羟基磷灰石纳米粒子对人结肠癌细胞生长和端粒酶活性的影响

目的观察羟基磷灰石纳米粒子对人结肠癌SW-480细胞的生长抑制作用。方法将羟基磷灰石纳米粒子以不同终浓度作用于人结肠癌SW-480细胞。用噻唑蓝（MTT）比色法观察其对结肠癌细胞的生长抑制；荧光显微镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪定性、定量分析细胞凋亡；端粒重复序列扩增——酶联免疫吸附（TRAP-ELISA）方法测定细胞内端粒酶活性的变化。结果羟基磷灰石纳米粒子对SW-480细胞的生长有明显抑制作用，具有剂量依赖性（r=0.916，P〈0.01）。荧光显微镜观察到细胞皱缩、核质浓缩及核碎裂等形态学变化。琼脂糖凝胶电泳观察到特征性的凋亡梯状带。随Nano—HAP浓度的递增（0、12.5、25、50、100、200mg／L）细胞凋亡率升高（3.57％、16.32％、19.51％、21.45％、37.10％、49.45％），而端粒酶活性降低（2．08、1.71、1.52、1．44、0．92、0．67），与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）。结论羟基磷灰石纳米粒子能显著抑制人结肠癌SW-480细胞的生长，其作用机制与诱导细胞凋亡和下调细胞端粒酶活性有关。     

羟基磷灰石纳米粒子诱导人肝癌细胞凋亡的研究

羟基磷灰石纳米粒子是近年研制的抗癌新药 ,具有作用缓和及抗瘤谱广的特点。我们从羟基磷灰石纳米粒子诱导人肝癌BEL 740 2细胞凋亡的角度探讨其抑制癌细胞生长的机制 ,为纳米材料用于临床提供依据。一、材料和方法1.材料 :羟基磷灰石纳米粒子由华东理工大学生物材料中心提供 ;RNase酶、蛋白酶K、碘化丙锭 (PI)及Hochest3 3 2 5 8荧光染液购于Sigma公司。Hi tachi 60 0型透射电镜 ,日立公司 ;FAC Sort流式细胞仪 ,BectonDickinson公司。人肝癌细胞系BEL 740 2 ,武汉大学典藏中心提供 ,培养于含 10 %小牛血清的RPMI 164 0培养液中 …     

BH3-only在奥沙利铂诱导结肠癌细胞凋亡中的作用

目的研究BH3-only基因表达在奥沙利铂诱导人结肠癌细胞株凋亡中的作用及其机制。方法采用不同浓度（0．3、0．6、1．25、2,5、5、10和20mg／L）奥沙利铂处理人结肠癌细胞株SW480及HT29,应用MTT检测细胞生长抑制情况;流式细胞仪检测凋亡情况;荧光定量PCR检测BH3-only基Bim和PUMA表达。结果不同浓度奥沙利铂分别作用于结肠癌细胞SW480后,出现不同程度的细胞生长抑制作用,呈剂量依赖性。5mg／L和10mg／L浓度的奥沙利铂作用于SW480细胞24h后,细胞凋亡率分别为（4．87±0．55）％和（12．10±1．04）％,作用48h后分别为（11．47±0．85）％和（30．07±2．01）％,作用72h后分别为（28．99±2．12）％和（38．32±3．15）％,均显著高于相应时间点对照组细胞的凋亡率[（0．30±0．10）％、（0．40±0．10）％和（0．50±0．20）％,均P〈0．01]。同时Bim和PUMAmRNA表达水平也显著高于对照组（P〈0．05）。而同样处理的HT29细胞其生长抑制率、细胞凋亡率及Bim和PUMAmRNA表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论奥沙利铂具有抑制结肠癌细胞株SW480生长并诱导其凋亡的作用,其机制可能与促凋亡相关基因BH3-only（Bim和PUMA）表达增强有关。     

羟基磷灰石纳米粒子诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡的机制

目的 探讨羟基磷灰石纳米粒子(nano-HAP)诱导肝癌细胞凋亡的机制.方法 羟基磷灰石纳米粒子处理BEL-7402细胞后,免疫印迹法检测p53、c-myc蛋白表达水平;比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性;端粒重复序列扩增-酶链免疫吸附反应法(TRAP-ELISA)方法测定细胞内端粒酶活性的变化.结果 羟基磷灰石纳米粒子处理BEL-7402细胞使抑癌基因p53的表达上升、癌基因c-myc的表达下降.随羟基磷灰石纳米粒子浓度的递增(0、50、75、100、150、200 mg/L),端粒酶活性降低(1.94、1.26、1.21、1.14、0.86、0.59),随着作用时间延长(0、12、24、36、48 h)端粒酶活性降低(1.94、1.73、1.57、1.43、1.26),并激活Caspase-3.结论 羟基磷灰石纳米粒子能通过上调p53、下调c-myc基因表达,抑制端粒酶活性及激活Caspase-3等途径诱导肝癌细胞凋亡.     

三氧化二砷对肝癌细胞系BEL—7402的影响

目的 观察不同浓度的三氧化二砷作用不同时间对肝癌细胞BEL－7402的影响及其作用机理。方法 应用不同浓度的三氧化二砷作用于肝癌细胞后，观察肝癌细胞的存活、形态学改变，并通过流式细胞仪和DNA梯状电泳观察细胞凋亡的情况。结果 不同浓度的三氧化二砷作用于肝癌细胞有明显的时间和剂量依赖性，发生作用后细胞生长明显受抑制；有明显的凋亡特征性改变：细胞膜完整、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成；流式细胞仪分析显示，肝癌细胞存在G2／M期阻滞，在G1峰前出现明显的凋亡峰；琼脂糖凝胶电泳出现明显的凋亡特征性梯状条带。结论 三氧化二砷可明显抑制肝癌细胞的生长，其机理主要是诱导肝癌细胞凋亡。     

转染自杀基因G1CEACDNa致SW480细胞死亡的机制

目的 研究转染了逆转录病毒载体G1 CEACDNa致SW480肠癌细胞的死亡机制。方法 脂质体法转染G1CEACDNa至SW480细胞。行RT-PCR间接验证CD基因的表达情况。细胞计数测量生长曲线;用含1mmd／L5-氟胞嘧啶(5-FC)的1640培养基培养细胞,MTT法测生长抑制率和旁观者效应;透射电镜观察细胞的超微结构;流式细胞仪annexin V和P1双重染色行细胞凋亡检查。结果 RT-PCR产物电泳显示在1．5kb处可见相应的显影条带。MTT比色实验示1mmol／L5-FC作用下CD SW480细胞在48h开始生长抑制,72,96,120h抑制率分别约为30．0％,50．0％,80．0％。电镜下可见凋亡的早、中、晚期细胞及凋亡小体,同时可见部分细胞呈坏死改变。流式细胞仪显示48h开始有少量细胞出现凋亡,72,96h细胞群凋亡和坏死的比率分别为20．2％,30．7％和19．6％．21．1％。结论 转染G1 CEACDNa的SW480细胞给予5-FC处理后,其细胞死亡机制为坏死和凋亡并存,细胞凋亡过程的诱导可能是该治疗过程中的旁观者效应。     

三氧化二砷诱导肝癌Bel-7402细胞凋亡与线粒体跨膜电位关系的研究

目的研究三氧化二砷（As2O3）诱导人肝癌细胞系Bel-7402细胞凋亡及与线粒体跨膜电位的关系。方法应用不同浓度的As2O3作用于肝癌细胞后，观察As2O3对肝癌细胞生长状态的影响；通过噻唑蓝（MTT）比色法观察其对Bel-7402细胞增殖的影响；利用共聚焦显微镜及流式细胞术观察经Annexin V-FITC／PI双染后的细胞早期凋亡；通过共聚焦显微镜及流式细胞仪检测线粒体跨膜电位（MMP）的改变情况；并通过底物染色法反映Caspase-3的活性。结果不同浓度的As2O3作用于肝癌细胞后有明显的时间和剂量依赖性；经Annexin V-FITC／PI双染后，可观察到Bel-7402细胞的早期凋亡现象，2μmol／L As2O3作用24h细胞凋亡率为9．89％，作用48h细胞凋亡率为48．53％，而4μmol／L As2O3作用24h细胞凋亡率为18．27％，作用48h细胞凋亡率为67．52％；经As2O3药物作用后，细胞线粒体膜电位水平下降，且与药物作用时间和药物浓度有关（P〈0．05）；同时Caspase-3活性被激活。结论As2O3可明显抑制肝癌细胞Bel-7402的生长，并使细胞线粒体膜电位下降，诱导肝癌细胞凋亡。     

复方苦参注射液与5-氟尿嘧啶对大肠癌细胞凋亡的影响

目的 探讨复方苦参注射液与5-氟尿嘧啶对大肠癌LoVo细胞生长抑制及诱导凋亡的影响。方法 台盼蓝染色法测定药物对LoVo细胞抑制作用与时间和剂量的关系，用荧光显微镜、琼脂糖凝胶电泳对细胞凋亡进行检测。结果台盼蓝实验表明，经40μg／L复方苦参注射液单独处理细胞，LoVo细胞增殖的抑制率24h，12．8％；48h，25．4％；72h，42．2％。12．5mg,／L5-Fu单独处理的LoVo细胞，其增殖抑制率24h，16．3％；48h，23．1％；72h，29．3％；而当两者合用时，对LoVo细胞增殖的抑制率24h，26．8％；48h，72．3％；72h．84．6％。复方苦参注射液和．5-Fu对LoVo细胞的生长均有抑制作用，并诱导发生凋亡。实验范围内其细胞凋亡成时间与剂量依赖关系。并且复方苦参注射与低浓度的化疗药物有协同作用，可产生较强的抑制细胞增殖的作用。结论 复方苦参注射具有直接的抗肿瘤作用，并且具有增强5-Fu化疗药物作用的功效。     

Doxycycline抑制人肝癌细胞系HepG2生长的实验研究

目的：观察多西环素（Doxycycline）对人肝细胞性肝癌细胞系HepG：生长抑制和凋亡的作用，并初步探讨其作用机制。方法：不同浓度的Doxycycline（5、10、20、30和50mg／L）对体外培养人肝癌细胞系HepG：进行不同的时间干预（24、48和72h），MTT法测定细胞生长抑制率，TUNEL法检测细胞凋亡率，免疫细胞化学检测Fas、FasL及MMP-2蛋白表达的变化。结果：Doxycycline作用HepG2细胞48h和72h后，细胞生长被明显抑制，与无药对照组比较差异有统计学意义（P〈0．001），且呈时间、浓度依赖趋势。其细胞凋亡率较无药对照组也明显升高（P〈0．01）；20mg／L Doxycycline作用于癌细胞48h后，实验组FasL蛋白阳性表达较无药对照组明显升高，MMP-2蛋白阳性表达较无药对照组明显降低，两组差异均有统计学意义（P〈0．01），而Fas蛋白表达则差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2具有明显的生长抑制和促凋亡作用，其机制可能与下调MMP-2、上调FasL从而启动Fas／FasL膜受体途径有关。     

Stat3与过氧化物酶体增殖因子激活受体δ信号转导通路间交互作用对结肠癌细胞增殖的调控影响

目的观察选择性环氧合酶（COX）-2抑制剂NS-398对结肠癌细胞系SW480中Star3与过氧化物酶体增殖因子激活受体（PPAR）δ信号转导通路的影响，探讨不同信号转导通路间交互作用调控结肠癌细胞增殖的分子机制。方法应用逆转录．聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测结肠癌细胞系SW480中COX-2 mRNA表达水平，用选择性COX-2抑制剂NS-398处理结肠癌细胞系SW480，Western blot检测Star3与PPARδ信号转导通路成员表达，噻唑蓝（MTT）比色试验检测细胞增殖状态，流式细胞技术检测细胞周期与凋亡。结果结肠癌细胞系SW480中未检测到COX-2 mRNA表达，NS-398（75μmol／L）作用于SW480细胞72h后，G1期细胞比率由37．9％上升至48．6％，S期细胞比率分别由58，1％，下降至44．9％，细胞增殖受抑制。Stat3、PPARδ、Cyclin D1与bcl-x L表达水平随NS-398作用时间延长而下降。结论选择性COX-2抑制剂NS-398可能通过非COX-2依赖途径影响结肠癌细胞的增殖。     

转染TSLC1基因肝癌细胞株BEL-7402生物学特性的研究

目的 将人TSLCl基因转染人肝癌细胞BEL-7402中稳定表达,检测转染后细胞生物学特性的变化.方法 用脂质体法将TSLCl基因的真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)/TSLCl导人人肝癌细胞株BEL-7402中,G418筛选克隆,再以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、Western blot的方法检测TSLCI的表达,细胞计数、流式细胞术及裸鼠负荷瘤实验分析转染后细胞的生物学特性变化.结果 TSLCl在BEL-7402细胞中的表达可抑制BEL-7402细胞的生长,BEL-7402-TSLCI与BEL-7402比较s期及G2/M期的细胞减少,G0/G1期的细胞增加.转染后的BEL-7402-TSLCl细胞的凋亡明显增加,转染后荷瘤裸小鼠肿瘤的生长受到抑制.结论 TSLCl基因的转染可以抑制BEL-7402细胞的增殖、诱导肝癌细胞的凋亡,为肝癌的基因治疗提供理论依据.     

西罗莫司诱导人肝癌细胞株BEL-7402凋亡及其机制

目的探讨西罗莫司（SRL）在体外诱导人肝癌细胞株BEL-7402的凋亡作用及其机制。方法以不同浓度的SRL（5、10、20、30、40和50nmol／L）作用于体外培养的人肝癌细胞株BEL-7402，应用流式细胞仪检测培养24、48和72h时的细胞凋亡情况；Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡时的形态学变化；Western Blot法观察BEL-7402细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bcl-xl和Bax基因的表达变化；采用Caspase-3试剂盒检测Caspase-3酶的活性；JCl染色法检测细胞线粒体膜电位（△ψbm）。结果SRL可诱导BEL-7402细胞凋亡，并与药物浓度和作用时间呈正相关。SRL作用BEL-7402细胞后48h，在Hoechst33258荧光染色图片上可见核浓缩及核碎裂等典型的细胞凋亡特征，凋亡过程中线粒体膜电位下降及Caspase-3酶原蛋白激活，伴有Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达的降低和Bax蛋白上调。结论SRL能使抗凋亡蛋白Bcl-2、gcl-xl表达降低，促凋亡蛋白Bax表达上调，线粒体膜电位下降，激活Caspase-3酶原蛋白，从而诱导细胞凋亡。     

拓扑替康对人肝癌BEL-7402细胞体外迁移、黏附的影响

目的 研究拓扑替康（topotecan,TPT）对人肝癌BEL-7402细胞体外迁移、黏附的影响.方法 体外培养人肝癌BEL-7402细胞,分为实验组和空白组,实验组分为三个亚组,分别用0.1、0.2、0.3 mmol/L的TPT进行干预,空白组给予不合TPT的培养液.采用划痕实验和Transwell小室迁移实验检测TPT对BEL-7402细胞体外迁移能力的影响,采用黏附实验检测TPT对BEL-7402细胞黏附和异质黏附能力的影响.结果 0.2、0.3 mmol/L TPT组中BEL-7402细胞的体外迁移能力受到抑制,同质黏附能力增强,而异质黏附能力减弱,差异具有统计学意义（P均＜ 0.05）.结论 拓扑替康可抑制肝癌BEL-7402细胞的迁移和异质黏附能力,增强肝癌细胞的同质黏附能力.     

奥曲肽与胰岛素对人肝癌细胞影响的实验研究

目的：探讨在体外胰岛素能否促进人肝癌细胞增殖,奥曲肽对其诱导的增殖活动有无抑制作用。方法：将奥曲肽与胰岛素直接作用于体外培养的人原发性肝癌细胞株,运用MTT、直接细胞计数及流仪测定等方法观察奥曲肽与胰岛素对肝癌细胞的活细菌数及其比值,细胞总数、细胞周期及增殖指数（PI）的影响。结果：胰岛素（0－5μg/ml)使人肝癌细胞株BEL0－7402的细胞总数、活细胞数及其比值增加;而奥曲肽（0－2μg/ml）则使细胞基础的及胰岛素刺激的细胞总数、活细胞数及其比值下降,5μg/ml的胰岛素增加细胞的PI值而1μg/ml的奥曲肽降低其PI值（P＜0．05）,并产生S期限滞作用。结论：在体外,胰岛素可诱导人肝癌细胞增殖,奥曲肽不仅直接抑制肝癌细胞的增,对胰岛素诱导的肝癌细胞增殖也有抑制作用。     

生长激素干预肝癌细胞及共培养脐静脉内皮细胞生长

目的 观察重组人生长激素(rhGH)对人肝癌细胞株SMMC-7721和Bel-7402,共培养脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的影响.方法 ECV304及其与Bel-7402、SMMC-7721共培养三组分别行rhGH 50及250μg/L、贝伐单抗50 mg/L及其联合rhGH 250 μg/L的干预.Bel-7402和SMMC-7721分别接受两浓度rhGH干预.流式细胞术测细胞周期比.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)/酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定肝癌细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA/蛋白表达.结果 Bel-7402表达生长激素受体(GHR),SMMC-7721不表达GHR;两剂量rhGH干预后Bel-7402的PI指数(42.69.4±0.40和44.10±0.19)较空白组(39.40±0.48)明显升高,同环境ECV304的PI指数显著升高[(45.62±O.87)%和(47.64 ±1.28)%,呈浓度依赖(P<0.05);贝伐单抗干预后,Bel-7402共培养ECV304的PI指数显著下降[(42.69 ±1.05)%和(42.84±0.77)%,P<0.05).与对照组[mRNA/蛋白:(14.179±3.110)ns/L/0.171±0.064]比较,两rhGH浓度干预,Bel-7402表达VEGF mRNA/蛋白水平也显著增加[(125.499 4-2.680)和(131.312 4-2.560)ng/L/0.296 ±0.024和0.460 ±0.037,P<0.05];SMMC-7721各组均未出现类似情况.结论 rhGH明显促GHR阳性表达人肝癌细胞株Bel-7402增殖,促其过量分泌VEGF致共培养内皮细胞ECV304增殖.     

三氧化二砷对原发性肝癌的作用及其机理研究

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对肝癌细胞系BEL-7402的影响及其作用机理,并观察不同应用途径对原发性肝癌患者的治疗效果。方法 观察As2O3作用后肝癌细胞的形态学改变、并通过流式细胞仪和DNA梯状电泳观察细胞凋亡的情况,应用逆转录聚合酶链式反应和荧光分光光度计检测半胱氨酸蛋白酶-3的变化情况。观察其对裸鼠移植瘤生长抑制的效果。并分别通过静脉滴注和动脉持续灌注观察其对原发性肝癌患者的治疗效果。结果 不同浓度的As2O3作用于肝癌细胞有明显的时间和剂量依赖性,发生作用后细胞生长明显受抑制,有明显的凋亡特征性改变;流式细胞仪分析存在G2／M期阻滞,在G1峰前出现明显的凋亡峰;琼脂糖凝胶电泳出现明显的凋亡特征性梯状条带。随着As2O3作用时间的延长,半胱氨酸蛋白酶-3的mRNA无明显变化,而半胱氨酸蛋白酶-3蛋白质的活性逐渐增高。不同浓度的As2O3对于裸鼠肝癌移植模型有明显的抑制生长作用。对28例患者的静脉输注治疗可明显改善患者的生存质量,并且具有毒副作用小的特点。43例动脉灌注治疗患者中,30例肿瘤体积缩小或不变,有效率为69．8％,19例甲胎蛋白下降或降至正常。结论 As2O3可明显抑制肝癌细胞的生长,其机理主要是诱导肝癌细胞凋亡;凋亡的可能机理是通过半胱氨酸蛋白酶-3起作用,作用位点是在酶的前体水平;应用As2O3连续区域化疗对原发性肝癌有很好的治疗效果。     

TGF—β1抑制肝癌细胞株BEL—7402的增殖

目的 研究转化生长因子－β１对体外培养肝癌细胞株ＢＥＬ－７４０２增殖的影响。方法 用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入方法检测ＴＧＦ－β１对肝癌细胞株ＢＥＬ－７４０２增殖的抑制率;用逆转录整合酶链方法检测转化生长因子－β１及其Ⅱ型受体在ＢＥＬ－７４０２中的基因表达。     

重组人生长激素对体外培养的Bel-7402肝癌细胞生长激素受体的调控作用

目的 了解重组人生长激素(rhGH)对体外培养的Bel-7402肝癌细胞生长激素受体(GHR)的调控作用.方法 采用放射配体法了解7402肝癌细胞生长激素受体(GHR)的表达情况,检测不同浓度(0,1,10,100,1000,10 000 ng/ml)rhGH对肝癌细胞GHR表达的影响,用辣根过氧化酶法了解7402肝癌细胞培养上清液的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的变化,采用肿瘤细胞计数、噻唑蓝比色法了解肝癌细胞在不同浓度rhGH作用下药物敏感性,计算细胞生长率;用流式细胞计了解肝癌细胞在上述浓度rhGH作用下细胞周期各时相细胞比率、细胞增殖指数(PI)以及凋亡率变化.结果 放射配体法发现7402肝癌细胞表达GHR,在rhGH作用后24 h,7402肝癌细胞GHR的位点数量在10与100 ng/ml实验组较对照组增加(P<0.05),在10 000 ng/ml组较对照组降低(P<0.05);rhGH作用后的24 h与48 h,7402肝癌细胞上清液IGF-Ⅰ浓度在100 ng/ml组较对照组显著增高(P<0.05);与此同时,rhGH对体外培养的7402肝癌细胞增殖具有一定程度刺激作用,表现为rhGH在100 ng/ml浓度时促进肝癌细胞增殖较显著,而rhGH在其它浓度(1,10,1000,10 000 ng/ml)对肝癌细胞的增殖虽能表现出一定程度促进作用,但总体效果较rhGH在100 ng/ml浓度为弱.rhGH作用48 h流式细胞检测发现各实验组S期所占比率、PI均较对照组升高(P<0.05);G2-M细胞所占比率,10 ng/ml组与100 ng/ml组较对照组显著增高(P<0.05);各实验组凋亡率与对照组比较无显著差异.结论 rhGH可促进7402肝癌细胞DNA的合成,提高肿瘤细胞分裂增殖能力,原因可能与7402肝癌细胞表达GHR,rhGH可在一定浓度范围内上调7402肝癌细胞GHR的表达,促进肿瘤细胞合成IGF-Ⅰ有关,其确切途径仍有待进一步验证.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂蛋白去乙酰化酶抑制剂对原发性肝癌细胞增殖的影响

目的 观察组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)对原发性肝癌细胞增殖的影响.方法 噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度(30、150、1000μg/L)TSA对原发性肝癌细胞生长的影响.结果 TSA浓度为30μg/L时,实验组与对照组细胞的吸光度值差异无统计学意义(P>0.05),说明TSA(30μg/L)对细胞的增殖基本无影响;当TSA浓度达到1000μg/L时,实验组细胞大量崩解、坯死,对细胞产生了严重的毒性作用;当TSA浓度为150μg/L时,实验组细胞无崩解、坏死现象,其36h和48h细胞的吸光度值低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 HDAC抑制剂TSA对体外培养的原发性肝癌细胞的增殖生长具有抑制作用,并且这种抑制作用呈现一定剂量依赖性和时间依赖性.