小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗小鼠白细胞介素23p19(IL-23p19)多克隆抗体。方法利用分子克隆技术构建重组表达质粒p ET-16b-IL-23p19,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western blot法分析鉴定蛋白,镍柱亲和层析纯化制备蛋白;以此蛋白为免疫抗原免疫新西兰大白兔,获得抗血清,并利用亲和层析法纯化抗血清,制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体;采用ELISA检测抗体效价;Western blot法检测抗体特异性。结果重组表达载体p ET-16b-IL-23p19构建正确且IL-23p19蛋白能够在大肠杆菌BL21(DE3)中有效表达。通过多次IL-23p19蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体。ELISA检测确定新西兰大白兔血清效价达1∶256 000,Western blot法证实兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体能特异性识别小鼠IL-23p19蛋白。结论成功制备了兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体,抗体具有高的效价和较好的特异性。     

釉成熟蛋白Amelotin抗体的制备和初步鉴定

目的:表达并纯化小鼠釉成熟蛋白(Amelotin), 制备多克隆抗体, 并进行初步鉴定.方法:RT-PCR获得Amelotin成熟肽片段, 构建pET32a-Amelotin, IPTG诱导表达Amelotin, 纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, ELISA检测抗体滴度.Western blot和免疫组织化学鉴定抗体特异性.结果:成功构建了Amelotin重组表达载体pET32a-Amelotin,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔, 得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可以达到1:12 800.Western blot分析表明该抗体能特异结合Amelotin, 免疫组化分析表明自制的抗体能特异的与Amelotin相互作用.结论:以纯化的Amelotin为免疫原, 成功地制备了效价及特异性较高的兔抗Amelotin抗体,为进一步建立简便的Amelotin检测方法及研究Amelotin生物学功能奠定了良好的基础.     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

小鼠SKA1蛋白的多克隆抗体制备、鉴定与初步应用

目的:制备兔抗鼠SKA1(Spindle and Kinetochore Associated 1)多克隆抗体.方法:利用PCR的方法得到小鼠SKA1基因并克隆至pGEX-2T 原核表达载体中,转化入大肠杆菌BL21表达,经IPTG 诱导表达GST-SKA1融合蛋白,经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA测定抗鼠SKA1多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性.结果:构建了pGEX-2T-SKA1原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-SKA1融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体.ELISA测定表明SKA1多克隆抗体效价为1:25 600,Western blot分析表明SKA1多克隆抗体具有良好的特异性.通过免疫组织化学方法发现,SKA1表达于高分化前列腺癌细胞中.结论:成功地制备了效价及特异性良好的兔抗鼠SKA1多克隆抗体,为SKA1基因功能的研究奠定基础.     

肠道病毒71 VP1基因的原核表达及其抗血清的制备

目的克隆并表达重组肠道病毒71(EV71)VP1基因,进行抗血清的制备并检测抗血清效价。方法利用原核表达系统将PCR获得的VP1片段构建成原核表达载体pET32a(+)-VP1,诱导其表达VP1融合蛋白并利用包涵体纯化方法进行重组蛋白的纯化,将纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备VP1抗血清,ELISA检测抗体效价。同时构建真核表达载体,利用其在真核细胞中的瞬时表达检测抗血清的特异性。结果通过克隆获得VP1原核表达载体,IPTG诱导VP1蛋白表达并纯化,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达且纯化浓度较高,将重组蛋白乳化后免疫新西兰兔3次,取血检测抗血清的效价,ELISA结果显示抗体效价为1∶64 000,利用所构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP1表达VP1对抗血清进行检测,Western blot结果表明抗血清可较好的与VP1特异性结合。结论制备具有免疫原性的VP1蛋白及其效价较高的抗血清,为进一步研究抗EV71诊断方法、血清学诊断试剂盒及抗病毒疫苗的研制奠定基础。     

人IL-37在大肠杆菌表达及多克隆抗体的制备与鉴定北大核心CSCD

目的原核表达白细胞介素37(IL-37)及制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增IL-37b成熟肽编码区基因,克隆至表达载体pET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白IL-37为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗体,用ELISA、Western blot法和免疫组织化学染色检测抗体的效价和特异性。结果原核表达了重组蛋白IL-37b成熟肽,并获得高效价的小鼠抗IL-37抗体,能特异性识别天然的IL-37抗原。结论成功制备效价高、特异性好的小鼠抗IL-37抗体。     

人IL-37在大肠杆菌表达及多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达白细胞介素37(IL-37)及制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增IL-37b成熟肽编码区基因,克隆至表达载体pET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白IL-37为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗体,用ELISA、Western blot法和免疫组织化学染色检测抗体的效价和特异性。结果原核表达了重组蛋白IL-37b成熟肽,并获得高效价的小鼠抗IL-37抗体,能特异性识别天然的IL-37抗原。结论成功制备效价高、特异性好的小鼠抗IL-37抗体。     

HPV16型E6重组蛋白的表达及其兔多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E6原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法通过PCR法从Siha细胞株中获取HPV16 E6基因后克隆至pET21a(+)载体,构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;将重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至E.coli BL21(DE3)中,通过异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达HPV16 E6-His标签融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后通过Western blot法鉴定;将纯化的HPV16型E6重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体, ELISA检测免疫后血清多克隆抗体效价,并用Western blot法和免疫荧光技术分析HPV16 E6兔多克隆抗体的特异性。结果成功构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;在重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,经亲和层析法获得纯化的HPV16型E6重组蛋白,用于免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体,抗体效价为1∶40 000,并用Western blot法和免疫荧光技术确认了多克隆抗体的特异性。结论 HPV16 E6原核表达成功并制备了HPV16 E6兔多克隆抗体。     

H37Rv结核分枝杆菌蛋白脯氨酸-谷氨酸8(PE8)的表达及其兔多克隆抗体制备

目的克隆Rv1040c结核分枝杆菌脯氨酸-谷氨酸8(PE8)基因、构建pET28a-PE8重组载体和表达纯化PE8蛋白,制备抗PE8多克隆抗体。方法利用重组克隆技术,将PE8基因克隆至原核表达载体pET28a,测序鉴定后,转化至大肠杆菌BL21(DE3),用0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达、稀释复性与纯化。用纯化PE8蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot法进行效价及特异性鉴定。结果成功构建pET28a-PE8原核表达载体, ITPG诱导后PE8蛋白在大肠杆菌主要以包涵体的形式表达,复性后纯化PE8蛋白纯度达90%,纯化多克隆抗体效价为1∶430 080以上,能与PE8蛋白发生特异性反应。结论大肠杆菌表达的PE8重组蛋白免疫新西兰大白兔获得高效价的多克隆抗体。     

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。     

线粒体铁转运蛋白2(mitoferrin 2/SLC25A28)的原核表达及兔多克隆抗体制备

目的 构建人线粒体铁转运蛋白2(mitoferrin 2/SLC25A28)的原核表达质粒，进行蛋白表达和纯化，制备兔抗多克隆抗体并进行初步鉴定。方法 构建pET28a(+)-SLC25A28-His原核表达质粒，转化至BL21(DE3)大肠杆菌，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。提取蛋白包涵体，并用8 mol/L尿素溶解，His-NTA柱纯化。获得纯化SLC25A28蛋白免疫新西兰大白兔制备SLC25A28多克隆抗体，Western blot法鉴定SLC25A28抗体特异性。结果 成功构建pET28a(+)-SLC25A28-His原核表达载体质粒，并在BL21(DE3)大肠杆菌中成功诱导表达SLC25A28蛋白，蛋白纯度约为90%, Western blot法证明制备的抗体能特异性识别小鼠睾丸组织中的SLC25A28蛋白。结论 成功对人SLC25A28进行了原核表达，并制备了具有特异性的兔抗人SLC25A28多克隆抗体。     

含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)多克隆抗体的制备

目的原核表达并纯化小鼠源性含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)蛋白的C段(1109-1213),制备兔抗ADAMTS2多克隆抗体。方法以重组质粒p GEX-6p-1-ADAMTS2(1109-1213)转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过亲和纯化,并且经质谱鉴定;以表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ADAMTS2的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot法鉴定抗体特异性。结果在大肠杆菌中表达出目的蛋白ADAMTS2,纯化后经质谱鉴定并免疫新西兰大白兔,成功获得抗血清。血清效价达到1∶160 000以上,且具有良好的特异性。结论成功制备出效价高、特异性好的兔抗ADAMTS2抗体。     

兔抗重组人钙网蛋白抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备兔抗人钙网蛋白抗体并进行特性鉴定。方法:用PCR法扩增人钙网蛋白(CRT)基因,并克隆至pET32a表达载体中。以重组质粒pET32a/hCRT转化大肠杆菌BL-21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化目的蛋白。以纯化的hCRT为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗体,用ELISA法、Westernblot和免疫组化染色法检测抗体的效价和特异性。结果:成功地表达并纯化hCRT重组蛋白。以纯化的重组hCRT免疫新西兰大白兔制备的抗体,ELISA检测其效价为1∶51 200,Western blot分析显示,该抗体能与hCRT特异性结合。免疫组化染色法检测结果表明,该抗体能识别天然的hCRT。结论:以重组hCRT为免疫原,成功地制备效价高、特异性好的兔抗hCRT抗体,为进一步进行钙网蛋白的检测及其临床应用研究奠定了基础。     

兔抗人CD1d分子α3结构域抗体的制备与鉴定

目的: 制备兔抗人CD1d分子α3结构域(hCD1d-α3)多克隆抗体.方法: PCR法扩增出人hCD1d-α3编码区基因, 将其克隆入原核表达载体pET28中, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 用IPTG诱导重组蛋白的表达, 用Ni2 -NTA Agarose亲和层析法纯化重组蛋白, 以之为免疫原免疫家兔, 制备多克隆抗体, 并用ELISA、 Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果: 成功构建了hCD1d-α3原核表达载体pET28/hCD1d-α3, 高效表达并纯化hCD1d-α3蛋白, 间接ELISA检测所制备抗体的效价为1∶6 400, Western blot显示该抗体能与hCD1d特异结合, 免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人小肠组织中的天然hCD1d.结论: 通过制备重组hCD1d-α3蛋白为免疫原, 免疫家兔, 成功地制备了效价高、特异性好的抗hCD1d-α3多克隆抗体.     

人视黄醇结合蛋白原核蛋白表达和兔多克隆抗体的制备

目的制备兔抗人视黄醇结合蛋白(RBP)多克隆抗体。方法逆转录PCR扩增人RBP基因,将扩增产物连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-RBP,转化至大肠杆菌中。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,表达产物经SDS-PAGE分析鉴定出阳性克隆,扩大培养。用组蛋白标签(His-tag)纯化柱纯化重组蛋白。将纯化的重组蛋白皮下注射到新西兰白兔, 4次加强免疫得到抗血清。从抗血清中纯化出抗RBP多克隆抗体,并进行SDS-PAGE、 ELISA和Western blot法鉴定。结果成功构建了重组质粒pET-28a(+)-RBP,并获得高纯度的RBP重组蛋白, ELISA检测结果显示抗体效价达到1∶512 000。结论成功制备兔抗人RBP多克隆抗体。     

HIV-1蛋白酶基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的为了研究HIV-1蛋白酶的生物学活性,制备HIV-1 PR蛋白及其特异性抗体。方法用PCR方法扩增编码PR的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并表达HIV-1 PR蛋白,用His抗体为一抗做Western blot鉴定目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性。结果原核表达载体pET28 a(+)-PR成功构建,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到的PR蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论得到纯化的HIV-1PR蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白PR,为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

人Polycomb家族成员NSPc1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的 Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测。方法 应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a(+)载体中，在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His 标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔，获得兔抗人NSPc1多克隆抗体。用Western blot检测抗体免疫反应的特异性。结果 在大肠杆菌中表达并纯化了人NSPc1重组蛋白，纯度达95％，用其免疫新西兰大白兔，成功制备了相应兔源多克隆抗体，Western blot实验中该抗体可以特异识别内源及外源性NSPc1蛋白。结论 原核表达的NSPc1融合蛋白可以被纯化，并具有足够的蛋白免疫原性，所制备的相应多克隆抗体具有良好的特异性，可以运用于NSPc1基因的功能研究。     

11型HPV E7蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的构建人11型乳头瘤病毒(HPV 11)E7蛋白的原核表达载体,表达纯化后制备抗HPV11E7蛋白的多克隆抗体。方法构建pGEX-4T2-HPV11E7原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-HPV11E7,纯化获取11型HPVE7蛋白。将HPV11E7蛋白免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的多克隆抗体,用蛋白G琼脂糖纯化获得IgG型多克隆抗体。Western blot法及免疫荧光染色检测该抗体的效价及特异性。结果 SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导6 h后可表达出高水平可溶性GST-HPV11E7融合蛋白。纯化后免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的血清,纯化获得了IgG型多克隆抗体。Western blot及免疫荧光染色结果显示,兔抗HPV11E7 IgG具有效价高和特异性强的特点。结论成功表达了HPV11E7蛋白并制备了效价较高、特异性较好的IgG型兔抗HPV11E7蛋白多克隆抗体。     

小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备与鉴定

目的:克隆小鼠TIM-3基因,构建原核表达载体,制备相应的多克隆抗体并初步鉴定。方法:以小鼠脾细胞总RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增得到TIM-3基因编码区,构建pRSET-B-TIM-3原核表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;然后常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,用Western blot、免疫组化、流式细胞术检测抗体的特异性。结果:成功构建的原核表达载体pRSET-B-TIM-3在大肠杆菌中诱导后可以高效表达TIM-3蛋白;免疫获得的多克隆抗体经过ELISA检测,抗体效价为1∶320 000,经Western blot、免疫组化和流式细胞术等鉴定,抗体的特异性较好。结论:成功克隆出小鼠的TIM-3基因,构建了原核表达载体,制备的兔抗小鼠TIM-3多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。