p27kip1的过表达对肾癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：研究外源性p27kip1基因对肾癌细胞周期、细胞凋亡及增殖的影响。方法：将含p27cDNA的质粒在脂质体介导下在体外转染肾癌GRC-1细胞．Western Blot、FCM及MTT检测分析外源性p27kip1蛋白在细胞内的表达．观察其对细胞周期、凋亡及细胞增殖的影响结果：体外转染GRC-1细胞48h后．p27蛋白在p27kip1转染后的GRC-1细胞中高表达。FCM检测表明．细胞停滞于G1期，实验组G1期细胞占66．9%．并出现亚G1凋亡峰：而空白对照组和转染空载体组G1期细胞分别为32.2%和33.8%。MTT法检测表明．转染p27cDNA后，实验组细胞增殖明显受抑。结论：p27kip1基因在体外转染GRC-1细胞并过表达p27kip1蛋白，抑制细胞由G1期向S期过渡．从而抑制细胞增殖．诱导细胞凋亡。     

人p27kip1重组腺病毒载体的构建及其介导的p27kip1表达

目的　研究外源性p2 7kip1基因对细胞周期及细胞增殖的影响。方法　构建CMV启动子转录调控的含人p2 7kip1cDNA的E1区替代的腺病毒载体pAxlcw .CIhp2 7kip1,与经EcoT2 2 1酶切的Ad5腺病毒DNA -末端肽复合物共转染 2 93细胞 ,制备p2 7kip1重组腺病毒 ,在体外转染HeLa细胞 ,Westernblot、FACS及MTT检测分析外源性p2 7kip1蛋白在细胞内的表达 ,以及对细胞周期及细胞增殖的影响。结果　获得含人p2 7kip1cDNA的重组腺病毒 ,滴度为 1.7× 10 9pfu/ml。体外转染HeLa细胞2 4h后 ,p2 7kip1蛋白在p2 7kip1转染后的HeLa细胞中高表达 ;FACS检测表明 ,p2 7kip1和LacZ重组腺病毒转染后的HeLa细胞 ,经 10 %血清刺激后处于G1期的细胞分别为 89.93%和 5 9.84% ;MTT法检测表明 ,人p2 7kip1重组腺病毒转染后的HeLa细胞经 2 0 %血清刺激后 ,48及 72h的A值均低于LacZ重组腺病毒转染后的HeLa细胞 (P <0 .0 1)。结论　本研究中所制备的p2 7kip1重组腺病毒能有效介导外源性p2 7kip1基因在体外转染HeLa细胞并高表达p2 7kip1,抑制细胞由G1期向S期过渡 ,从而抑制细胞增殖 ,为进一步研究p2 7kip1基因治疗奠定了基础。     

p27kip1高表达乳腺癌细胞株MCF-7基因表达谱的差异分析

目的:利用基因芯片技术筛选p27kip1转染乳腺癌MCF-7细胞的差异表达基因,探讨p27kip1调控肿瘤细胞增殖和细胞周期的分子机制。方法:将含p27cDNA的质粒在脂质体介导下体外转染乳腺癌MCF-7细胞,利用Affy-metrix公司的人类基因组基因芯片U133A分别检测表达p27kip1蛋白和空载体的乳腺癌细胞株的基因表达谱,用生物信息学软件进行比较分析,对差异表达基因进行功能分类。结果:在含22277个基因cDNA的芯片上差异表达的基因有1379条,其中表达谱发生明显变化(2倍以上)的基因173条,占总检测基因的0·78%。157条基因表达明显上升(SLR>1),占总检测基因的0·705%;16条基因表达明显下降(SLR<-1),占总检测基因的0·072%。基因表达差异主要集中在物质代谢、细胞增殖、细胞周期调控、细胞分化与凋亡、免疫反应、信号传导、蛋白转运、调节转录等方面。结论:多基因共同参与了p27kip1抑制肿瘤细胞过度增殖以及促进细胞凋亡的作用。对于p27kip1相关基因群的研究有助于认识p27kip1蛋白在细胞周期调控乃至整个细胞癌变过程中作用的分子机制。     

外源性SHIP基因对K562细胞周期及其相关蛋白表达的影响

目的:探讨SHIP基因对人白血病细胞系K562细胞周期的调控作用.方法:用携带野生型SHIP基因及绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein,GFP)基因的慢病毒及空载体慢病毒转染人白血病K562细胞.FCM检测转染效率、细胞凋亡率及细胞周期变化,实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RFQ-PCR)检测SHIP mRNA水平的变化,Western 印迹法检测SHIP、cyclin D1、p21WAF1/CIPI、p27KIP1蛋白表达水平的变化.结果:与转染空载体组和未转染组相比,转染野生型SHIP基因的K562细胞增殖减慢,凋亡率明显上升(P＜0.05);细胞周期显示,G0/G1期延长,G1期前出现亚二倍体的凋亡峰,S期和G2/M期比例降低;cyclin D1表达降低,p21WAF1/CIPI和p27KIP1表达增加.结论:转染野生型SHIP基因可使细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制白血病细胞增殖,促进白血病细胞凋亡.     

p27kip1cDNA对胃癌细胞端粒酶活性及细胞周期的影响

目的　观察p2 7基因表达对胃癌SGC790 1细胞端粒酶活性及细胞周期的影响。方法　采用腺病毒介导的方法将p2 7kip1cDNA导入胃癌SGC790 1细胞中 ,应用TRAP -ELISA法检测细胞端粒酶活性的变化 ,流式细胞仪分析细胞周期的变化。结果　转染了 p2 7kip1cDNA的细胞端粒酶活性显著下降 ,G1期细胞比率显著增高 ,细胞增殖指数显著降低。结论　外源性 p2 7基因的表达可使SGC790 1细胞生长停滞于G1期 ,端粒酶活性下降 ,Ad -p2 7kip1对治疗胃癌有潜在意义     

shRNA沉默PLCε基因表达对肾癌细胞增殖的抑制及作用机制

目的:探讨经短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默磷脂酶Cε(phospholipase C epsilon,PLCε)基因表达后对肾癌786-0细胞增殖的抑制及其作用机制.方法:脂质体介导重组质粒(pGenesil-PLCε)和空质粒(pGenesil-NP)转染786-0细胞48 h后,RT-PCR检测PLCε mRNA的表达;MTT法检测转染24、48和72 h后细胞增殖的抑制率;转染48 h后采用FCM方法分析细胞周期;RT-PCR和免疫细胞化学法分析转染48 h后p27和Ki67的表达情况.结果:转染重组质粒后可明显抑制PLCεmRNA的表达,其抑制率为69.7%;转染24、48和72 h后细胞增殖抑制率分别为21.2%,31.6%和32.7%;FCM结果显示转染重组质粒后细胞周期的分布发生了改变,G0/G1期细胞增多,S期和G2/M期细胞减少,细胞阻滞于G0/G1期,并出现了亚二倍体"凋亡峰".RT-PCR和免疫细胞化学结果均表明p27表达上调,而Ki67表达下调.结论:RNA干扰技术阻断PLCε基因表达后可抑制肾癌786-0细胞增殖,其作用机制可能是诱导p27表达上调和Ki67表达下调.     

p27KIP1过表达对人胃癌细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响

目的研究p27KIP1基因对胃癌细胞的细胞周期和细胞凋亡的潜在作用. 方法采用脂质体转染法将p27KIP1全长cDNA转入胃癌细胞系SCG7901中,通过Western Blot以及RNA斑点杂交检测p27KIP1基因在蛋白质和mRNA水平的表达;细胞活力实验和软琼脂集落形成实验显示转染p27KIP1基因对细胞增殖的作用;DNA电泳、流式细胞仪、TUNEL染色及透射电镜等方法观察目的基因对该细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响. 结果转染p27KIP1的SCG7901细胞在mRNA和蛋白质水平均有高水平p27KIP1的表达.细胞活力检测显示在外加Zn离子48h后细胞生长被抑制42%;软琼脂集落形成率明显少于亲代细胞(P<0.01);p27KIP1的过表达能够显著地增加G1期的细胞数,由33.68%增加到69.29%,P<0.01;在G1期前出现1个亚二倍体的凋亡峰,占14.68%,并且凋亡指数也显著增加(P<0.01).结论 p27KIP1基因能够诱导SCG7901细胞凋亡和细胞周期在G1期延长.因此,p27KIP1基因可能成为肿瘤基因治疗的靶基因.     

Axin基因的表达对神经胶质瘤细胞系C6生物学特性的影响

目的研究Axin基因对神经胶质瘤细胞C6生物学特性及相关蛋白的影响。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长曲线,应用流式细胞仪(FCM)测定细胞周期的变化,并用平板克隆形成实验对细胞克隆形成能力进行了检测。应用末端TdT酶标记技术(TUNEL)观察细胞凋亡及比率。采用免疫细胞化学染色法检测Ki67、CyclinD1、p53的表达。结果转染Axin基因使细胞周期在G1期阻滞;细胞增殖能力和细胞克隆形成能力均显著降低;细胞凋亡率增高;Ki67及CyclinD1低表达,p53高表达。结论转染Axin基因后胶质瘤细胞出现了一定的增殖抑制现象,诱导细胞凋亡,Axin基因可能通过上调p53基因表达和下调Cy-clinD1表达而抑制胶质瘤细胞的生长。     

外源性p27kipl对肺癌细胞系A549的影响

目的：研究外源性p27基因对肺癌细胞系A549的影响。方法，将p27基因重组入腺病毒表达载体pAdCMV中，得到重组腺病毒，感染人肺癌细胞系A549，用激光共聚焦，打点杂交方法检测p27基因在细胞感染前后的表达情况，应用MTT、流式细胞术、细胞软琼脂克隆形成等方法研究p27基因对A549细胞周期，形态、生长等特性的影响。结果：转染p27基因的A549细胞内确有外源性p27基因的表达，p27蛋白表达量明显提高，转染p27基因可使549细胞发生凋亡并发生G1期阻滞。结论：p27基因可诱导肺癌细胞出现凋亡及周期阻滞，为肺癌的基因治疗提供了一个新的思路。     

RNA结合蛋白QKI-5对肾癌细胞增殖和细胞周期的影响

目的:探讨RNA结合蛋白QKI-5在肾癌中的生物学功能。方法:应用以慢病毒为载体的过表达技术观察过表达QKI-5对肾癌细胞增殖作用的影响及对细胞周期的影响。结果:过表达QKI-5能够抑制肾癌细胞株786-O和A-498细胞的增殖能力、克隆形成能力；流式细胞术结果显示:过表达QKI-5使786-O和A-498细胞产生G1期阻滞，而这种阻滞与周期相关蛋白Cyclin D1表达降低及p21、p27表达增高有关。结论:QKI-5在肾癌中发挥着抑癌基因的功能，可以抑制肾癌细胞增殖，并使细胞周期阻滞在G1期。     

金雀异黄素对肾癌细胞GRC-1增殖及p27表达的影响

背景及目的:肾癌发病率在东西方国家间有较大差异,而东方国家人群中豆制品的消耗量较高可能是其肾癌发生率较低的原因之一。本实验拟研究大豆来源的酪氨酸蛋白激酶抑制剂金雀异黄素(genistein)对肾癌细胞系GRC-1细胞的增殖的影响,并初步探讨此种影响与抑癌基因p27的关系。方法:使用倒置显微镜、MTT法、流式细胞仪观察肾癌细胞系GRC-1细胞在受到金雀异黄素作用后其细胞增殖情况的变化;并用Westernblot法测量GRC-1细胞中P27蛋白表达水平的变化。结果:(1)经20μmol/L金雀异黄素处理的细胞变为梭形,伪足减少,核分裂相减少,细胞间连接减少;而经过40μmol/L金雀异黄素处理出现大量细胞碎片,细胞形态极度不规则,有丝分裂相少见,细胞间少有连接。(2)经20μmol/L金雀异黄素处理72h的细胞与对照组相比,其存活率为45.72%,其中有73.8%的细胞处在G1期,26.2%的细胞处在G2期;对照组为G1期31.6%,G2期3.8%。(3)经20μmol/L金雀异黄素处理72h的细胞裂解液中P27蛋白条带的灰度值为65.4±4.7,对照组为52.3±6.3。结论:金雀异黄素可显著抑制肾肿瘤细胞的增殖,使细胞周期阻滞于G1/M、G2/S期,其机理可能是通过提高肿瘤细胞中P27蛋白的表达水平实现的。     

槲皮素通过调控p21/cip1和p27/kip1蛋白的稳定性抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖

目的:探究槲皮素通过调控p21/cip1和p27/kip1蛋白的稳定性对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响。方法:CCK-8试剂盒检测口腔鳞状细胞癌细胞(SCC-15)增殖情况;流式细胞术检测SCC-15细胞周期分布;Western blot检测CyclinD1/CDK复合体、p21/cip1、p27/kip1、p-GSK3β、GSK3β、p53和c-Myc蛋白表达;qRT-PCR检测SCC-15细胞p21/cip1和p27/kip1 mRNA表达;激光共聚焦显微镜检测SCC-15细胞中p21/cip1和p27/kip1蛋白亚细胞定位;放线菌酮蛋白合成抑制实验检测SCC-15细胞中p21/cip1和p27/kip1蛋白半衰期。结果:与对照组相比,槲皮素呈剂量依赖性(6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L)抑制SCC-15细胞增殖(P<0.05),槲皮素在48 h对SCC-15细胞的IC 50为80.07μmol/L。与对照组相比,槲皮素(40μmol/L和80μmol/L)可显著升高SCC-15细胞中G 1/G 0期细胞比例,显著降低S期和G 2/M期细胞比例(P<0.05),呈剂量依赖性抑制CyclinD1/CDK复合体、p-GSK3β和c-Myc蛋白表达(P<0.05),促进p21/cip1和p27/kip1的mRNA和蛋白表达,促进GSK3β和p53的蛋白表达(P<0.05)。与对照组相比,槲皮素(80μmol/L)促进SCC-15细胞中p21/cip1蛋白由细胞质转移至细胞核(P<0.05),显著提高p21/cip1和p27/kip1蛋白生物半衰期(P<0.05),对p27/kip1蛋白的亚细胞定位无显著影响(P>0.05)。结论:槲皮素通过调控p21/cip1和p27/kip1蛋白的稳定性抑制口腔鳞状癌细胞增殖。     

Terbinafine inhibits oral squamous cell carcinoma growth through anti-cancer cell proliferation and anti-angiogenesis

Terbinafine (TB), an oral antifungal agent used in the treatment of superficial mycosis, has been reported to exert an anti‐tumor effect in various cancer cells. However, the effect of TB on oral cancer has not been evaluated. Herein we demonstrate that TB (0–60 µM) concentration‐dependently decreased cell number in cultured human oral squamous cell carcinoma (OSCC), KB cells. The anti‐proliferation effect of TB was also observed in two other OSCC cell lines, SAS and SCC 15. TB (60 µM) was not cytotoxic and its inhibition on KB cell growth was reversible. [³H]thymidine incorporation and flow cytometric analyses revealed that TB‐inhibited DNA synthesis and induced the G0/G1 cell‐cycle arrest. The TB‐induced cell‐cycle arrest occurred when the cyclin‐dependent kinase 2 activity was inhibited just as the protein levels of p21^cip1 and p27^kip1 were increased. The TB‐induced G0/G1 cell‐cycle arrest was completely blocked when the expressions of p21^cip1 and p27^kip1 were knocked‐down together. Taken together, these results suggest that the p21^cip1‐ and p27^kip1‐associated signaling pathways might be involved in the TB‐induced anti‐proliferation in KB cells. In vivo, TB (50 mg/kg, i.p.) significantly inhibited the KB tumor size. In these TB‐treated tumors, increases in the levels of p21^cip1 and p27^kip1 protein and decreases in the number of proliferating cell nuclear antigen‐positive cells and the microvessel density were observed. These findings demonstrate for the first time that TB might have potential to serve as a therapeutic tool in the treatment of oral cancer. Mol. Carcinog. © 2011 Wiley Periodicals, Inc.     

lncRNA SNHG1通过抑制p27kip1促进胃癌细胞的增殖作用

目的:确定长链非编码RNA SNHG1（lncRNA SNHG1）在胃癌中的表达，并探讨其在胃癌细胞增殖中的作用。方法:通过原位杂交及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测26例胃癌患者肿瘤组织及相应癌旁组织中SNHG1的表达。同时通过RT-qPCR检测正常胃上皮细胞及胃癌细胞系中SNHG1的表达情况。为评估SNHG1对胃癌细胞增殖能力的影响，向胃癌细胞系中转染shRNA或pcDNA调控SNHG1表达，并通过CCK-8法、流式细胞术及克隆形成实验检测细胞活力、细胞周期与细胞形成集落的能力。通过相关性分析、免疫组化、RT-qPCR及Western blot等方法检测了胃癌组织及细胞中p27kip1的表达，并进一步研究其与SNHG1的关系。结果:lncRNA SNHG1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，尤其是在肿瘤中晚期。SNHG1可明显促进胃癌细胞的增殖，缩短细胞周期，增强肿瘤细胞的集落形成能力。同时胃癌组织及细胞系中p27kip1与SNHG1存在相关性，上调SNHG1可以抑制胃癌细胞中p27kip1的表达，反之亦然。上调p27kip1可以拮抗SNHG1对胃癌细胞增殖能力的促进作用。结论:lncRNA SNHG1通过抑制p27kip1促进胃癌细胞增殖，表明SNHG1可能成为胃癌的潜在治疗靶点。     

Myc down-regulation induces apoptosis in M14 melanoma cells by increasing p27(kip1) levels.

In recent years, increasing evidence indicated the importance of a deregulated c-myc gene in the melanoma pathogenesis. We have previously demonstrated that treatment of melanoma cells with c-myc antisense oligodeoxynucleotides can inhibit cell proliferation and activate apoptosis. To gain insight into the mechanisms activated by Myc down-regulation, we have now developed an experimental model that allows modulating Myc protein expression in melanoma cells. This was achieved by originating stable melanoma cell clones expressing ecdysone-inducible c-myc antisense RNA. We show that the induction of c-myc antisense RNA in M14 melanoma cells leads to an inhibition of cell proliferation characterized by accumulation of cells in the G(1) phase of the cell cycle (up to 80%) and activation of apoptosis (50%). These data are associated with an increase of p27(kip1) levels and a significant reduction of the cdk2-associated kinase activity. In addition, we show that an ectopic overexpression of p27(kip1) in this experimental model can enhance the apoptotic rate. Our results indicate that down-regulation of Myc protein induces a G(1) arrest and activates apoptosis by increasing p27(kip1) content in melanoma cells, that are known to be defective for the p16-cyclinD/cdk4-pRb G(1) checkpoint. This is particularly relevant for identifying new therapeutic strategies based on the re-establishment of the apoptotic pathways in cancer cells.