中和抗体检测应用于新型冠状病毒mRNA疫苗效力分析

目的 通过对新型冠状病毒（2019 novel coronavirus,2019-nCoV）mRNA疫苗（简称新冠mRNA疫苗）免疫小鼠后产生的中和抗体进行检测，探索中和抗体检测法应用于mRNA疫苗体内效力评价的可行性。方法 采用6～8周BALB/c小鼠进行后肢肌肉免疫，检测不同免疫剂量和不同免疫程序的中和抗体滴度。并对8家企业生产的新冠mRNA疫苗免疫的小鼠血清进行中和抗体和IgG抗体检测。结果 2 µg、5 µg、10 µg不同剂量mRNA疫苗按照不同免疫程序免疫小鼠后中和抗体检测结果显示，抗体阳转率均为100%，中和抗体反应有明显的剂量-效应关系。2针间隔14 d加强免疫组抗体滴度显著高于间隔7d加强免疫组及一针组（F=57.13, P<0.001）。2 µg剂量间隔7 d加强免疫和间隔14 d加强免疫产生的中和抗体几何平均滴度（geometric mean titer,GMT）分别为218和468，差异有统计学意义（t=3.40， P=0.003）；5 µg剂量间隔7 d加强免疫和间隔14 d加强免疫产生的中和抗体GMT分别为499和1 436，差异有统计学意义（t=3.62，P=0.002）；10 µg剂量间隔7 d加强免疫和间隔14 d加强免疫产生的中和抗体GMT分别为608和1 909，差异有统计学意义（t=3.23，P=0.005）。国内8家企业生产的新冠mRNA疫苗免疫小鼠后均可产生高滴度的IgG抗体(104.5～107.5)和中和抗体(102.6～104.8)，效力测定结果均符合企业质量标准。各企业生产的mRNA疫苗的中和抗体滴度结果差异有统计学意义（F=70.03，P＜0.001）。结论 小鼠免疫后中和抗体检测可用于mRNA疫苗的体内效力评价。     

降植烷诱导小鼠系统性红斑狼疮模型研究

目的 建立降植烷诱导的系统性红斑狼疮（SLE）小鼠模型,并对模型进行全面验证。方法 6~8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为两组,模型组单次ip降植烷0.5 mL,对照组单次ip生理盐水0.5 mL。注射前及注射后2、3、4、5、6个月ELISA法检测血清中抗SLE抗体（anti-SLE）、抗双链DNA抗体（anti-dsDNA）;注射前及注射后每月1次采用目测尿蛋白试纸测定小鼠尿蛋白;6个月处死动物,观察肾脏HE染色及直接免疫荧光染色后镜下变化。结果 小鼠ip降植烷2个月后,其自身抗体（anti-dsDNA、anti-SLE）浓度显著高于对照组（P<0.05、0.01）,且6个月内抗体浓度逐渐升高;6个月时,73%模型组小鼠出现++++尿蛋白;肾脏HE切片显示模型组小鼠肾脏出现肾小球肿胀、炎症细胞浸润等典型的肾病理改变,直接免疫荧光染色见模型组小鼠肾小球毛细血管存在免疫复合物沉积,对照组小鼠肾脏组织未见改变。结论 降植烷成功诱导SLE动物模型。     

构树总黄酮对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

目的 探讨构树总黄酮（total flavonoids of Broussonetia papyrifera,TFBP）对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠免疫功能的影响。方法 用环磷酰胺复制免疫抑制模型并随机分为模型组、构树总黄酮高、中、低剂量组（200,100,50 mg·kg^-1·d^-1）,以正常小鼠为空白对照组。分别于饲喂构树总黄酮后第10天和第30天采样,检测白细胞含量、腹腔巨细胞吞噬功能、T、B淋巴细胞转化率、血清IgG含量及BSA抗体水平。结果 与模型组比较,饲喂TFBP的高、中、低剂量组小鼠的白细胞含量、腹腔巨噬细胞吞噬功能、T、B淋巴细胞转化率、BSA抗体水平和血清IgG均显著升高（P < 0.05或P < 0.01）,随着TFBP剂量的增加,上述免疫指标与空白对照组相近。结论 构树总黄酮能显著改善环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫功能。     

猫爪草粗多糖治疗自身免疫性甲状腺炎的实验研究

目的 研究猫爪草粗多糖对实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）小鼠免疫干预作用。方法 雌性BALB/C小鼠多点皮下注射甲状腺球蛋白辅以佐剂,配合饮用高碘水,形成实验性自身免疫性甲状腺炎模型,用药干预。用化学发光法检测实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠血清甲状腺素（TT4）、三碘甲状腺原氨酸（TT3）、游离甲状腺素（FT4）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、高灵敏人促甲状腺激素（TSH）;用放射免疫法检测抗甲状腺球蛋白抗体（TGAb）、抗甲状腺微粒体抗体（TMAb）。结果 与正常组相比,实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠血清甲状腺素、游离甲状腺素、游离三碘甲状腺原氨酸显著降低（P<0.01）,高灵敏人促甲状腺激素、抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺微粒体抗体显著升高（P<0.01）;三碘甲状腺原氨酸与正常组无显著性差异。用药治疗后,与模型组相比,猫爪草粗多糖各剂量组甲状腺素、游离甲状腺素、游离三碘甲状腺原氨酸水平显著回升（P<0.01）,抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺微粒体抗体水平仍旧处于高位。结论 实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠处于甲减状态,猫爪草粗多糖能在一定程度上干预实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠的甲状腺激素水平,有利于其恢复,其作用可能与其抗炎及免疫调节功能有关。     

生脉类制剂生产过程中红参、麦冬、五味子固体废弃物组合对小鼠免疫功能的影响

目的 以注射用益气复脉（冻干）生产过程中弃去的固体废弃物为例，探讨生脉类制剂生产过程中红参、麦冬、五味子固体废弃物组合（SMGFW）对小鼠免疫功能的影响。方法 将280只SPF级ICR雄性小鼠随机分成4组：对照组和SMGFW低、中、高剂量（0.86、1.71、3.43 g·kg^-1）组，每组70只。通过刀豆蛋白A（ConA）诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验、绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠足跖增厚实验、抗体生成细胞检测实验、半数溶血值（HC₅₀）测定实验、碳廓清实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（半体内法）和NK细胞活性测定实验（乳酸脱氢酶测定法）评价SMGFW增强小鼠免疫功能的作用。结果 与对照组比较，SMGFW低剂量组小鼠血清抗体水平显著增加（P<0.001）；SMGFW中剂量组小鼠脾脏指数显著增加（P<0.05），小鼠脾淋巴细胞增殖率显著增加（P<0.001），小鼠足跖差值显著增加（P<0.001），小鼠溶血空斑数显著增加（P<0.001），小鼠血清抗体水平显著增加（P<0.001），小鼠碳廓清吞噬指数显著增加（P<0.05），小鼠巨噬细胞对鸡红细胞吞噬百分率显著增加（P<0.001），吞噬指数显著增加（P<0.001），小鼠NK细胞活性显著增加（P<0.001）；SMGFW高剂量组小鼠体质量增加值显著降低（P<0.01），小鼠足跖差值显著增加（P<0.001），小鼠溶血空斑数显著增加（P<0.001），小鼠血清抗体水平显著增加（P<0.001），小鼠巨噬细胞对鸡红细胞吞噬百分率显著增加（P<0.05），吞噬指数显著增加（P<0.01），小鼠NK细胞活性显著增加（P<0.01）。结论 生脉类制剂生产过程中红参、麦冬、五味子固体废弃物组合具有增强小鼠免疫功能的作用。     

检测血清抗PLA2受体抗体在特发性膜性肾病中的意义

目的 探讨特发性膜性肾病（IMN）患者血清抗PLA2受体（PLA2R）抗体与尿蛋白谱的变化情况及临床意义。方法 回顾性分析2015年11月至2016年5月安徽医科大学第一附属医院肾内科行肾脏活检并确诊IMN患者60例的临床资料,比较血清抗PLA2R抗体阳性与阴性患者尿蛋白谱的差异。结果 血清抗PLA2R抗体阳性组患者的血清清蛋白低于阴性组（P<0.05）,24 h 尿蛋白定量高于阴性组（P<0.05）。血清抗PLA2R抗体阳性组患者尿蛋白谱中尿白蛋白（A1b）/肌酐、总蛋白/肌酐和转铁蛋白/肌酐值均明显高于阴性组（P<0.05）;尿视黄醇结合蛋白（RBP）/肌酐、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）/肌酐、IgG/肌酐、α1微球蛋白（α1-MG）/肌酐、β2微球蛋白（β2-MG）/肌酐、胱抑素C/肌酐和纤维蛋白原降解产物（FDP）/肌酐与阴性组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。IMN患者24 h尿蛋白定量分别与尿A1b/肌酐（r=0.43, P=0.001）、尿总蛋白/肌酐（r=0.56,P=0.001）及尿转铁蛋白（TRF）/肌酐（r=0.46, P=0.00）呈正相关。结论 IMN患者血清抗PLA2R抗体阳性与阴性的尿蛋白谱存在差异,阳性患者的尿蛋白含量更高。     

治疗性人乳头瘤病毒16型疫苗的人参皂苷单体佐剂筛选研究

目的 研究不同人参皂苷单体佐剂对治疗性人乳头瘤病毒16型（human papillomavirus type 16,HPV16）重组疫苗免疫效果的影响,筛选合适的人参皂苷单体作为候选佐剂。方法 选择5种人参皂苷单体Rb1、Rh1-1、Rh1-2、Rg1、Rg3,分别与治疗性HPV16重组疫苗联合免疫C57BL/6小鼠,用酶联免疫斑点试验比较各组小鼠的特异性细胞免疫应答水平,同时比较这5种人参皂苷单体对治疗性HPV16重组疫苗抑制小鼠肿瘤生长的影响。结果 人参皂苷单体Rg1、Rb1可以显著提高治疗性HPV16重组疫苗特异性细胞免疫应答（HPV+Rg1组vs HPV组：t=3.729,P=0.006;HPV+Rb1组vs HPV组：t=3.204,P=0.013）,同时可以在小鼠特异性肿瘤模型建立4周时,有效抑制肿瘤的生长水平（HPV+Rg1组vs HPV组：t=2.318,P=0.032;HPV+Rb1组vs HPV组：t=2.258,P=0.037）。结论 人参皂苷单体Rg1、Rb1能在C57BL/6小鼠中提高治疗性HPV16重组疫苗的特异性免疫效果,有望成为候选佐剂。     

抗体阳性与抗体阴性的自身免疫性脑炎患者临床特征比较

目的 比较自身免疫性脑炎（AE）待查患者中,抗体阳性（确诊）的AE患者和抗体阴性（可能）的AE患者之间的临床特征及辅助检查差异。方法 回顾性分析2017年3月至2018年12月于中国科学技术大学附属第一医院诊断为AE待查的患者56例,所有患者的脑脊液和血清进行AE相关抗体[抗N-甲基-D-天冬氨酸受体抗体（NMDAR）、抗α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体抗体（AMPAR）、抗γ-氨基丁酸B受体抗体（GABA_BR）、抗富亮氨酸胶质瘤失活蛋白1抗体（LGI1）和抗接触素相关蛋白2抗体（CASPR2）]检测。根据抗体检测结果分为抗体阳性的AE患者和抗体阴性的AE患者,其中抗体阳性的AE患者31例,抗体阴性的AE患者25例。比较分析两组患者的临床特征和辅助检查结果的差异,以及疾病严重程度和治疗的差异。结果 31例抗体阳性的患者中,抗NMDA脑炎20例（65%）,抗GABA_BR脑炎9例（29%）,抗LGI1脑炎2例（6%）。抗体阴性的AE患者静脉滴注免疫球蛋白（IVIG）的使用率低于抗体阳性的AE组。两组患者的性别、年龄、前驱症状、神经系统症状、头颅磁共振表现、脑电图结果、脑脊液压力、脑脊液细胞数及脑脊液蛋白水平的差异均无统计学意义（P均>0.05）,两者的入住ICU率、最高mRS评分、出院日mRS评分差异无统计学意义（P均>0.05）。结论 AE患者中抗体阴性的并不少见,抗体阴性的AE患者临床表现与辅助检查跟抗体阳性的AE无显著性差异,对该类患者进行临床表现和辅助检查分析是必要的。     

组分百日咳疫苗安全性检测体外替代方法的应用和初步评价

目的：用一种组分百日咳疫苗残留毒性的体外替代检测方法，更稳定和客观地评价疫苗成品的生产一致性。方法：验证直接定性法和间接定量法2种中华仓鼠卵巢细胞簇集试验方法，分别对6个国内外厂家的10种组分百日咳疫苗产品毒性进行定量和定性检测，并使用百日咳毒素参考品将体外法与小鼠组胺致敏试验进行桥接和初步评价。结果：体外定量试验的灵敏度为0.0026±0.0003 IU·mL^-1，几何变异系数为13%，体外定性试验的灵敏度为0.0067±0.0016 IU·mL^-1，几何变异系数为24%，组胺致敏试验的灵敏度为3.3 IU·mL^-1；所有样品的体外定性结果均为阴性，小鼠组胺致敏试验结果均合格，体外定量结果与小鼠组胺致敏结果具有良好的相关性（r=0.737，P＜0.05）。结论：本研究在国内首次使用 CHO细胞簇集试验方法检测百日咳疫苗成品，并进行了初步评价。该方法灵敏度高于小鼠组胺致敏试验，可应用于百日咳疫苗毒性及毒性逆转检测。该方法需要更广泛的推广应用和数据积累，以达到完全替代动物实验的目标。     

肠道病毒71型灭活疫苗（Vero细胞）接种5年免疫持久性观察

目的 观察肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）疫苗III期临床试验接种5年的免疫持久性。方法 在III期临床试验免疫原性亚组中,对完成全程两针次免疫的免前抗EV71中和抗体阴性人群进行免疫后5年采血并检测抗EV71中和抗体,对0 d、56 d、8个月、14个月、26个月、64个月同时具有抗EV71中和抗体检测数据人群评价免疫持久性。结果 共614名受试者完成5年免疫持久性血样采集并获得中和抗体检测结果,其中490名受试者同时具有0天、56 d、8个月、14个月、26个月、64个月抗EV71中和抗体检测数据,疫苗组和安慰剂对照组分别为235名和255名。EV71疫苗免疫后5年,疫苗组抗EV71中和抗体阳性率（100.00%）和抗体几何平均滴度（geometric mean titer,GMT）（369.57）均高于对照组（69.02%和55.58）。分别以抗体滴度8、16、32为阳性判定标准,疫苗组阳性率（100%、99.57%、97.87%）均高于对照组（69.02%、61.96%、59.61%）。对不同年龄亚组进行分析,6~11、12~35月龄受试者免疫后疫苗组5年抗EV71中和抗体阳性（滴度≥8）率（均为100.00%）和抗体GMT（367.14、370.64）均高于对照组（66.67%、71.27%和53.43、63.66）。在EV71疫苗免疫后的各个时间点,疫苗组抗EV71中和抗体阳性率和GMT均高于对照组。结论 该EV71疫苗两针基础免疫后能够诱导良好的免疫原性,在免疫后5年依然保持较好的免疫持久性。     

Evaluation of Anti-PT Antibody Response after Pertussis Vaccination and Infection: The Importance of Both Quantity and Quality

Pertussis toxin (PT) is considered the main virulence factor causing whooping cough or pertussis. The protein is widely studied and its composition was revealed and sequenced already during the 1980s. The human immune system creates a good response against PT when measured in quantity. However, the serum anti-PT antibodies wane rapidly, and only a small amount of these antibodies are found a few years after vaccination/infection. Therefore, multiple approaches to study the functionality (quality) of these antibodies, e.g., avidity, neutralizing capacity, and epitope specificity, have been investigated. In addition, the long-term B cell memory (Bmem) to PT is crucial for good protection throughout life. In this review, we summarize the findings from functional PT antibody and Bmem studies. These results are discussed in line with the quantity of serum anti-PT antibodies. PT neutralizing antibodies and anti-PT antibodies with proper avidity are crucial for good protection against the disease, and certain epitopes have been identified to have multiple functions in the protection. Although PT-specific Bmem responses are detectable at least five years after vaccination, long-term surveillance is lacking. Variation of the natural boosting of circulating Bordetella pertussis in communities is an important confounding factor in these memory studies.     

抗H7N9流感病毒中和抗体快速检测方法的建立及应用

目的：对建立的抗H7N9流感病毒中和抗体快速检测方法进行方法学验证及初步应用。方法：分别采用不同代次细胞对高、中、低不同滴度的阳性血清进行多次平行检测,考察细胞代次对检验结果的影响;采用NIBSC提供的参考品对方法学的特异性进行验证;同时应用抗H7N9的阳性血清检测进一步评估方法的准确性和精密性;采用ELISA-MNT法和血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）试验分别接种H7N9灭活流感疫苗免疫的小鼠血清样本20份,分析两种方法检测结果的相关性。结果：采用ELISA-MNT中和法,使用不同代次MDCK细胞（25、30和35代）检测相同的血清样本的中和抗体滴度结果相同;该方法只对羊抗H7N9的血清具有较高保护力,对其他血清基本没有交叉反应;该方法准确性良好;该方法组间、组内精密性的平均变异系数分别为4%和11%。该方法测定H7N9型流感疫苗免疫后的小鼠血清抗体效价,其结果与HI抗体的相关系数为0.61,表明两种方法的检测结果之间呈良好的正相关性。结论：建立的微量病毒中和法能够满足H7N9流感病毒中和抗体效价检测的要求,可用于H7N9新型大流行流感疫苗的免疫评价。     

Enhancement of the immune responses of mice to <Emphasis Type="Italic">Bacillus anthracis</Emphasis> protective antigen by CIA07 combined with alum

Anthrax is an acute zoonotic disease caused by infection with Bacillus anthracis. B. anthracis spores are highly resistant to environmental degradation and are used as a biological weapon. In this study, we investigated the adjuvant activity of CIA07 to anthrax protective antigen (PA). A/J mice were immunized intraperitoneally once, or twice with a 4-week interval, with recombinant PA alone or combined with alum, CpG1826, or CIA07 as adjuvant, and serum anti-PA IgG antibody responses were measured 4 weeks after each immunization. All three adjuvants significantly enhanced anti-PA IgG antibody titer 4 weeks after the priming and boosting immunizations, and alum gave the highest titer. In order to evaluate the adjuvant activity of CIA07 in the presence of alum, Balb/c mice were immunized 3 times at 1-week intervals with PA in combination with alum, CIA07 or alum plus CIA07, and the immune responses were assessed 2 weeks after the third immunization. The serum anti-PA IgG antibody titer of the CIA07-treated group was 14-fold higher than the group given PA alone, and the coadministration of CIA07 with alum further increased the titer 3.5-fold (P < 0.05). The toxin neutralizing activity of the sera from the mice given the combination of CIA07 and alum was 109-times higher than the animals given PA alone. The mice given CIA07 plus alum also showed a marked increase in the number of IFN-γ-, IL-2-, and IL-4-producing CD4⁺ T cells among their splenocytes. These data suggest the potential of CIA07 in combination with alum as an adjuvant for the development of a potent anthrax vaccine.     

无细胞百日咳疫苗特异性毒性检测方法现状及展望

 百日咳毒素是百日咳杆菌重要的保护性抗原,经化学方法脱毒成为百日咳类毒素后制成的无细胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine,APV）具有残余毒性和毒性逆转的可能性,所以建立特异性毒性检测方法对于保证APV的安全性是十分必要的。此文就国内外APV特异性毒性检测方法的现状做一综述,并结合近几年国外研究的毒性检测新方法进行展望。     

Comparisons of immunization records between a community pharmacy,a regional registry,and a health system

Objectives

To compare the completeness of immunization records for 6 vaccines between a community pharmacy database, a regional immunization information system (IIS), and a health system’s electronic health record (EHR).

安徽省2011年0～6岁儿童抗百日咳毒素抗体水平监测

 目的  了解安徽省≤6岁健康儿童抗百日咳毒素（pertussis toxin,PT）抗体水平,为评价疫苗接种效果提供依据。 方法   采用多阶段随机抽样方法,在全省16个市0～6岁7个年龄组人群中抽取健康儿童1 787人,用ELISA定量检测血清抗PT IgG抗体。各组之间抗体阳性率差异比较采用χ²检验,抗体几何平均浓度（GMC）差异比较采用F检验。结果   2011年安徽省0～6岁儿童中,几乎所有采集的血清均呈现不同的抗体水平,以0岁组最高（10.33 IU/ml）。抗体GMC随免疫后时间的延长有下降的趋势。不同年龄组之间抗体阳性率和GMC差异均有统计学意义（χ²=15.06,P＜0.05;F=7.96,P＜0.01）。不同性别之间抗体阳性率和GMC差异均无统计学意义（χ²=0.98,P＞0.05;Z=0.852,P=0.394）。 结论   安徽省0～6岁儿童抗PT IgG抗体水平随年龄的增加而降低,是否需要加强免疫需作进一步研究。     

表达甲型H1N1流感病毒血凝素抗原的DNA疫苗构建及其免疫原性评价

目的 构建表达甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)抗原的DNA疫苗,并在小鼠中测试其免疫原性.方法 运用人密码子优化技术合成甲型H1N1流感病毒HA序列,并转移至DNA疫苗载体,用Western blotting检测其表达效率.采用单纯随机抽样方法把BALB/c小鼠分成DNA疫苗组和对照组.用...     

检测百日咳毒素的双抗体夹心ELISA法的建立

目的  建立白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产中百日咳毒素（pertussis toxin, PT）含量的测定方法。方法  免疫家兔制备高效价抗PT血清,纯化抗PT多克隆抗体并进行酶标记,建立双抗体夹心ELISA法并对其进行验证。结果  建立的方法在0~20 ng/ml PT测量区间呈现最佳线性,相关系数＞0.99,且重复性好。检测百日咳丝状血凝素和黏着素,结果均为阴性,说明该法特异性良好。试验内10次、不同试验间3次测定16.0、8.0、4.0、3.0 ng/ml PT,变异系数为2.8%~9.7%,回收率为95.7%~106.0%,精密度和准确度验证均符合常规质量控制要求,定量限度为3.0 ng/ml。结论  该方法能有效检测百日咳杆菌大罐发酵过程中分泌的PT,为PT质量控制奠定了重要基础。     

Generation and characterization of the human neutralizing antibody fragment Fab091 against rabies virus

Aim:

To transform the human anti-rabies virus glycoprotein (anti-RABVG) single-chain variable fragment (scFv) into a Fab fragment and to analyze its immunological activity.

Methods:

The Fab gene was amplified using overlap PCR and inserted into the vector pComb3XSS. The recombinant vector was then transformed into E coli Top10F'' for expression and purification. The purified Fab was characterized using SDS-PAGE, Western blotting, indirect ELISA, competitive ELISA, and the fluorescent antibody virus neutralization test (FAVN), respectively, and examined in a Kunming mouse challenge model in vivo.

Results:

A recombinant vector was constructed. The Fab was expressed in soluble form in E coli Top10F''. Specific binding of the Fab to rabies virus was confirmed by indirect ELISA and immunoprecipitation (IP). The neutralizing antibody titer of Fab was 10.26 IU/mL. The mouse group treated with both vaccine and human rabies immunoglobulin (HRIG)/Fab091 (32 IU/kg) showed protection against rabies, compared with the control group (P<0.05, Logrank test).

Conclusion:

The antibody fragment Fab was shown to be a neutralizing antibody against RABVG. It can be used together with other monoclonal antibodies for post-exposure prophylaxis of rabies virus in future studies.