黄芪的含药血清诱导K562细胞表达^Gγ-mRNA和合成HbF

目的研究黄芪对K562细胞的^Gγ-珠蛋白基因表达的作用。方法以K562细胞为体外模型，用联苯胺染色方法来确定黄芪的含药血清诱导K562细胞向红系分化的作用；用RT—PCR方法研究黄芪的含药血清诱导K562细胞^Gγ-珠蛋白mRNA的表达；用Western Blot方法研究黄芪的含药血清诱导K562细胞HbF的合成。结果黄芪的含药血清作用于K562细胞5d后联苯胺染色阳性率达19．8％；同时伴有^Gγ-珠蛋白mRNA的表达的增加（最高可达3．6倍）和HbF的合成的增加，与丁酸钠组比较，黄芪组诱导K562细胞^Gγ-珠蛋白基因mRNA的表达可以持续3～5d，而丁酸钠组只有1d。结论黄芪有望成为一种有效的γ蛋白基因诱导剂。     

黄芪不同提取物对K562细胞向红系分化的诱导作用研究

目的探讨黄芪不同提取物对K562细胞向红系分化的影响。方法用超声醇提水提法从黄芪根中获取富含黄芪总苷(AST)的醇溶部分和富含黄芪多糖(APS)的水溶部分并分别作用于K562细胞,联苯胺染色法观察K562细胞向红系分化的情况,MTT法测定细胞活性。以丁酸钠(BA)处理的K562细胞作为阳性对照。结果以不同浓度(1、2、4、8mg/ml)APS作用于K562细胞后显示其有诱导后者向红系分化的作用,以4mg/ml为最适浓度,而AST诱导作用不明显。4mg/ml APS、AST及0.5mmol/L BA作用后K562细胞的联苯胺染色阳性率(BZ%)峰值分别为13.2%、2.9%及17.5%。以4mg/ml APS作用于K562细胞24、48、72h后,其BZ%显著低于同时点BA组(P<0.01),但72、96h的联苯胺染色阳性细胞总数明显高于BA组(P<0.01)。MTT测定结果显示,APS、AST对K562细胞的生长无明显抑制作用,而BA对细胞生长有明显抑制作用(P<0.01)。结论黄芪可诱导K562细胞向红系分化,其有效成分在富含多糖的水溶部分(APS),以4mg/ml浓度的诱导作用最强。黄芪提取物对K562细胞的生长无明显抑制作用。     

人胚胎干细胞定向诱导分化为红细胞及其生物学特性的研究

目的 探讨人胚胎干细胞(hESC)体外诱导制备成熟红细胞的潜能.方法 通过三阶段方案诱导hESC向红细胞分化,并通过流式细胞术检测造血干/祖细胞及红细胞表面标志物的变化,通过细胞染色和形态学分析判断红细胞的成熟程度;用实时定量PCR(qRT-PCR)分析不同时间点关键调控基因和珠蛋白链的表达,并以高效液相色谱法(HPLC)检测诱导所得红细胞(cRBC)不同珠蛋白链的表达量;应用血氧分析仪对诱导所得红细胞的血红蛋白(cRBC-Hb)进行功能分析.结果 定向诱导可获得CD235/CD71双阳性>80％的红细胞,细胞具有红系细胞形态和携氧能力,但hESC诱导获得的cRBC中β类珠蛋白的表达以γ-珠蛋白为主,cRBC-Hb氧饱和度为50％时的氧分压(P50)也低于成人Hb标准品检测值.实时定量PCR检测发现,伴随诱导过程胚胎干细胞干性基因表达迅速下调,与造血干细胞自我更新、增殖、分化相关基因SCF、HOXB4、Notch-1、Runx1、WNT5、PU.1和SCL,以及红系定向分化调控基因EPOR、EKLF、GATA1和MYB阶段性开启表达,但调控成人型β-珠蛋白表达的EKLF和BCL11A在诱导结束阶段处于较低的表达水平.结论 hESC在体外能向红系诱导分化,关键调控基因程序化地表达,hESC具有体外制备功能红细胞的潜能,但现有的诱导体系获得的cRBC类似于胎儿红细胞.     

诱导K562细胞向红系分化的中药血清药理学方法探讨

目的对K562细胞向红系分化的中药血清药理学方法进行探讨。方法以K562细胞为体外模型,采用联苯胺定性技术检测细胞内血红蛋白,比较不同条件下的含药血清诱导K562细胞前后的阳性率;测量波长为414的A值。结果10％的含药血清培养诱导K562细胞向红系分化的作用最强;灭活血清对：K562细胞向红系分化的诱导作用强于未灭活血清;大鼠qd连续7d和bid连续3d,2种方法所得血清均以10％的浓度培养K562细胞,二者诱导其向红系分化的作用无明显差异;临床等效剂量ig所得血清比2倍、4倍剂量要好。结论含药血清的制备和含药血清在体外的合理应用对实验结果有很大的影响。     

人THAP11基因RNAi慢病毒表达系统的建立

目的构建人THAP11基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,制备高滴度病毒颗粒,敲低K562细胞和脐带血CD34＋细胞中THAP11表达。方法采用第三代慢病毒包装系统,将含有特异性干涉THAP11的DNA序列克隆入穿梭质粒pSicoR中,构建siTHAP11-pSicoR质粒。在脂质体介导下,siTHAP11-pSicoR与包装质粒pLP1,pLP2,pLP/VSVG共转染HEK293T细胞,获得高滴度慢病毒颗粒。感染K562细胞,检测内源THAP11敲低效果。感染人CD34＋细胞,流式分选GFP阳性细胞,检测原代细胞中THAP11的敲低效果。结果成功构建针对THAP11两个位点的RNAi慢病毒载体siTHAP11-1和siTHAP11-2并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达1.8×108TU/ml。感染K562细胞后建立稳定株,THAP11的蛋白水平和mRNA水平均有下调。感染CD34＋细胞效率达30%以上,siT-HAP11-1可下调THAP11mRNA约80%,siTHAP11-2约下调85%。结论成功构建THAP11的RNAi慢病毒载体,包装后的病毒颗粒可有效敲低细胞株及原代细胞中内源性THAP11的表达,为后续研究THAP11对CD34＋细胞的影响奠定基础。     

高压氧与甲基强的松龙对不同种系皮片移植小鼠脾T淋巴细胞及其粘附分子表达的影响

目的　探讨高压氧 (HBO)与甲基强的松龙对皮肤移植小鼠脾淋巴细胞 CD3、CD4、CD8及CD4、CD8阳性细胞粘附分子 CD1 1 a、CD1 8表达的影响。方法　不同系小鼠移植皮片后 ,分别在 99.2 %O2 0 .2 5 MPa的 HBO舱内每天暴露 1.5 h和 (或 )腹腔内每天注射甲基强的松龙 0 .3ml,14d后用流式细胞仪检测脾淋巴细胞 CD3、CD4、CD8阳性细胞百分率以及 CD4、CD8阳性细胞上粘附分子 CD1 1 a、CD1 8的表达情况。结果　 1.HBO组、甲基强的松龙组、HBO 甲基强的松龙组 CD3、CD4、CD8阳性细胞百分率均较正常对照组明显下降 (P<0 .0 1) ;CD4、CD8阳性细胞上粘附分子 CD1 1 a、CD1 8阳性细胞百分率较正常对照组明显下降 (P<0 .0 1)。 2 .HBO组 CD 3、CD 4 、CD 8、CD 4 / CD 1 1 a、CD 4 / CD 1 8、CD 8/ CD 1 1 a和 CD 8/CD 1 8细胞百分率较甲基强的松龙组明显降低 (P<0 .0 5 )。3.HBO 甲基强的松龙组 CD3、CD4、CD8阳性细胞百分率及其 CD4、CD8阳性细胞上粘附分子 CD1 1 a、CD1 8的表达较 HBO组和甲基强的松龙组明显降低 (P<0 .0 1～ 0 .0 5 )。结论　 HBO与甲基强的松龙均可明显抑制 T细胞亚群及其粘附分子的表达 ,且两者具有协同作用。     

RNA干扰组蛋白去乙酰化酶1对人胰腺癌细胞增殖、凋亡的调控机制研究

目的观察沉默组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖、凋亡的影响及可能机制。方法胰腺癌PaTu8988细胞株分为空白对照组(不予任何处理)、阴性对照siRNA组(予以30nmol/L阴性siRNA)、siRNA1组(予以15nmol/LHDAC1siRNA)和siRNA2组(予以30nmol/LHDAC1siRNA)。siRNA转染48h后,用相对实时定量RT-PCR法和West-ernblotting检测HDAC1基因表达情况;相对实时定量RT-PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因p21、Bcl-2、Bax的表达;WST-8法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡变化。结果转染HDAC1siRNA48h后人胰腺癌PaTu8988细胞中HDAC1mRNA表达量在siRNA1组和siRNA2组分别为46.1%±6.1%和32.3%±1.4%,均显著低于空白对照组(100.0%±3.4%)和阴性对照siRNA组(87.4%±28.3%,P<0.05)。Westernblotting显示HDAC1蛋白表达量亦明显下降,以siRNA2组表达量最低(P<0.05)。WST-8法检测显示4组细...     

人脐带间充质干细胞来源的外泌体免疫调节功能异质性研究

目的 研究不同供者来源的人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)分泌的外泌体免疫调节能力的异质性.方法 培养5株不同供者来源的hUC-MSC,收集无血清培养上清提取外泌体,流式细胞术检测其表面特异性标志CD9、CD63、CD81、CD44的表达,BCA法测定总蛋白含量.将外泌体和脐带血单个核细胞(UBMC)共培养72 h,MTT实验检测细胞增殖活性, ELISA测定共培养上清中干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量.离心重悬UBMC和K562细胞按5∶1的比例共培养4 h,MTT实验检测细胞活性,计算UBMC的杀伤能力.结果 提取的外泌体表达CD9,CD63,CD81及CD44.不同供者来源hUC-MSC分泌的外泌体对UBMC的增殖、分泌细胞因子及K562细胞杀伤能力的作用不同.结论 不同供者hUC-MSC的外泌体免疫调节能力具有异质性.     

组蛋白乙酰转移酶GCN5对LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤的作用

目的 探讨组蛋白乙酰转移酶GCN5介导的组蛋白H3乙酰化对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞(A549细胞)增殖、凋亡及炎性因子表达的作用。方法 将A549细胞随机分为6组：对照组、LPS组、NC+LPS组、GCN5+LPS组、MB-3(GCN5抑制剂)+LPS组和GCN5+MB-3+LPS组。分别比较对照组、LPS组和GCN5+LPS组，以及LPS组、MB-3+LPS组和GCN5+MB-3+LPS组的组蛋白H3乙酰化水平、GCN5表达水平、细胞活性与增殖情况、细胞凋亡情况、炎性因子水平的差异。采用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测GCN5 mRNA表达水平；CCK-8试剂盒检测细胞活性；EdU实验检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞凋亡情况；Western blotting检测GCN5、H3K9ac、H3K14ac、H3K23ac、Caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平。结果 与对照组A549细胞比较，LPS组的H3K9ac、H3K14ac、H3K23ac...     

丁酸盐诱导人类珠蛋白基因表达的实验研究

目的 :研究丁酸盐对人类珠蛋白基因表达的影响。方法 :选用K5 6 2细胞为体外模型 ,采用联苯胺染色和RT -PCR技术 ,比较丁酸盐诱导前后联苯胺染色阳性率和 7种珠蛋白基因mRNA改变。结果 :丁酸盐诱导后联苯胺染色阳性细胞率 (BZ % )增加 3～ 6倍 ;Gγ -mRNA增加 2 .2 6± 0 .2 2倍 (P <0 .0 5 ) ,α、ζ、ε、δ、Aγ -mRNA均有增加但增加不显著 (P >0 .0 5 ) ;诱导前后K5 6 2细胞均未检测到 β -RNA。结论 :丁酸盐可诱导珠蛋白基因表达并选择性地刺激γ基因转录增加 ,尤其是Gγ ;丁酸盐具有与阳性对照羟基脲相似的诱导珠蛋白基因表达的作用