低浓度即可使Nup98表达上调，而使Nup88表达下调。结论鱼藤素能够抑制U937细胞增殖，使细胞阻滞于S期和G2／M期，而G1/G0期细胞呈浓度依赖性降低。其抗肿瘤机制可能通过参与调控U937细胞Nup98和Nup88的表达，使Nup98表达上调，而使Nup88表达下调有关。     

脉冲电场联合野生型p53基因诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡

背景:在前期研究基础上,设想将基因电转染作为脉冲电场治疗恶性肿瘤的辅助方法。目的:探讨脉冲电场联合抑癌基因野生型p53基因诱导人宫颈癌hela细胞发生凋亡及相互作用。方法:采用空质粒及含有野生型p53的质粒转染Hela细胞得到Hela-vector、Hela-p53细胞,将Hela细胞、Hela-vector和Hela-p53细胞分别施加固定脉宽100μs、频率1Hz、脉冲数8个、电场强度为1500V/cm的脉冲电场处理。结果与结论:相同参数脉冲电场作用于各组细胞12h后,MTT结果显示Hela-p53组细胞吸光度明显低于Hela组(P<0.05);流式细胞仪及RT-PCR检测结果显示Hela-p53组的早期凋亡率和p53mRNA表达较Hela组明显增加;Westernbolt及激光共聚焦显微镜结果显示与Hela组比较,Hela-p53组细胞Bax蛋白表达明显上升,而Bcl-2蛋白则明显下降,Casepase-3相对荧光强度明显增强。表明野生型p53基因对宫颈癌Hela细胞生长有明显的抑制作用,野生型p53基因可以提高脉冲电场诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的作用。     

Lack of cell surface Fas/APO-1 expression in pulmonary adenocarcinomas.

The Fas receptor and ligand initiate an apoptotic pathway. Alterations in this pathway within tumor cells can result in escape from apoptosis and immune surveillance. We evaluated Fas protein expression in 42 primary pulmonary adenocarcinomas, and Fas expression and function in the lung adenocarcinoma cell lines A549 and A427. Immunohistochemical analysis demonstrated Fas protein expression in 47.6% of the tumors; however, Fas-positive tumors demonstrated cytoplasmic staining without cell surface expression. Northern blot analysis indicated that levels of Fas mRNA were similar in Fas protein-positive tumors to levels in normal lung tissue, but were reduced in Fas protein-negative tumors. Soluble form Fas was not detected in the majority of these tumors either by RT-PCR or Western blot analysis. Cell surface Fas protein expression was minimal in A549 and A427 cell lines as determined by flow cytometry. Both cell lines demonstrated Fas mRNA expression by Northern blot analysis and abundant protein expression by Western blot analysis. Transfection of the Fas cDNA derived from A549 cells induced surface Fas protein in COS cells; however, stable transfection of a native Fas cDNA into A549 cells failed to induce surface Fas protein expression. Parental A549 cells and A549 cells transfected with a Fas expression vector were resistant to Fas-mediated apoptosis. Transgenic expression of a FLAG-tagged Fas cDNA in A549 cells, with visualization of the Fas-FLAG protein using confocal microscopy, demonstrated that the Fas-FLAG protein was retained within cytoplasmic portions of the cell and was not translocated to the cell surface. These findings suggest that the Fas protein is reduced or not present on the cell surface in the primary lung tumors and is sequestered within A549 tumorigenic lung cells, and these alterations directly affect the cells resistance to Fas-mediated apoptosis.     

人骨肉瘤耐阿霉素细胞模型的建立及其生物学特性

背景：多药耐药是骨肉瘤化疗失败的重要原因,目前其耐药机制不明。目的：诱导建立耐阿霉素的人骨肉瘤细胞株并观察多药耐药蛋白1、多药耐药相关蛋白1和肺耐药蛋白的表达。方法：采用逐步递增阿霉素浓度间歇作用的方法诱导143B/WT细胞株建立143B/阿霉素耐药细胞株。结果与结论：经阿霉素诱导45d建立了143B/阿霉素细胞株,其对阿霉素高度耐药,对顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、长春新碱和紫杉醇亦产生不同程度交叉耐药;流式细胞仪检测显示与143B野生型细胞相比,143B/阿霉素细胞周期中G1和S期所占比例增加,而G2/M期所占比例明显减少;罗丹明外排实验显示,143B/阿霉素细胞药物外排能力显著高于143B/WT细胞（P〈0.01）;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察发现,143B/阿霉素细胞阿霉素相关性细胞凋亡率显著低于143B/WT（P〈0.01）;Western blot检测显示143B/阿霉素细胞多药耐药蛋白1表达水平较143B/WT显著升高（P〈0.01）,二者多药耐药相关蛋白1和肺耐药蛋白表达差异无显著性意义（P〉0.05）。提示143B/阿霉素细胞多药耐药的产生与多药耐药蛋白1表达升高相关。     

Klotho基因转染促进脂肪间充质干细胞增殖的实验研究

目的探讨klotho基因转染对脂肪间充质干细胞(ADSCs)增殖的影响。方法将含有klotho全长基因的真核质粒转染至从脂肪组织分离的ADSCs中,采用CCK-8法测定转染后细胞增殖率,western blot法检测转染后细胞周期蛋白D1的表达变化,流式细胞术检测转染前后ADSCs的细胞周期变化。结果转染klotho基因96h后AD-SCs的细胞增殖率为170.50%;流式细胞术检测结果显示,ADSCs转染klotho基因S期和G2期细胞明显增多;west-ern blot分析显示ADSCs转染klotho基因组细胞周期蛋白D1增高。结论转染klotho基因有促进ADSCs增殖的作用。     

聚乳酸纳米粒介导decoy片段调控大鼠脑微血管内皮细胞组织因子表达的体外研究

目的 探讨由聚乳酸纳米粒包裹的核因子（NF）-κB decoy寡核苷酸片段对体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞组织因子表达活性的调控功能。方法 以聚乳酸为材料，纳米沉积法制备载荧光标记NF-κB decoy-纳米粒混悬液，检测其物理表征、包封率和体外释放情况：共聚焦显微镜和流式细胞术观察和检测培养的脑微血管内皮细胞摄取decoy-纳米粒的效率和细胞内分布，运用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot技术分别比较摄取纳米粒的细胞在脂多糖（LPS）刺激下TF mRNA和P65表达的变化。结果 制备的decoy-纳米粒平均粒径为162．1nm，多分散指数为0．118，体外释放实验显示经28d其总释放率达92．3％，流式细胞术检测到细胞对decoy-纳米粒摄取随浓度和作用时间的增加而增加，被摄取的decoy-纳米粒位于细胞胞浆内，RT-PCR结果提示经纳米粒包载的NF-κB decoy具有生物活性，可以显著抑制LPS作用下脑微血管内皮细胞的TF表达水平，Western blot结果显示核提取物中P65的表达显著降低。结论 聚乳酸纳米粒能将NF-κB decoy寡核苷酸片段递送至细胞内，且能保持生物活性，该方法为脑血栓病基因治疗提供了依据。     

四种诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：不同诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化形成心肌样细胞功能学方面的研究未见报道。目的：观察5-氮杂胞苷、血管紧张素Ⅱ、骨形态发生蛋白2和P53特异性抑制剂对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法：分离大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为5组,即正常对照组,5-氮杂胞苷组、血管紧张素Ⅱ组、骨形态发生蛋白2组和P53特异性抑制剂组。采用流式细胞仪技术鉴定骨髓间充质干细胞表面特定抗原表达情况,Western blot法检测诱导4周后Cx43、肌钙蛋白Ⅰ表达情况,fluo3/AM钙离子探针激光共聚焦检测诱导4周后钙瞬变能力。结果与结论：骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD45的阳性表达率分别为89.1%,90.4%和1.9%。Western blot结果显示,各诱导组均有肌钙蛋白Ⅰ的表达,P53特异性抑制剂组较其余各组表达多（P〈0.05）,骨形态发生蛋白2组较其余各组表达少（P〈0.05）。Cx43蛋白在各组之间均有表达,正常对照组较各实验组明显较少（P〈0.05）,P53特异性抑制剂组较其余各组表达多（P〈0.05）,血管紧张素Ⅱ组较其余各组表达少（P〈0.05）。钙瞬变功能测定结果显示,荧光强度血管紧张素Ⅱ〉P53特异性抑制剂〉5氮杂胞苷〉骨形态发生蛋白2〉正常对照组（P〈0.01）。提示不同诱导剂诱导骨髓间充质干细胞之后,各实验组均能向心肌样细胞分化,表达心肌特异性蛋白。而不同诱导剂发挥作用的通路不同,从而对诱导骨髓间充质干细胞分化形成心肌样细胞的功能产生不同影响。     

真核表达载体pcDNA3.1/VEGF-B-EGFP的构建及在骨髓间质干细胞中的表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子B（vascular endothelial cell growth factor-B,VEGF-B）转染人骨髓间质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）的表达情况。方法将VEGF-B及编码增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid,cDNA）序列通过扩增、酶切、插入pcDNA 3.1质粒的多克隆位点,构建pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP真核表达质粒,应用脂质体介导的基因转染技术,将基因导入MSCs（pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP转染组）;应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况;流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应、蛋白印迹法检测VEGF-B的表达情况。结果 pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP转染组重组质粒转染MSCs 24h后,荧光显微镜下可见强绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率约为15%;RT-PCR检测结果显示,MSCs出现590bp目的基因;Western blot检测显示,在转染后MSCs中有VEGF-B表达。结论构建的VEGF-B真核表达质粒成功转染MSCs,为联合应用MSCs细胞移植和VEGF-B基因治疗心肌缺血的研究奠定了基础。     

USO1 promotes tumor progression via activating Erk pathway in multiple myeloma cells

ObjectiveThis study aimed to explore the influence of USO1 on multiple myeloma (MM) cell proliferation and apoptosis and the related molecular mechanism.MethodsThe expression of USO1 and MIF in MM tissues and cells, normal bone marrow tissues and cells were determined by qRT-PCR and western blot assay. The cell proliferation and apoptosis of MM cells before and after knockdown of USO1 were determined by MTT assay and flow cytometry, respectively. Before and after knockdown of USO1, the expression of the proliferation-related genes cyclin D1, Mcm2 and PCNA in MM cells was determined by qRT-PCR and western blot assay. The protein level of p-Erk1/2 and MIF was determined by western blot assay and ELISA, respectively.ResultsThe expression levels of USO1 and MIF in MM tissues and cells were much higher than those in normal bone marrow tissues and cells. Knockdown of USO1 resulted in the inhibited ability of cell proliferation and induced cell apoptosis. The expression of cyclin D1, Mcm2, PCNA and p-Erk1/2 decreased significantly after knockdown of USO1 as well as the decreased MIF secretion.ConclusionUSO1 gene may be a promising target for the therapy of human MM and its diagnosis marker.