丝氨酸代谢在脐带血红系细胞增殖过程中的作用研究

目的 通过探索氨基酸代谢对红系细胞体外扩增的影响,为提高脐带血红系细胞体外扩增的效率以制备大量的红系细胞奠定基础.方法 高效液相色谱法(HPLC)测定脐血单个核细胞(MNC)中造血细胞向红系细胞分化及增殖过程中培养基内氨基酸的消耗情况,筛选出消耗多的氨基酸;进一步选择人脐带血来源的红系祖细胞系(HUDEP-2)作为研究对象,对其培养体系进行特定氨基酸的缺乏与补加,通过细胞计数、EdU掺入实验结合流式细胞术等方法分析特定氨基酸在红系细胞扩增过程中的作用;向红系培养体系中添加特定氨基酸代谢的抑制剂,进一步评价该氨基酸代谢在红系细胞扩增过程中的作用.结果 HPLC法检测发现,红系细胞定向分化及增殖过程中丝氨酸的消耗最为显著.在缺乏丝氨酸的培养体系中,红系祖细胞系HUDEP-2的增殖与存活受到明显抑制,但丝氨酸的缺乏并不影响HUDEP-2细胞表面红系细胞特征蛋白的表达.向红系培养基中添加丝氨酸分解代谢的关键酶抑制剂——丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)抑制剂SHIN1后,发现SHIN1明显抑制HUDEP-2的增殖与存活.结论 丝氨酸是维持红系细胞增殖能力的关键氨基酸,其分解代谢产生的一碳单位可能是红系细胞增殖所必需的,该结果为体外进一步提高脐带血红系细胞的扩增效率提供了实验依据.     

黄芪甲甙对60Co辐射小鼠外周血细胞和骨髓三系细胞的影响

目的：探讨黄芪甲甙^60Co辐射小鼠外周血细胞和骨髓造血细胞的作用,了解其作用途径。方法：采用6．0Gy ^60Co辐射小鼠造成严重造血功能损伤,尾静脉采血计数外周血细胞及其分类,取一侧股骨骨髓计数骨髓有核细胞．取另侧骨髓制片,观察计数骨髓粒系分裂池,成熟池,贮存池骨髓细胞绝对值的动态变化。结果：黄芪甲甙对辐射损伤细胞与骨髓造血细胞有一定保护作用,使损伤脾细胞向正常逆转,加速粒细胞增殖与动员作用,促进成熟池粒细胞成熟进入贮存池．从而进入到外周血循环,对淋巴细胞有激活作用。结论：黄芪甲甙对粒细胞和淋巴细胞有促进增殖作用。     

Ox-LDL诱导人肾小球系膜细胞凋亡在慢性肾炎中的作用

目的 :探讨氧化低密度脂蛋白 (Ox-LDL)诱导肾小球系膜细胞凋亡的调控机制及其在慢性肾炎中的作用。方法 :通过人肾小球系膜细胞体外培养 ,采用原位末端标记和DNA凝胶电泳检测低浓度的Ox -LDL (0、 2 5、 5 0、10 0 μg/ml)对系膜细胞凋亡的影响 ,免疫组化维生素E干预前后Ox-LDL对系膜细胞Bax/Bcl- 2表达的影响 ;按血浆LDL水平 ,把有不同程度肾小球硬化的慢性肾炎患者肾标本分为LDL正常组和LDL升高组 ,分别采用DNA原位末端标记和免疫组化 ,检测肾小球细胞凋亡及Bax/Bcl- 2蛋白表达。结果 :低浓度Ox-LDL (0～ 10 0 μg/ml)以剂量依赖方式促进肾小球系膜细胞凋亡 ,并使肾小球系膜细胞Bax的蛋白表达呈时间 -剂量依赖性增加 ,P <0 0 1,Bcl- 2的蛋白表达轻度升高后呈时间 -剂量依赖性下降 ,P <0 0 1,导致Bax/Bcl- 2比值增大 ;维生素E干预后这种变化不明显 ,P >0 0 5。LDL升高组肾小球凋亡和Bax蛋白表达明显增加 ,P <0 0 1;Bcl- 2变化不明显 ,P >0 0 5 ,血LDL水平与肾小球硬化指数、凋亡指数、Bax/Bcl- 2比值有显著正相关关系。结论 :Ox -LDL能诱导肾小球系膜细胞凋亡 ;Bax/Bcl- 2比值上升可能是Ox -LDL诱导肾小球系膜细胞凋亡的重要机制 ;脂质异常可能是导致肾小球硬化中细胞减少的重要原因     

TPO基因修饰的基质细胞对巨核系细胞的定向扩增作用

目的研究TPO基因修饰的基质细胞对CD34+造血细胞向巨核系细胞定向增殖分化的影响.方法将TPO cDNA构建到pBabe/pura中,通过"乒乓转染法"获得产高滴度逆转录病毒载体的包装细胞;利用所获的病毒上清转染基质细胞HFCL,用Northern blot检测细胞中TPO基因的表达,并利用TPO依赖株检测上清中的TPO活性;以未转基因的HFCL为对照,将CD34+造血细胞在TPO基因修饰的HFCL支持下扩增,用流式细胞仪检测扩增细胞中表型为CD34+CD41+和表型为CD41-CD61+细胞的比例.结果基质细胞HFCL能够有效表达外源性TPO基因,在HFCL/TPO培养上清中有0 75 ng/ml水平的TPO活性;并且在HFCL/TPO支持下,CD34+造血细胞经过7 d扩增后,CD34+CD41+细胞的比例为(13.7±2.0)%,HFCL为(6.5±1.8)%(P＜0.01);CD41+CD61+细胞的比例为(11.9±0.7)%,略高于HFCL的(10.6±1.5)%(P＞0.05).结论基质细胞能够有效表达外源性TPO基因和其蛋白,而且TPO基因修饰的基质细胞能显著促进CD34+CD41+巨核祖细胞的扩增,但对较成熟的CD41+CD61+巨核细胞影响不明显.     

诱导K562细胞向红系分化的中药血清药理学方法探讨

目的对K562细胞向红系分化的中药血清药理学方法进行探讨。方法以K562细胞为体外模型,采用联苯胺定性技术检测细胞内血红蛋白,比较不同条件下的含药血清诱导K562细胞前后的阳性率;测量波长为414的A值。结果10％的含药血清培养诱导K562细胞向红系分化的作用最强;灭活血清对：K562细胞向红系分化的诱导作用强于未灭活血清;大鼠qd连续7d和bid连续3d,2种方法所得血清均以10％的浓度培养K562细胞,二者诱导其向红系分化的作用无明显差异;临床等效剂量ig所得血清比2倍、4倍剂量要好。结论含药血清的制备和含药血清在体外的合理应用对实验结果有很大的影响。     

Cimetidine对小鼠低氧条件下红系造血增强的抑制作用

本实验以组按H_2受体拮抗剂甲氰咪胍(Cimetidine)处理低压(0.5大气压)条件下生活的LACA小鼠。观察到:低氧两周后外周RBC数、PCV、Hb骨髓CFU-E数和BFU-E数明显增多,且CFU-E和BFU-E集落较大(集落直径为正常对照的3～5倍,资料未录入);外周血WBC数及骨髓CFU-GM数明显减少。CFU-S向红系分化明显增多,向巨核系、粒系分化明显减少。低氧小鼠同时给予Cimetidine两周后与低氧对照组比较,外周血RBC数、PCV、Hb、CFU-E数、BFU-E数均明显减少。外周血WBC数和Pt数在Cimetidine低剂量组(1mg/天)升高,但随着剂量的增加又有降低趋势(无统计学意义)。Cimetidine使CFU-GM数较低氧对照组明显增多,但随着剂量的增加CFU-GM增多的幅度逐渐减少。高浓度的Cimetidine(2-4mg/天)使CFU-S数较低氧对照组明显减少。CFU-S在Gmetidine的作用下向红系分化明显减少。而向粒系和巨核系的分化相对增多。     

小剂量X射线照射对人树突状细胞抗原递呈及白介素-12分泌的影响

目的 探讨小剂量x射线照射对体外不同培养时间的人外周血树突状细胞( dendritic cell,DC)抗原递呈及白介素-12(IL-12)分泌的影响.方法 分离人外周血单个核细胞(PBMC),以人粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)及IL-4等诱导分化成DC.实验分为3组,A组:DC培养至第2天接受X射线照射;B组:DC培养至第6天接受X射线照射,A、B组受照剂量均为0.05、0.1、0.2和0.5 Gy;C组:即对照组,为同期培养的未受X射线照射的DC细胞.各组DC培养至第8天时,以DC致敏T 细胞,CCK-8( cell counting kit-8)法检测混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR),以评估抗原递呈能力;MTT法检测致敏T细胞杀伤人肺腺癌A549细胞;酶联免疫吸附试验( ELISA)检测DC细胞培养液中IL-12水平.结果 0.2、0.5 Gy照射后的DC抗原递呈能力,A组显著低于对照组(t =2.79和3.71,P＜0.05),B组显著高于对照组(t=3.60和3.11,P＜0.05);检测致敏T细胞对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制能力,与对照组相比,A组抑制A549增殖能力减弱(t =2.89和2.91,P＜0.05),B组抑制A549增殖能力明显增强(t=2.91和2.82,P＜0.05);A组IL-12分泌量下降(t=4.44和6.93,P＜0.05),而B组明显上升(t=3.51和4.12,P＜0.05).结论 DC在培养早期阶段接受0.5 Gy以下的X射线照射,会降低抗原递呈能力及致敏T细胞杀伤A549能力,在培养阶段的后期给予此剂量照射则会增强.     

胸腺素组份5对小鼠造血干细胞的作用

实验采用超滤技术提纯的小牛胸腺素组份5(THF_5),对日龄50～60天、体重22～24g的瑞士纯种正常或照射小鼠,连续腹腔注射50、100、150μg,7和14天后,测造血干细胞(CFU-S)、粒系造血祖系细胞(CFU-C)及骨髓有核细胞。实验证明,THF_5不论对正常或照射小鼠的造血干细胞均有增殖作用,而且在一定范围内,给药剂量和CFU-S、cFU-C呈正相关。THF_5对850rad照射小鼠可提高活存率15～30％,与造血干细胞的变化是一致的。说明THF_5能促进受照射小鼠残存干细胞的增殖分化。     

高剂量白细胞介素Ⅰ对白细胞迁移的作用

为探讨高剂量自细胞介素I(IL-1)对白细胞迁移的影响,应用活体显微技术进行了观察研究。结果显示高剂量IL-1(0.5mg/kg)肌注后可导致外周血白细胞迅速减少,3h时变化最显著,6h后恢复正常。显微电视系统观察到IL-1腹腔注射后白细胞附壁滚动数及白细胞与内皮细胞粘附数均迅速增加,这一结果表明高剂量IL-1在体内明显促进白细胞与内皮细胞的粘附,导致外周血白细胞减少。     

HDAC2介导低氧促红系分化作用

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)在低氧对人慢性髓系白血病K562细胞向红系分化中的作用.方法 K562细胞在氯化血红素诱导后分别经过低氧(1％O2,Hyp组)或常氧(20％O2,Nor组)处理后,联苯胺染色观察血红蛋白(Hb)阳性细胞率的改变,流式细胞仪检测CD235a+/CD71+细胞率的差异,Western印迹和实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测HDAC2和红系标记分子CD235a、γ-珠蛋白(γ-globin)在蛋白和mRNA水平的表达变化;最后使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)处理细胞,并用shRNA敲低HDAC2表达后评价低氧下K562细胞向红系分化的改变.结果 低氧能促进K562细胞向红系分化,并上调细胞中HDAC2的表达;抑制HDAC2活性或敲低HDAC2表达后,血红蛋白阳性细胞数减少,CD235a+/CD71+细胞的百分比降低,CD235a和γ-珠蛋白的表达也显著下降.结论 低氧能上调HDAC2表达并通过HDAC2介导K562细胞向红系分化.     

黄芪不同提取物对K562细胞向红系分化的诱导作用研究

目的探讨黄芪不同提取物对K562细胞向红系分化的影响。方法用超声醇提水提法从黄芪根中获取富含黄芪总苷(AST)的醇溶部分和富含黄芪多糖(APS)的水溶部分并分别作用于K562细胞,联苯胺染色法观察K562细胞向红系分化的情况,MTT法测定细胞活性。以丁酸钠(BA)处理的K562细胞作为阳性对照。结果以不同浓度(1、2、4、8mg/ml)APS作用于K562细胞后显示其有诱导后者向红系分化的作用,以4mg/ml为最适浓度,而AST诱导作用不明显。4mg/ml APS、AST及0.5mmol/L BA作用后K562细胞的联苯胺染色阳性率(BZ%)峰值分别为13.2%、2.9%及17.5%。以4mg/ml APS作用于K562细胞24、48、72h后,其BZ%显著低于同时点BA组(P<0.01),但72、96h的联苯胺染色阳性细胞总数明显高于BA组(P<0.01)。MTT测定结果显示,APS、AST对K562细胞的生长无明显抑制作用,而BA对细胞生长有明显抑制作用(P<0.01)。结论黄芪可诱导K562细胞向红系分化,其有效成分在富含多糖的水溶部分(APS),以4mg/ml浓度的诱导作用最强。黄芪提取物对K562细胞的生长无明显抑制作用。     

小鼠血清中的粒系造血活性及其照后改变

利用体外半固体琼脂培养骨髓粒单系粗细胞的方法测定小鼠血清粒系造血活性，经８Ｇｙγ射线照射后４天粒系刺激活性趋于降低；照后７－１０天，显示一定程度的升高，为正常血清的１４０％左右；第１４天呈下降趋势。经３，５，７，９Ｇｙ不同剂量照射后，血清中的粒系造血活性随照射剂量的增加而增高，９Ｇｙ照射组最高，照后第７天可为正常的２００％以上，照后１２天时小鼠中的粒系造血刺激活性仍高于正常血清。     

高原红细胞增多症骨髓前红系祖细胞体外培养动态观察

目的:对高原红细胞增多症(HAPC)骨髓前红系祖细胞(BFU—E)进行动态观察,以探讨其发病机理。方法:应用造血干细胞体外培养技术,取其体系内含单个核细胞2×10~5/ml置于培养液中,在5％CO_2、37℃及饱和湿度条件下培养,以观察其细胞生长情况。结果:红系祖细胞接种及增殖延滞时间为24h后,可见双细胞及少数4～6个细胞组成的细胞团。第4天可见10个左右细胞的细胞团,第6～7天可见较多CFU—E集落,第9天CFU—E集落数量明显减少,第10天可见较大或多中心的集落。呈桔黄色或颜色逐渐加深,以50～100个细胞的爆式集落为多见,联苯胺染色阳性,呈棕褐色,第14天可见较多较大的爆式集落含100～1000个左右细胞,培养至21d,BFU—E集落多数退化或消失。结论:观察中发现HAPC骨髓BFU—E集落产率与正常对照比较有显著差异(P<0.01),集落类型以多中心型,分散型为主。提示,HAPC骨髓BFU—E具有很强的增殖、分化能力,其机理需要进一步探讨。     

流式细胞术在血小板因子4保护环磷酰胺损伤小鼠骨髓中的应用价值

 目的 探讨流式细胞术在研究血小板因子4(PF 4)保护环磷酰胺(CTX)损伤小鼠骨髓造血细胞中的应用价值。方法 腹腔一次性注射CTX 200mg／kg,造成药物损伤模型。给CTX前予以PF 4预处理,于给药后第5天、第8天分别用流式细胞仪测定骨髓有核细胞DNA含量及细胞周期变化。结果 第5天PF 4保护组的骨髓有核细胞中,G0／G1期细胞百分率较CTX组明显提高,坏死、凋亡率下降(P＜0.01),而与对照组基本相同(P＞0.05)。第8天各组间比较无明显差异(P＞0.05)。结论PF 4对CTX损伤的小鼠骨髓造血细胞有保护作用。通过流式细胞仪测定DNA含量及细胞周期变化可阐明其化疗保护作用机制,表明流式细胞术具有重要的应用价值。     

造血干细胞的竞争性分化在照后白细胞减少中的作用

LACA小鼠经5 Gyγ线全身照射后l～4天腹腔注射经分离,洗涤和浓集的红细胞(供血鼠预先照射8.5Gyγ线)。其血红蛋白含量上升到正常对照的140.4%。照后20天骨髓CFU-E含量比照射对照组低4倍。虽然其红系造血受到明显抑制,但其骨髓CFU-S,CFU-GM及外周血粒细胞数分别比照射对照组高28、80.3和97.6‰。结果表明,小鼠受照后,存在造血干细胞的竞争性分化,向红系统分化占优势。多血通过反馈机制改变了干细胞的分化方向,使之多向粒系统分化.从而增加了外周血粒细胞数置。本文报告的结果表明照后造血干细胞的竞争性分化及向红系分化占优势是外周血白细胞数量减少的原因之一。     

用单克隆抗体所检测的一细胞成熟相关抗原

本文报道-IgM单克隆抗体F3所识别的细胞成熟相关抗原.经放免及间接免疫荧光对不同细胞及上皮组织测定表明,F3抗原主要分布于成熟上皮细胞及粒系细胞.用1.2%二甲基亚砜诱导下咽癌细胞系FADU及粒系细胞HL-606天后,两种细胞对F3抗原表达量明显增加,F3阳性细胞百分数也增加.实验结果表明,F3抗原作为细胞成熟相关标志,可用于细胞诱导分化的研究中.     

肾康注射液对高糖培养系膜细胞肥大的影响

目的：观察肾康注射液对高糖培养系膜细胞肥大的影响.方法：将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分为空白对照组、甘露醇组、高糖组、高糖＋缬沙坦组及高糖＋肾康注射液高、中、低剂量组.应用流式细胞术观察细胞大小、周期分布,用[3H]胸腺嘧啶核苷（[3H]TdR）及[3H]亮氨酸（[3H]Leu）掺入法反映细胞DNA及蛋白质合成情况.结果：高糖组系膜细胞G1期比例增高,G2期、S期比例下降,蛋白质合成增加,DNA合成减少,细胞体积增大;肾康注射液组与高糖组比较,细胞周期分布趋于正常,蛋白质合成减少,DNA合成增加,细胞体积减小.结论：肾康注射液可抑制高糖培养系膜细胞的肥大反应.     

Lovastatin对人粒系白血病细胞增殖和细胞周期的影响

目的:观察洛伐他汀(lovastatin,LOV)对体外培养的人粒系白血病细胞株HL-60增殖和细胞周期的影响.方法:采用生长曲线测定、MTT检测、流式细胞仪分析等实验技术.结果:LOV对HL-60细胞有增殖抑制作用,能使细胞周期阻滞于G0/G1期,该作用呈剂量-效应和时间依赖关系.结论:LOV能抑制HL-60细胞的增殖,同时影响该细胞的细胞周期进程.     

HS6101不同时间给药对环磷酰胺所致小鼠造血功能损伤的恢复作用

目的 探讨HS6101(6101)不同时间给药对环磷酰胺(CTX)致小鼠造血功能损伤的恢复作用.方法 103只5～6周龄雄性ICR小鼠,分为CTX对照组、6101预防组、6101治疗组、6101预防+治疗组共4组.CTX损伤小鼠建模方法为腹腔注射CTX 100mg/kg,1次/d,连续注射3d.6101给药剂量为27μg/只,单次皮下注射0.2ml.6101预防组给药时间为CTX首次注射前1h,6101治疗组给药时间为CTX末次注射后1h,6101预防+治疗组给药时间为CTX首次注射前1h+CTX末次注射后1h,CTX对照组注射生理盐水0.2ml/只.分别于CTX首次注射前1d和注射后3、5、7、9、11、13、15、17d取尾静脉血10μl检测血常规,比较6101各给药组与CTX对照组间的差异.另取30只雄性ICR小鼠,在上述分组基础上增加正常对照组,6只/组,建模与给药方法同上,各组分别于CTX首次注射后4、9d处死3只小鼠,取左侧股骨分离单个核细胞进行骨髓造血祖细胞集落培养,取右侧股骨做常规病理组织学观察.结果 腹腔注射CTX后小鼠外周白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、红细胞和血小板数均迅速减少.6101预防组小鼠外周血白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数最低值明显高于CTX对照组,且其第3天的检测值高于6101治疗组及6101预防+治疗组;6101预防组外周血红细胞在第3、5、7天均明显高于CTX对照组,第3天高于6101治疗组和6101预防+治疗组;6101预防组血小板数第3天时明显高于其他3组,而6101治疗组与6101预防+治疗组则明显低于CTX对照组,血小板开始恢复后6101预防给药促恢复作用更明显.第4天和第9天的骨髓造血细胞集落培养结果显示,6101预防组、治疗组和预防+治疗组的粒巨噬系、巨核系、爆式红系和红系细胞集落数均高于CTX组;第4天骨髓病理组织学观察结果也表明6101各给药组小鼠骨髓组织结构优于CTX对照组.实验中6101治疗组和预防+治疗组小鼠出现死亡(分别为3/18、9/18),可能与其早期血小板数显著降低有关,提示6101不宜在CTX注射后给药.结论 6101于CTX注射前1h给药可明显促进CTX所致ICR小鼠造血功能损伤的恢复.     

骨髓血窦结构与实质细胞的关系

本文对6.25戈瑞全身照射后大鼠的骨髓有核细胞,外周血白细胞总数和股骨骨髓组织形态学进行了平行观察。结果表明,实质细胞的损伤和恢复与骨髓血窦结构的破坏和修复有密切的依赖关系,照后3天,血窦结构严重破坏,骨髓有核细胞和外周血白细胞数亦降到最低值。照后7天,大部分血窦结构已修复,髓腔内出现了再生的造血细胞灶,骨髓有核细胞和外周血白细胞数也开始回升。骨髓血窦修复较再生的造血细胞灶的出现早4天,骨髓有核细胞和外周血白细胞数恢复到照前水平分别在血窦完全修复后7和14天。骨髓血窦结构的破坏和修复是加重实质细胞的损伤和促进其恢复的重要因素之一。